基于聚丙烯酸交聯(lián)組裝單層SiO2納米粒粗糙表面及其細胞捕獲

魏同洪，劉 玲，丁海洋，陳小波，何歡歡，游思佳，謝洪平

(蘇州大學 藥學院，江蘇 蘇州 215123)

基于聚丙烯酸交聯(lián)組裝單層SiO2納米粒粗糙表面及其細胞捕獲

魏同洪，劉 玲，丁海洋，陳小波，何歡歡，游思佳，謝洪平*

(蘇州大學 藥學院，江蘇 蘇州 215123)

以玻片為載體(Subs)，聚丙烯酸(PAA)為交聯(lián)劑和柔性體，SiO2納米粒為剛性體，人B淋巴細胞瘤Ramos細胞為目標細胞，TD05適體為細胞捕獲配體(Apt)，在載體上交聯(lián)組裝了結(jié)構(gòu)為Subs-PAA1-SiO2-PAA2-Apt的細胞捕獲支架。該支架既有小尺度的剛性結(jié)構(gòu)，即SiO2納米粒，又有柔性結(jié)構(gòu)，即聚丙烯酸PAA1和PAA2。前者增加了載體的粗糙度，而后者不僅能夠固載多重捕獲配體，也能夠有效降低宏觀載體對細胞捕獲的空間位阻。結(jié)果表明，支架具有良好的納米粒結(jié)構(gòu)，未發(fā)現(xiàn)納米粒的融合甚至消失；支架的特異性捕獲是非特異性吸附的16倍，被捕獲細胞表現(xiàn)出較高的純度；同時，支架具有較高的捕獲效率，捕獲細胞數(shù)是通常的單層剛性納米粒支架的8.3倍。由此表明，該文構(gòu)建的結(jié)構(gòu)新穎的納米粒柔性支架實現(xiàn)了目標細胞的高效率、高純度捕獲，將為腫瘤細胞的分析檢測提供可靠的樣本。

支架；細胞；捕獲；納米粒；聚電解質(zhì)

由于循環(huán)腫瘤細胞(CTC)可以作為實體瘤早期檢測和診斷的可靠標記物，因此，稀有細胞CTC的捕獲成為分析檢測的關(guān)鍵問題[1-4]。陽性富集和陰性分選均是將待測樣本與固載了特異性捕獲配體的載體(如磁珠)經(jīng)混合、振蕩和分離，從而獲得干擾細胞明顯減少的、富集的CTC檢測樣本。由于CTC的含量極低，而干擾細胞的含量極高，捕獲常出現(xiàn)假陰性。其原因關(guān)鍵在于CTC捕獲效率低。當前主要采用微流控芯片、提高載體基質(zhì)粗糙度和CTC多價鍵合3類技術(shù)以提高捕獲效率[1-3,5-14]。其中，提高載體基質(zhì)粗糙度是主要手段，即在宏觀載體上構(gòu)建一個小尺度的支架，以減小宏觀載體對被固定于支架上的捕獲配體捕獲CTC時的空間位阻。主要技術(shù)手段包括化學腐蝕、光刻蝕、納米粒的化學沉積和電沉積[2,5,7-8,13-14]。事實上，在提高粗糙度的同時，空間位阻并未明顯減小，通常提高特異性捕獲效率的同時，支架的非特異性吸附也明顯增強。主要原因在于，構(gòu)建的支架為大尺度的微米級支架或者納米粒結(jié)構(gòu)消失的納米粒沉積支架[6,13-14]。本文以玻片為載體，以極大分子量的聚丙烯酸(PAA)為交聯(lián)劑組裝SiO2納米粒，并在納米粒上進一步修飾PAA，以此固定多重配體，構(gòu)建了結(jié)構(gòu)新穎的納米粒支架，實現(xiàn)了對人B淋巴細胞瘤Ramos細胞的特異、高效捕獲。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

聚丙烯酸(PAA，25%，Mw=240 000)購于阿拉丁試劑(上海)有限公司。TD05適配體(序列為5′-CAC CGG GAG GAT AGT TCG GTG GCT GTT CAG GGT CTC CTC CCG GTG TTT TT AAG GAG CAG CGT GGA GGA TA-NH2-3′)[15]購于生物工程(上海)股份有限公司。Ramos細胞購于中美合資博慧斯生物醫(yī)藥科技有限公司。其它試劑均為分析純，實驗用水為自制三蒸去離子水。NICOMPTM380ZLS Zeta電位及粒度分析儀(美國PSS公司)、S-4700冷場發(fā)射掃描電鏡(SEM，日本日立公司)、Dimension Icon原子力顯微鏡(AFM，美國Bruker公司)、LS 55熒光顯微鏡(美國PerkinElmer公司)。

1.2 納米粒支架制備

由于SiO2納米粒具有良好的生物相容性和親水性，本文以其為固載于載體上的納米粒。按文獻[16]制備并將該納米粒表面氨基硅烷化(其中氨基硅烷化納米粒的濃度為2.2 mg/mL)。

硅烷化載體基片的制備：將30%雙氧水與98%硫酸按體積比3∶7混合制成洗液。將載玻片裁成25.4×19 mm2大小的玻片作為載體基質(zhì)。用水和無水乙醇分別洗滌，吹干，放入洗液，80～100 ℃下加熱1 h，取出并自然冷卻。用水沖洗，冷風吹干。置于2% 3-氨丙基三乙氧基硅烷的無水乙醇溶液中反應(yīng)18 h，取出，用水沖洗，120 ℃烘6 h，即得氨基硅烷化的載體基片(Subs-NH2)。

PAA羧基的活化：取100 μL 25%的PAA于10 mL單頸瓶中，加入5 mL水，搖勻，加入2 mL 0.8 mg/mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)和2 mL 2.2 mg/mL N-羥基硫代琥珀酰亞胺(sulfo-NHS)，搖勻，37 ℃水浴活化60 min，用水稀釋至50 mL，PAA羧基被部分活化，即得PAA-NHS溶液(0.5 mg/mL)。

載體上納米粒支架的制備：將氨基硅烷化的載體基片置于5 mL PAA-NHS溶液，37 ℃下反應(yīng)1 h，取出基片，收集反應(yīng)液。用水洗滌基片2次，N2吹干，置于5 mL表面硅烷化的SiO2納米粒溶液中37 ℃反應(yīng)3 h，取出基片，收集反應(yīng)液。用水洗滌基片2次，N2吹干，置于5 mL PAA-NHS溶液中37 ℃反應(yīng)1 h，取出基片，收集反應(yīng)液。用水洗滌基片2次，N2吹干，即得Subs-PAA1-SiO2-PAA2結(jié)構(gòu)的基片。

1.3 捕獲適體的連接與細胞捕獲

在納米粒支架上層(PAA2)的PAA眾多活化羧基中，部分與已固載納米粒的表面氨基反應(yīng)，以實現(xiàn)PAA2的固載，而剩余的活化羧基將用于固載氨基化的細胞捕獲適體TD05。將基片Subs-PAA1-SiO2-PAA2置于13 mL TD05適配體溶液(5.0×104μmol/L，用PBS緩沖液配制)，37 ℃振蕩反應(yīng)1 h。取出基片，用水沖洗2次，置于3 mL 0.1 mol/mL甘氨酸的PBS溶液中，以封閉PAA2上剩余的活化羧基，防止活化羧基對細胞膜蛋白的非特異性反應(yīng)?；肗2吹干，即得固載適體的納米粒捕獲支架。該支架具有Subs-PAA1-SiO2-PAA2-Apt結(jié)構(gòu)，作為實驗組備用。除了TD05適配體未被使用以外，其它所有過程均平行實驗，即得未連接適體的納米粒捕獲支架，作為對照組備用。

TD05適配體的靶細胞為Ramos，細胞用橙紅色的DiI染料染色，并將細胞重懸于6 mL PBS配制的結(jié)合緩沖液中，細胞密度為1.0×106個/mL。將六孔板置于固載納米粒支架的基片上，每個孔加1 mL細胞懸液，放置培養(yǎng)箱中37 ℃孵育1.5～2 h，每30 min輕輕振搖1次，結(jié)束后用37 ℃的洗滌緩沖液(PBS配制)洗滌2次，干燥后置于熒光顯微鏡下成像，并計數(shù)，整個過程避光操作。

圖1 捕獲支架的SEM(A)和AFM(B)表征Fig.1 SEM(A) and AFM(B) images of capture scaffold

圖2 構(gòu)建的支架特異性捕獲(A)和非特異性吸附(B)目標細胞的熒光成像及其細胞計數(shù)(C)Fig.2 Fluorescent imagings of the objective cells specially captured(A) and non-specially adsorbed(B)by the built scaffolds and their cell counts(C)

圖3 柔性(FOLS，A)與剛性(GOLS，B)支架捕獲細胞的熒光成像及其細胞計數(shù)(C)Fig.3 Fluorescent imagings of the objective cells captured by the flexible(A) and rigid(B) scaffolds,and their cell counts(C)

2 結(jié)果與討論

2.1 SEM與AFM表征

本文利用掃描電鏡(SEM)表征了捕獲支架中納米粒的形貌、粒徑以及固載基片表面形態(tài)，同時利用原子力顯微鏡(AFM)表征了其納米粒結(jié)構(gòu)特征與聚積狀態(tài)(圖1)。由圖可見，基片上SiO2納米粒子形態(tài)均勻，粒徑約為100 nm(圖1A)，基片表面出現(xiàn)了預處理所產(chǎn)生的紋路。被PAA交聯(lián)固載的納米粒形成了單層的納米粒結(jié)構(gòu)，并未出現(xiàn)無序的多層堆積(圖1B)。同時，粒子表面出現(xiàn)了大量波紋狀的包覆層(圖1B黑色圈標注)，可能是被固載在納米粒上的聚電解質(zhì)PAA的殘余大分子鏈在表征時為非溶液狀態(tài)，從而沉積在粒子表面，即Subs-PAA1-SiO2-PAA2結(jié)構(gòu)中的PAA2。

2.2 特異性捕獲與非特異性吸附

當基片的納米粒支架上固載特異性識別適體TD05后，即可實現(xiàn)對靶細胞Ramos的特異性捕獲(圖2)。由圖可見，以未固定捕獲適體的支架(圖2B)為對照，在支架上的TD05適體表現(xiàn)出高的捕獲效率(圖2A)，且為對照的16倍(圖2C)；非特異性吸附捕獲僅占特異性捕獲的6.19%，表現(xiàn)出極低的非特異性吸附。同時也表明本文構(gòu)建支架捕獲的目標細胞具有較高的純度。粗糙表面往往存在明顯的非特異性吸附[6-7]，而該捕獲支架表現(xiàn)出的良好性能主要在于其支架的特殊結(jié)構(gòu)。在支架的Subs-PAA1-SiO2-PAA2-Apt結(jié)構(gòu)中，SiO2納米粒是通過聚電解質(zhì)PAA1的大量羧基而固載于基片上，捕獲適體Apt是利用聚電解質(zhì)PAA2上的大量羧基而固載，即PAA2上一部分羧基與SiO2納米粒連接，一部分羧基與適體Apt連接，保證了支架結(jié)構(gòu)中PAA1、PAA2和SiO2納米粒上均存在極其豐富的負電荷，從而可阻止對表面負電荷的目標細胞的非特異性吸附。因此，即使粗糙度增加仍然表現(xiàn)出極低的非特異性吸附。

2.3 支架的柔性與高效細胞捕獲

對于固載于基片上的支架Subs-PAA1-SiO2-PAA2-Apt，剛性的SiO2納米?？稍黾踊植诙?，進而提高細胞捕獲效率；同時支架中的聚電解質(zhì)大分子PAA1和PAA2表現(xiàn)出一定的柔性，可能會降低支架剛性結(jié)構(gòu)的空間位阻，具有增加捕獲效率的潛能，因此構(gòu)建了一個SiO2納米粒的剛性支架作為對照。以環(huán)氧基硅烷化試劑KH570對SiO2納米粒子進行處理后得到環(huán)氧化的納米粒，無需PAA進行交聯(lián)，而直接利用環(huán)氧基與氨基的反應(yīng)將環(huán)氧化的納米粒直接固載于氨基化的基片上，再利用納米粒上剩余的環(huán)氧基直接固載氨基化的TD05適體，即得Subs-SiO2-Apt結(jié)構(gòu)的支架。柔性與剛性支架對目標細胞的捕獲見圖3，從圖3可以發(fā)現(xiàn)，構(gòu)建的具有柔性結(jié)構(gòu)的支架Subs-PAA1-SiO2-PAA2-Apt相對于剛性支架Subs-SiO2-Apt表現(xiàn)出更高的捕獲效率，前者(圖3A)捕獲的細胞遠多于后者(圖3B)，且前者的捕獲細胞數(shù)為后者的8.3倍(圖3C)。由此表明，在均為一層納米粒的相同粗糙度的情況下，Subs-PAA1-SiO2-PAA2-Apt中的柔性結(jié)構(gòu)PAA1和PAA2對于提高捕獲效率具有較大的貢獻，其原因是柔性結(jié)構(gòu)能夠明顯降低支架剛性結(jié)構(gòu)的空間位阻。

3 結(jié) 論

本文以玻片為載體、PAA為交聯(lián)劑、氨基化SiO2納米粒為剛性體，在載體上交聯(lián)組裝了用于細胞捕獲的支架，并在支架上固定TD05適體，實現(xiàn)了目標細胞Ramos的捕獲。該捕獲支架具有Subs-PAA1-SiO2-PAA2-Apt結(jié)構(gòu)：既有增加載體粗糙度的剛性結(jié)構(gòu)(即SiO2納米粒)，又有柔性結(jié)構(gòu)(即PAA1和PAA2)，有效地降低了宏觀載體對細胞捕獲的空間位阻。支架表現(xiàn)出特異性高捕獲和非特異性低吸附，前者的捕獲率為后者的16倍，且非特異性吸附僅占特異性捕獲的6.19%，捕獲細胞表現(xiàn)出較高的純度；相對于常用的剛性支架Subs-SiO2-Apt，本文的柔性支架捕獲細胞數(shù)為剛性支架的8.3倍。由此表明，本文構(gòu)建了一個結(jié)構(gòu)新穎的納米粒柔性支架，可實現(xiàn)目標細胞的高效率、高純度捕獲，從而為CTC的分析檢測提供了可靠的樣本。

[1] Zhang F L,Jiang Y,Liu X L,Meng J X,Zhang P C,Liu H L,Yang G,Li G N,Jiang L,Wan L J,Hu J S,Wang S T.NanoLett.，2016,16:766-772.

[2] Shi L,Wang K,Yang Y.ColloidsSurf.B，2016,147:291-299.

[3] Pua K F,Lia C L,Zhang N P,Wang H,Shen W J,Zhua Y M.Biosens.Bioelectron.，2017,89:927-931.

[4] Tan W H,Donovan M J,Jiang J H.Chem.Rev.，2013,113:2842-2862.

[5] Wang S T,Wang H,Jiao J,Chen K J,Owens G E,Kamei K I,Sun J,Sherman D J,Behrenbruch C P,Wu H,Tseng H R.Angew.Chem.Int.Ed.，2009,48:8970-8973.

[6] Zhang P M,Gao M X,Zhang X M.Talanta，2016,153:366-371.

[7] Sun N,Li X P,Wang Z L,Zhang R H,Wang J,Wang K W,Pei R J.ACSAppl.Mater.Interfaces，2016,8:12638-12643.

[8] Sheng W A,Chen T,Kamath R,Xiong X L,Tan W H,Fan Z H.Anal.Chem.,2012,84:4199-4206.

[9] Sheng W A,Chen T,Tan W H,Fan Z H.ACSNano,2013,7:7067-7076.

[10] Myung J H,Gajjar K A,Saric J,Eddington D T,Hong H.Angew.Chem.Int.Ed.，2011,50:11769-11772.

[11] Huang Y F,Chang H T,Tan W.Anal.Chem.,2008,80:567-572.

[12] Lin R Z,Hatch A,Antontsev V G,Murthy S K,Melero-Martin J M.TissueEng.C,2015,21:274-283.

[13] Wang Y Y,Zhou F,Liu X L,Yuan L,Li D,Wang Y W,Chen H.ACSAppl.Mater.Int.,2013,5:3816-3823.

[14] Zhou F,Li D,Wu Z,Song B,Yuan L,Chen H.Macromol.Biosci.，2012,12:1391-1400.

[15] Tang Z W,Shangguan D H,Wang K M,Shi H,Sefah K,Mallikratchy P,Chen H W,Li Y,Tan W H.Anal.Chem.，2007,79:4900-4907.[16] Ge Z L,Song T M,Chen Z,Guo W R,Xie H P,Xie L.Anal.Chim.Acta,2015,862:24-32.

Rough Surface of One-layer SiO2Nanoparticles Assembled by Polyacrylic Acid Cross-linking and Its Cell Capture

WEI Tong-hong,LIU Ling,DING Hai-yang,CHEN Xiao-bo,HE Huan-huan,YOU Si-jia,XIE Hong-ping*

(College of Pharmaceutical Sciences,Soochow University,Suzhou 215123,China)

A cell capture scaffold with a structure of Subs-PAA1-SiO2-PAA2-Apt was assembled by using a glass slide as substrate carrier(Subs),polyelectrolyte polyacrylic acid(PAA) as cross-linking agent and flexible body,SiO2nanoparticles as rigid body,and TD05 aptamer(Apt) as capture ligand of objective cell Ramos.Here there are a small scale and rigid structure(i.e.SiO2nanoparticle),but also a flexible structure(i.e.polyacrylic acid PAA1 and PAA2).The former increased the roughness of carrier,and the latter could not only immobilized the multi-ligand Apt,but also decreased the steric hindrance from the scaffold itself and the carrier for cell capture.The results indicated that the as-assembled scaffold had a good nanoparticle structure and fusing even disappearing of the nanoparticle structure was not found.For the scaffold,its specific capture was 16 times of the non-specific adsorption,and the captured cell showed a higher purity.Meanwhile the captured cell has also a higher captureefficiency,and the capture cell number was 8.3 times of that of the usual rigid scaffold with one-layer nanoparticle.It was shown that the nanoparticle flexible scaffold with a novel structure was fabricated,which could realize the high purity and the high efficiency for cell capture.

scaffold；cell；capture；nanoparticle；polyelectrolyte

2017-03-09；

2017-04-07

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.08.017

O766.1;O652.6

A

1004-4957(2017)08-1043-04

*通訊作者：謝洪平，博士，教授，研究方向：藥物與生物分析，Tel：0512-65883022，E-mail:hpxie@suda.edu.cn