改良的QuEChERS與HPLC-HESI/MS/MS同時(shí)測(cè)定中華鱉組織中氯硝柳胺和酰胺醇類藥物及其代謝物的殘留量

劉永濤,董 靖,楊秋紅,余琳雪,楊移斌,何 力,艾曉輝*

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所,湖北 武漢 430223；2.淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心,湖北 武漢 430070；3.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院,上海 201306)

改良的QuEChERS與HPLC-HESI/MS/MS同時(shí)測(cè)定中華鱉組織中氯硝柳胺和酰胺醇類藥物及其代謝物的殘留量

劉永濤1,2,董 靖1,2,楊秋紅1,2,余琳雪3,楊移斌1,2,何 力1,艾曉輝1,2*

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所,湖北 武漢 430223；2.淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心,湖北 武漢 430070；3.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院,上海 201306)

建立了中華鱉(Trionyxsinensis)組織(血漿、肌肉、裙邊、肝臟和腎臟)中氯硝柳胺、氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺同時(shí)測(cè)定的高效液相色譜-加熱電噴霧電離源串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-HESI/MS/MS)。樣品經(jīng)改進(jìn)的QuEChERS方法提取凈化,以氨化乙腈為提取劑,十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)粉為凈化劑,甲醇-水為流動(dòng)相,流速為0.3 mL/min,以Waters Symmetry?C18(2.1 mm×100 mm,3.5 μm)為色譜分離柱,采用正負(fù)離子分段掃描和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)檢測(cè)。氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺采用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量,氯硝柳胺采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法定量。結(jié)果表明,在0.3～100 μg/L范圍內(nèi),5種待測(cè)物均呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(r2)均不小于0.998 7。在1～20 μg/kg加標(biāo)水平下,中華鱉空白血漿、肌肉、裙邊、肝臟和腎臟的加標(biāo)回收率為77.9%～105.3%(n=6),相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.7%～10.5%(n=6),方法的檢出限分別為0.5、0.1、0.5、0.5、0.5 μg/kg,定量下限分別為1.0、0.3、1.0、1.0、1.0 μg/kg。該方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏度高,適用于中華鱉組織中氯硝柳胺、氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺殘留量的同時(shí)測(cè)定。

中華鱉；氯硝柳胺；酰胺醇類；改良的QuEChERS；高效液相色譜-加熱電噴霧電離源串聯(lián)質(zhì)譜

中華鱉(Trionyxsinensis),俗稱甲魚、團(tuán)魚,含高蛋白(高達(dá)43%)、低脂肪(僅為1.29%),維生素和礦物質(zhì)的含量也較高,是深受人們喜愛的高檔水產(chǎn)品[1]。近年來,隨著消費(fèi)需求量的增加,中華鱉的養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大,養(yǎng)殖過程中發(fā)病也日趨增多,為了防治中華鱉的疾病,藥物被大量使用,且濫用藥物的情況時(shí)有發(fā)生。藥物的不合理使用不僅會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染,還會(huì)殘留在動(dòng)物源性食品中進(jìn)而對(duì)人體健康產(chǎn)生危害。酰胺醇類藥物包括氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考,氯霉素由于對(duì)人體的副作用如骨髓抑制和致癌性[2]而被中國、加拿大、美國、歐盟等國家和地區(qū)禁用[3],歐盟規(guī)定其在水產(chǎn)品中的最高殘留限量(MRL)為0.3 μg/kg[4]。甲砜霉素、氟苯尼考在我國被批準(zhǔn)用于水產(chǎn)動(dòng)物疾病防治,氯硝柳胺在我國作為清塘劑用于殺滅養(yǎng)殖池塘內(nèi)釘螺、椎實(shí)螺和野雜魚[5]。歐盟規(guī)定甲砜霉素和氟苯尼考(以氟苯尼考胺為殘留標(biāo)示物)在有鰭魚自然比例的皮膚和肌肉中的最高殘留限量(MRL)分別為50 μg/kg和1 000 μg/kg[6],我國對(duì)魚肌肉+皮中甲砜霉素和氟苯尼考的最高殘留限量規(guī)定與歐盟相同[7]。目前,國內(nèi)外尚未制定水產(chǎn)品中氯硝柳胺的殘留限量標(biāo)準(zhǔn),但由于其對(duì)魚類高毒,且能引起DNA損傷[8],已引起人們的廣泛關(guān)注。為保障中華鱉等水產(chǎn)品的食用安全,有必要建立一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確和高靈敏度的同時(shí)測(cè)定中華鱉組織中氯硝柳胺和酰胺醇類抗生素及其代謝物殘留量的方法。

目前尚未見水產(chǎn)品中氯硝柳胺和酰胺醇類抗生素及其代謝物同時(shí)測(cè)定的分析方法報(bào)道,更未見中華鱉組織中相關(guān)研究的報(bào)道。已有文獻(xiàn)關(guān)于水產(chǎn)品中酰胺醇類抗生素測(cè)定的方法主要有高效液相色譜法[9]、氣相色譜法[10-11]、氣相色譜-質(zhì)譜法[12]和液相色譜-質(zhì)譜法[13-15],而水產(chǎn)品中氯硝柳胺殘留量分析方法的報(bào)道相對(duì)較少[8，16-17],且大多采用傳統(tǒng)的提取和凈化技術(shù),耗時(shí)且步驟復(fù)雜,另外還需大體積的提取溶劑。QuEChERS方法(快速、簡(jiǎn)單、便宜、有效、耐用和安全)[18]已被廣泛用于食品安全領(lǐng)域,該方法樣品制備過程簡(jiǎn)單、有效[3]?；赒uEChERS樣品前處理方法,本文建立了中華鱉組織中氯硝柳胺、氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺同時(shí)測(cè)定的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

TSQ Quantum Access Max液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Thermo Fisher Scientific公司)；Hitachi 20PR-520型自動(dòng)高速冷凍離心機(jī)(日本日立公司)；Mettler-Toledo AE-240電子天平(梅特勒-托利多公司)；FS-1高速勻漿機(jī)(華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司)；HQ-60-Ⅱ旋渦混合器(北京北方同正生物技術(shù)發(fā)展有限公司)；HGC-12氮吹儀(HENGAO T&D公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品：氯硝柳胺(純度≥96%)、氯霉素(純度≥98.6%)、甲砜霉素(純度≥98.5%)、氟苯尼考(純度≥99%)均購自德國Dr.Ehrenstorfer GmbH,氟苯尼考胺(純度≥98%)、氘代氯霉素(d5-氯霉素)(純度≥99%)、氘代甲砜霉素(d3-甲砜霉素,純度≥98%)、氘代氟苯尼考(d3-氟苯尼考,純度≥98%)均購自加拿大TRC公司；十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18,40～60 μm,天津博納艾杰爾科技有限公司),乙二胺-N-丙基硅烷(PSA,40～60 μm,天津博納艾杰爾科技有限公司),多壁碳納米管(MWCNTs)(純度>95%,外徑8～15 nm,長(zhǎng)度<50 μm,北京博宇高科新材料技術(shù)有限公司)；乙腈、甲醇、質(zhì)譜水(色譜純,美國J.T.Baker公司),氨水、無水硫酸鈉、氯化鈉(分析純,上海國藥集團(tuán)試劑有限公司)；氨化乙腈提取液的配制：1 000 mL乙腈中添加2 mL氨水,混勻即配制成0.2%的氨水乙腈提取液。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液及混合標(biāo)準(zhǔn)中間液的配制

分別準(zhǔn)確稱取適量氯硝柳胺、氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇分別溶解并定容,配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于-20 ℃冰箱中保存。分別移取1 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100 mL容量瓶中,用30%(體積分?jǐn)?shù))乙腈水溶液稀釋成1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。分別準(zhǔn)確稱取適量d5-氯霉素、d3-甲砜霉素和d3-氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇分別溶解并定容成10 mg/L內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液；分別移取1 mL內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液至100 mL容量瓶中用30%乙腈水溶液(體積比)稀釋至100 mL,配制成100 μg/L混合內(nèi)標(biāo)中間液。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線及氯硝柳胺空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用30%乙腈水溶液稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)中間液,得到含氯硝柳胺、氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺的質(zhì)量濃度分別為0.3、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L,且含d5-氯霉素、d3-甲砜霉素和d3-氟苯尼考質(zhì)量濃度均為2 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,上HPLC-HESI/MS/MS分析,繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,計(jì)算回歸方程與相關(guān)系數(shù)。

采用“1.4”方法制備中華鱉血漿、肌肉、裙邊、肝臟和腎臟空白組織樣品溶液,用空白組織樣品溶液稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)中間液,制備氯硝柳胺質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L的空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液,上HPLC-HESI/MS/MS分析,繪制空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,計(jì)算回歸方程與相關(guān)系數(shù)。

1.4 樣品前處理

1.4.1 中華鱉血漿樣品 移取1 mL血漿樣品于10 mL離心管中,加入40 μL 100 μg/L的內(nèi)標(biāo)混合溶液,再加入4 mL氨化乙腈提取液,渦旋30 s后,加入2 g無水硫酸鈉和0.5 g氯化鈉,渦旋振蕩1 min,7 000 r/min離心5 min,轉(zhuǎn)移提取液至新的15 mL帶刻度離心管中,殘?jiān)貜?fù)提取1次,合并提取液至同一15 mL離心管中,并用乙腈定容至10 mL,再加入300 mg C18粉,渦旋振蕩30 s,7 000 r/min離心5 min,準(zhǔn)確移取5 mL提取液至另一10 mL離心管中,于50 ℃氮吹至干,用1 mL 30%乙腈水溶液溶解殘?jiān)?渦旋振蕩30 s,10 000 r/min,離心5 min,取離心后的液體過0.22 μm濾頭,上HPLC-HESI/MS/MS分析。

1.4.2 中華鱉肌肉與裙邊樣品 稱取2 g 肌肉或裙邊樣品于15 mL離心管中,加入40 μL 100 μg/L的內(nèi)標(biāo)混合溶液,加入7 mL氨化乙腈提取液,渦旋振蕩30 s,再加入4 g 無水硫酸鈉和1 g氯化鈉,渦旋振蕩1 min,7 000 r/min離心5 min,轉(zhuǎn)移提取液至另一15 mL離心管中,重復(fù)提取1次,合并提取液,并用乙腈定容至15 mL,再加入300 mg C18粉,渦旋振蕩30 s,7 000 r/min離心5 min,準(zhǔn)確移取7.5 mL提取液至10 mL離心管中,于50 ℃氮吹至干,用1 mL 30%乙腈水溶液溶解殘?jiān)?渦旋振蕩30 s,10 000 r/min離心5 min,取離心后的液體過0.22 μm濾頭,上HPLC-HESI/MS/MS分析。

1.4.3 中華鱉肝臟與腎臟樣品 稱取1 g 肝臟或腎臟樣品,置于10 mL離心管中,加入40 μL 100 μg/L的內(nèi)標(biāo)混合溶液,再加入5 mL氨化乙腈提取液,渦旋振蕩30 s,再加入2 g無水硫酸鈉和0.5 g氯化鈉,渦旋振蕩1 min,7 000 r/min離心5 min,將提取液轉(zhuǎn)移至另一10 mL離心管中,重復(fù)提取1次,合并提取液,并用乙腈定容至10 mL,再加入300 mg C18粉,渦旋振蕩30 s,7 000 r/min離心5 min,準(zhǔn)確移取5 mL提取液于10 mL離心管中,于50 ℃氮吹至干,用1 mL 30%乙腈水溶液溶解殘?jiān)?渦旋振蕩30 s,10 000 r/min離心5 min,取離心后的液體過0.22 μm濾頭,上HPLC-HESI/MS/MS分析。

1.5 色譜-質(zhì)譜分析條件

色譜柱：Waters Symmetry?C18(2.1 mm×100 mm,3.5 μm)；柱溫：35 ℃,流速：0.3 mL/min；流動(dòng)相：A為甲醇,B為水；梯度洗脫條件：初始條件20% A；0～3.0 min,20%～90% A；3.0～5.8 min,90% A；5.8～5.9 min,90%～20% A；5.9～7.0 min,20% A；進(jìn)樣量10 μL。

離子化模式：加熱大氣壓電噴霧離子源(HESI),正離子、負(fù)離子分段(Segment)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)進(jìn)行檢測(cè),Segment 1：0～1.2 min,正離子掃描,Segment 2：1.2～5.0 min,負(fù)離子掃描；Segment 3：5.0～7.0 min,負(fù)離子掃描。正離子模式噴霧電壓：3 500 V,負(fù)離子模式噴霧電壓：-3 000 V,源內(nèi)解離電壓 0 V,蒸發(fā)氣溫度：300 ℃,鞘氣壓力40 arb,輔助氣壓力10 arb,碰撞氣及壓力：氬氣,1.5 mTorr,離子傳輸毛細(xì)管溫度：350 ℃,Q1 PW 0.4,Q3 PW 0.7。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 分別將10 mg/L的氯硝柳胺、氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、d5-氯霉素、d3-甲砜霉素、d3-氟苯尼考和氟苯尼考胺標(biāo)準(zhǔn)溶液通過注射器注入質(zhì)譜儀,對(duì)其母離子進(jìn)行掃描,發(fā)現(xiàn)氯硝柳胺、氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、d5-氯霉素、d3-甲砜霉素和d3-氟苯尼考在負(fù)離子模式下產(chǎn)生更多的[M-H]-分子離子,這與該類藥物均含有高電負(fù)性的鹵素原子和羥基基團(tuán)有關(guān)[18],母離子的m/z分別為324.9、320.9、354.0、355.9、325.9、357.0和358.7,而氟苯尼考胺則在正離子模式下產(chǎn)生大量的[M+H]+分子離子,其母離子的m/z為248.0,因此,氯硝柳胺、氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、d5-氯霉素、d3-甲砜霉素和d3-氟苯尼考適合在負(fù)離子模式下進(jìn)行分析,而氟苯尼考胺則適合在正離子模式下進(jìn)行分析。在待測(cè)物適宜的離子模式下,以子離子掃描方式進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析,分別找出其定量和定性子離子以及對(duì)應(yīng)的碰撞能量,結(jié)果見表1。HESI與ESI相比,采用設(shè)定蒸發(fā)氣的溫度來提高輔助氣的溫度,起到了加熱的作用,因而離子化效率和重現(xiàn)性比ESI源好,且靈敏度有所提高[19],本研究發(fā)現(xiàn)設(shè)定HESI源蒸發(fā)氣的溫度為300 ℃時(shí),較不設(shè)蒸發(fā)氣溫度采用ESI的方式分析待測(cè)物,其靈敏度可提高約2倍。

表1 氯硝柳胺、氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺、d5-氯霉素、d3-甲砜霉素和d3-氟苯尼考的質(zhì)譜條件

*quantitation ion

圖1 5種待測(cè)物及內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖(0.5 μg/L)Fig.1 MRM chromatograms of five analytes and internal standard mixed standard solution(0.5 μg/L)1.FFA(m/z 248.0>230.0)，2.NIC(m/z 324.9>289.0)，3.CAP(m/z 320.9>152.0)，4.d5-CAP(m/z 325.9>157.0)，5.TAP(m/z 354.0>184.9)，6.d3-TAP(m/z 357.0>188.0)，7.FF(m/z 355.9>335.9)，8.d3-FF (m/z 358.7>338.8)

圖2 不同吸附劑對(duì)氨化乙腈提取液的凈化作用Fig.2 Effects of different sorbents in ammoniated acetonitrile extraction solution

2.1.2 色譜條件的優(yōu)化 流動(dòng)相中加入甲酸或乙酸均可提高氟苯尼考胺的質(zhì)譜響應(yīng)度,但會(huì)抑制氯硝柳胺、氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的質(zhì)譜響應(yīng)度,而氯霉素屬禁用藥物,對(duì)其靈敏度的要求較氟苯尼考胺更高。此外,氯硝柳胺的pKa值為7.3,為兩性化合物[16],當(dāng)流動(dòng)相中加入甲酸、乙酸或氨水時(shí)氯硝柳胺的保留時(shí)間易發(fā)生漂移,且影響其離子化效率的穩(wěn)定性,因此本實(shí)驗(yàn)最終選擇甲醇-水作為流動(dòng)相,以獲得最佳的分離效果。5種待測(cè)化合物的極性由大到小順序?yàn)榉侥峥及?甲砜霉素>氟苯尼考>氯霉素>氯硝柳胺,國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 22959-2008[20]采用40%甲醇和水為流動(dòng)相,可在Supelco Discovery C18(150 mm×2.1 mm,5 μm)色譜柱上對(duì)氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考進(jìn)行分離,而本研究采用該流動(dòng)相時(shí)很難將氯硝柳胺從反相色譜柱上洗脫,因此最終選擇采用“1.5”所述梯度洗脫程序分離洗脫5種待測(cè)物(見圖1)。

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1 提取溶液的選擇 動(dòng)物組織中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的常用提取劑有乙酸乙酯、乙腈、丙酮和二氯甲烷等溶劑,但上述溶劑并不能同時(shí)提取氯硝柳胺、氟苯尼考胺、氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考,因氟苯尼考胺是堿性化合物,更易溶解在高pH值的溶液中[19],而堿性提取液也有利于氯硝柳胺的提取[8],由于乙腈的脂質(zhì)提取率低,且基質(zhì)離子化作用小[21],因此本實(shí)驗(yàn)最終選用氨化乙腈作為提取溶劑,并參考Liu等[8]對(duì)氨化乙腈溶液的制備方法進(jìn)行配制。結(jié)果表明,以氨化乙腈作為提取劑可使水產(chǎn)品中的氯硝柳胺、氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺殘留獲得較好的提取效率。

2.2.2 凈化用吸附劑的選擇及其用量的確定 在中華鱉空白肌肉組織中添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,使其加標(biāo)濃度為5 μg/kg。按照“1.4.2”方法進(jìn)行提取后,分別考察了200 mg的多壁碳納米管(MWCNTs)、乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)和十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)作為凈化劑時(shí)的回收率。由圖2可知,C18對(duì)樣品提取液的凈化效果最優(yōu),PSA的凈化效果最差。這是由于PSA吸附劑是在硅膠上鍵合了乙二胺-N-丙基官能團(tuán),是與—NH2相似的吸附劑,對(duì)5種待測(cè)物均有一定的保留作用且對(duì)氯硝柳胺的保留作用最大,MWCNTs是一種具有較強(qiáng)吸附作用的納米材料,性質(zhì)與C18相似[21-23],對(duì)5種待測(cè)物也有一定的吸附,因此選擇C18作為凈化劑。進(jìn)一步對(duì)C18的用量進(jìn)行考察,結(jié)果顯示不同用量C18對(duì)氨化乙腈提取液的凈化效果為300 mg>200 mg>100 mg,因此,實(shí)驗(yàn)選擇C18的用量為300 mg。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在生物樣品分析中普遍存在基質(zhì)效應(yīng)。氘代同位素內(nèi)標(biāo)與待測(cè)物結(jié)構(gòu)相似,在色譜和質(zhì)譜上的特征相似,不但可抵消質(zhì)譜離子化時(shí)的基質(zhì)效應(yīng),還可消除樣品前處理過程中的差異[24]。本研究采用d5-氯霉素、d3-甲砜霉素和d3-氟苯尼考作為內(nèi)標(biāo),對(duì)中華鱉組織中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺進(jìn)行內(nèi)標(biāo)法定量,可消除基質(zhì)效應(yīng)對(duì)定量結(jié)果準(zhǔn)確性的影響。由于未購買到氯硝柳胺的同位素標(biāo)準(zhǔn)品,采用空白基質(zhì)提取液配制與標(biāo)準(zhǔn)溶液相同濃度的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液(1、5、20 μg/L),分別測(cè)定后按照Liu等[8]方法計(jì)算中華鱉組織對(duì)氯硝柳胺產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng),結(jié)果表明,中華鱉組織對(duì)氯硝柳胺均產(chǎn)生較強(qiáng)的基質(zhì)抑制作用,其中中華鱉血漿對(duì)氯硝柳胺的基質(zhì)效應(yīng)分別為-11.2%、-9.8%和-9.5%,中華鱉肌肉組織對(duì)氯硝柳胺的基質(zhì)效應(yīng)分別為-12.6%、-13.7%和-10.4%,中華鱉裙邊對(duì)氯硝柳胺的基質(zhì)效應(yīng)分別為-11.5%、-12.7%和-13.2%,中華鱉肝臟組織對(duì)氯硝柳胺的基質(zhì)效應(yīng)分別為-13.3%、-14.9%和-12.4%,中華鱉腎臟組織對(duì)氯硝柳胺的基質(zhì)效應(yīng)分別為-14.3%、-12.9%和-11.9%。因此,本文采用空白基質(zhì)匹配校正曲線的方法對(duì)氯硝柳胺進(jìn)行定量以減少測(cè)定誤差。

2.4 線性關(guān)系

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線 將“1.3”制備的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)樣分析,以氯硝柳胺的質(zhì)量濃度(x,μg/L)為橫坐標(biāo),峰面積(A)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線；分別以氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的質(zhì)量濃度(x,μg/L)為橫坐標(biāo),對(duì)應(yīng)峰面積分別與d5-氯霉素、d3-甲砜霉素、d3-氟苯尼考和d3-氟苯尼考峰面積的比值(y)為縱坐標(biāo),分別繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。結(jié)果表明,氯硝柳胺、氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺均在0.3～100 μg/L濃度范圍內(nèi)呈線性相關(guān),回歸方程分別為A=48 793x+60 791,y=3.569 7x-1.583 1,y=0.420 3x-0.074 8,y=0.496 2x+0.336 6和y=0.636 9x+0.401 8,相關(guān)系數(shù)分別為0.998 7、0.999 2、0.999 8、0.999 6和0.999 2。

2.4.2 氯硝柳胺的空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線 將“1.3”制備的中華鱉血漿、肌肉、裙邊、肝臟和腎臟空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣分析,以氯硝柳胺的質(zhì)量濃度(Cm)為橫坐標(biāo),峰面積(Ai)為縱坐標(biāo),繪制空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。結(jié)果表明,氯硝柳胺在0.5～100 μg/L濃度范圍內(nèi)呈線性相關(guān),基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)和線性范圍見表2。

表2 氯硝柳胺的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.5 方法的回收率、精密度、檢出限與定量下限

在中華鱉空白血漿、肌肉、裙邊、肝臟和腎臟中添加濃度水平為1.0、5.0、20 μg/kg的氯硝柳胺、氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,每個(gè)濃度水平平行6個(gè)樣品,按照“1.5”方法進(jìn)行樣品前處理,在“1.6”色譜條件下進(jìn)行測(cè)定,得3個(gè)加標(biāo)水平下中華鱉組織中的平均回收率為77.9%～105.3%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.7%～10.5%。氯硝柳胺、氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺在中華鱉組織中以大于3倍信噪比計(jì)算的檢出限(LOD)分別為0.5、0.1、0.5、0.5、0.5 μg/kg,以大于10倍信噪比計(jì)算的定量下限(LOQ)分別為1.0、0.3、1.0、1.0、1.0 μg/kg。說明本方法可以滿足中華鱉組織中氯硝柳胺、氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的檢測(cè)要求。方法回收率、精密度、檢出限和定量下限結(jié)果見表3。

表3 中華鱉組織中5種目標(biāo)物的加標(biāo)回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差、檢出限和定量下限

(續(xù)表3)

TissueAnalyteSpikedlevel(μg/kg)Recovery(%)RSD(%)LOD(μg/kg)LOQ(μg/kg)KidneyNIC1，5，2081 9，87 9，97 26 8，5 7，6 10 51 0CAP1，5，20100 5，104 8，105 15 6，6 0，7 10 10 3TAP1，5，2098 5，103 0，99 45 3，6 5，5 10 51 0FF1，5，20103 2，100 9，97 910 1，6 9，7 50 51 0FFA1，5，20101 9，95 2，98 65 1，6 7，4 60 51 0

2.6 方法的應(yīng)用

將該方法用于市售5份中華鱉、3份黃顙魚、4份團(tuán)頭魴肌肉樣品,以及送檢的懷疑氯硝柳胺中毒死亡的白鰱和草魚肌肉樣品的測(cè)定,結(jié)果表明市售的1份中華鱉肌肉中檢出甲砜霉素,其殘留量?jī)H為2.41 μg/kg,遠(yuǎn)低于我國現(xiàn)行規(guī)定的魚中甲砜霉素的最大殘留限量值(50 μg/kg),而送檢的懷疑中毒的白鰱和草魚肌肉樣品中分別檢出高含量的氯硝柳胺,其含量分別為94.51 μg/kg和68.75 μg/kg。

3 結(jié) 論

本文采用改良的QuEChERS前處理方法,建立了中華鱉組織(血漿、肌肉、裙邊、肝臟和腎臟)中氯硝柳胺、氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯考胺殘留的正負(fù)離子切換HPLC-HESI/MS/MS同時(shí)測(cè)定的分析方法。該方法樣品前處理簡(jiǎn)單快速,靈敏度高,回收率和精密度良好,方法的定量下限均能滿足各國對(duì)最大殘留限量值的要求。從而為開展氯硝柳胺和酰胺醇類藥物在中華鱉體內(nèi)代謝研究和殘留量監(jiān)測(cè)提供了技術(shù)支撐,也可為水產(chǎn)養(yǎng)殖中由氯硝柳胺引起的魚塘中毒事件提供一種有效的分析判斷方法。

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武漢病毒所在抗病毒免疫研究方面獲得重要突破

中國科學(xué)院武漢病毒研究所周溪研究員課題組與軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所秦成峰研究員課題組合作，在抗病毒免疫研究方面取得重要進(jìn)展，揭示了RNA干擾(RNAi)通路在哺乳動(dòng)物中具有抗病毒免疫功能。相關(guān)研究成果以“Human virus-derived small RNAs can confer antiviral immunity in mammals”(人類病毒來源的小RNA在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生抗病毒免疫反應(yīng))為題發(fā)表在Immunity上。

RNAi是一種在真核生物中高度保守的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制, 并已被公認(rèn)在真菌、植物和無脊椎動(dòng)物中起到關(guān)鍵的抗病毒免疫作用。在RNAi抗病毒過程中, 病毒RNA復(fù)制所產(chǎn)生的雙鏈RNA(dsRNA)被宿主Dicer蛋白識(shí)別并切割成小干擾RNA(siRNA)。這些病毒衍生的siRNAs(vsiRNAs)被轉(zhuǎn)移到 RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合體 (RISC), 并介導(dǎo)同源病毒RNA的降解，從而達(dá)到抗病毒的目的。盡管RNAi在哺乳動(dòng)物中也保守存在，并被廣泛用于生命科學(xué)與技術(shù)研究，然而，在哺乳動(dòng)物中，RNAi是否同樣能起到抗病毒免疫作用仍不清楚。

在該研究中，研究者利用人腸道病毒71型(EV71)感染的人類體細(xì)胞及小鼠為模型，發(fā)現(xiàn)其非結(jié)構(gòu)蛋白3A具有RNAi抑制子(VSR)功能。3A能夠通過與病毒dsRNA結(jié)合來阻止Dicer對(duì)其剪切，抑制vsiRNAs的產(chǎn)生。當(dāng)3A的VSR活性被缺失，VSR缺陷型EV71病毒能在細(xì)胞與小鼠中激發(fā)RNAi反應(yīng)，并產(chǎn)生大量vsiRNAs。這些vsiRNA通過Dicer剪切病毒dsRNA產(chǎn)生、被裝配進(jìn)RISC、并高效地介導(dǎo)同源病毒RNA的降解。在正常的人體細(xì)胞和小鼠中，VSR缺陷型病毒的復(fù)制被極大地抑制;而在RNAi通路缺失的細(xì)胞中，突變病毒的復(fù)制得到顯著的拯救。同時(shí)，研究者們還證明RNAi在哺乳動(dòng)物中所發(fā)揮的抗病毒作用不依賴于干擾素反應(yīng)。

該研究在人類體細(xì)胞及動(dòng)物水平發(fā)現(xiàn)了病毒感染可以產(chǎn)生具抗病毒功能的vsiRNA，確證了RNAi在哺乳動(dòng)物中是一條抗病毒天然免疫通路;同時(shí)，也揭示了一種人類病毒在逃逸RNAi天然免疫的具體機(jī)制。該工作完善了對(duì)哺乳動(dòng)物抗病毒免疫機(jī)制的認(rèn)識(shí)，并為該領(lǐng)域的后續(xù)研究以及針對(duì)該通路的抗病毒藥物設(shè)計(jì)或免疫療法研究提供了理論基礎(chǔ)。

(信息來源：中國科學(xué)院武漢病毒研究所)

Determination of Niclosamide and Amphenicols Residues in Chinese Soft-shelled Turtle(Trionyxsinensis) Tissues by Modified QuEChERS Combined with HPLC-HESI/MS/MS

LIU Yong-tao1，2，DONG Jing1，2,YANG Qiu-hong1，2，YU Lin-xue3，YANG Yi-bin1，2，HE Li1,AI Xiao-hui1，2*

(1.Yangtze River Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Wuhan 430223，China；2.Hubei Freshwater Aquaculture Collaborative Innovation Center,Wuhan 430070，China；3.College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China)

A modified QuEChERS sample preparation combined with high performance liquid chromatography-heated electrospray ionization-tandem mass spectrometric(HPLC-HESI/MS/MS) method was established for the simultaneous determination of niclosamide(NIC)，chloramphenicol(CAP)，thiamphenicol(TAP)，florfenicol(FF) and florfenicol amine(FFA) in plasma，muscle，skirt，liver and kidney of Chinese soft-shelled turtle(Trionyxsinensis).The sample was extracted and purified using a modified QuEChERS method，and ammoniate acetonitrile and octadecyl silane(C18) were chosen as extractant and purification，respectively.The mobile phase comprised of methanol and water，and the flow rate was set at 0.3 mL/min.The sample prepared was separated on a Waters Symmetry?C18(2.1 mm×100 mm，3.5 μm) column,and determined in the positive and negative ion multiple reaction monitoring mode through polarity switching between time segments.CAP，TAP，F(xiàn)F and FFA were quantified by internal standard calibration curve method，and NIC was used the external standard matrix-matched standard curve method.Good linearities were observed in the range of 0.3-100 μg/L for five analytes，with correlation coefficients not more than 0.998 7.The average recoveries of 5 analytes at the spiked level of 1-20 μg/kg in plasma，muscle，skirt，liver and kidney of Chinese soft-shelled turtle(Trionyxsinensis) ranged from 77.9% to 105.3% with relative standard deviations(RSD) of 2.7%-10.5%.The detection limits(LOD) for NIC，CAP，TAP，F(xiàn)F and FFA in Chinese soft-shelled turtle tissues were 0.5，0.1，0.5，0.5,0.5 μg/kg，and the quantitation limits(LOQ) were 1.0，0.3，1.0，1.0,1.0 μg/kg，respectively.The method is simple，accurate，highly sensitive，and is suitable for the simultaneous determination of NIC，CAP，TAP，F(xiàn)F and FFA residues in Chinese soft-shelled turtle tissues.

Chinese soft-shelled turtle；niclosamide；amphenicols；modified QuEChERS；high performance liquid chromatography-heated electrospray ionization-tandem mass spectrometry(HPLC-HESI/MS/MS)

2017-04-05；

2017-04-15

中國水產(chǎn)科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)資助項(xiàng)目(2016JBF0104)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)人才支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2016-2020)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.08.002

O657.63；R978.1

A

1004-4957(2017)08-0955-08

*通訊作者：艾曉輝,博士,研究員,研究方向：水產(chǎn)動(dòng)物藥理,Tel：027-81780298,E-mail：thincat2005@sina.com