基于JAK2/STAT3信號通路探討風(fēng)濕寧膠囊對寒濕痹阻型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制?

王永輝，張曉園，李艷彥，周 然

(1. 山西中醫(yī)學(xué)院，山西 晉中 030619； 2. 山西省中醫(yī)院，太原 030012)

【實(shí)驗(yàn)研究】

基于JAK2/STAT3信號通路探討風(fēng)濕寧膠囊對寒濕痹阻型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制?

王永輝1，張曉園2，李艷彥1，周 然1

(1. 山西中醫(yī)學(xué)院，山西 晉中 030619； 2. 山西省中醫(yī)院，太原 030012)

目的：探討風(fēng)濕寧膠囊對寒濕痹阻型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型大鼠JAK2/STAT3信號通路的影響及作用機(jī)制。方法：SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、tofacitinib組(15mg·kg-1)和風(fēng)濕寧高、中、低劑量組(1.32，0.66，0.33 g·kg-1)每組各12只；除正常組外，其余各組大鼠均采用人工氣候箱模擬寒濕環(huán)境結(jié)合II型膠原誘導(dǎo)的方法制備寒濕痹阻型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型，造模成功后，各組大鼠灌胃給予相應(yīng)藥物進(jìn)行干預(yù)，每日1次，連續(xù)28 d；觀察藥物對大鼠關(guān)節(jié)腫脹度、關(guān)節(jié)滑膜組織JAK2、STAT3及JAK2/STAT3通路負(fù)反饋抑制因子SOCS3的mRNA和蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：風(fēng)濕寧膠囊可顯著降低寒濕痹阻型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型大鼠的關(guān)節(jié)腫脹度，抑制JAK2、STAT3 mRNA及蛋白的過表達(dá)，促進(jìn)SOCS3 mRNA及蛋白表達(dá)。結(jié)論: 風(fēng)濕寧膠囊抑制JAK2/STAT3信號通路的過度激活作用是其治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的重要機(jī)制之一。

風(fēng)濕寧膠囊；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；寒濕痹阻；JAK2/STAT3信號通路

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種以多關(guān)節(jié)滑膜炎癥為主要表現(xiàn)的系統(tǒng)性、自身免疫性疾病[1]，其病變主要影響外周關(guān)節(jié)，也可累及皮膚、心臟、肺、眼睛等其他組織和器官。RA在我國的發(fā)病率為0.32%～0.38%，疾病早期主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫脹、疼痛及進(jìn)行性關(guān)節(jié)軟骨和骨的破壞，若不及時(shí)治療最終會導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形、功能喪失，有很高的致殘率，給患者及社會帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。

雖然遺傳、環(huán)境及免疫系統(tǒng)紊亂等多種因素均可誘發(fā)RA，但其發(fā)病原因及機(jī)制至今尚不明確。因此，針對RA發(fā)病機(jī)理的研究和尋找新的治療靶點(diǎn)是風(fēng)濕病學(xué)界的一項(xiàng)重要課題。近年來RA的發(fā)生被證明，與體內(nèi)多種炎性因子、趨化因子和基質(zhì)降解分子密切相關(guān)，正是這些因子引發(fā)了對關(guān)節(jié)腔的持續(xù)侵襲，最終造成關(guān)節(jié)損傷。JAK2/STAT3信號通路因廣泛參與RA患者關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞的增殖、凋亡、炎癥反應(yīng)、血管翳形成和機(jī)體免疫調(diào)節(jié)等過程，已成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)[3]。本研究建立了寒濕痹阻型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型，觀察了風(fēng)濕寧膠囊對其關(guān)節(jié)腫脹度及滑膜組織中JAK2/STAT3通路相關(guān)蛋白的影響，從JAK2/STAT3信號通路角度探討了風(fēng)濕寧膠囊治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 藥品與試劑

風(fēng)濕寧膠囊，山西仁源堂藥業(yè)有限公司(20150314)；完全弗氏佐劑，美國Sigma公司(F5881)；II型膠原，美國Chondrex公司(100028)；tofacitinib，美國Selleck公司中國分公司(S5001)；Anti- JAK2 antibody，美國abcam公司(ab32101)；Anti- STAT3 antibody，美國abcam公司(ab119352)；Anti- SOCS3 antibody，美國abcam公司(ab16030)。

1.2 儀器

PCR擴(kuò)增儀，BIO公司；StepOne熒光定量PCR儀，ABI公司；LRH- 800- GSI人工氣候箱，韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；IX51光學(xué)顯微鏡，日本奧林巴斯有限公司；凝膠成像系統(tǒng)，上海復(fù)日科技有限公司；TU- 1901紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司；LXJ- II離心機(jī)，上海醫(yī)用分析儀器廠；DHP- 9612恒溫培育箱，上海一恒科技有限公司；AC8洗板機(jī)，芬蘭Thermo Labsystems公司；PPTHK- 21B攤片機(jī)，徠克公司；CM1850冷凍切片機(jī)，徠克公司； HC- 2518R高速冷凍離心機(jī)，安徽中科中佳儀器有限公司；DYY- 6C電泳儀，北京六一儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級雄性SD大鼠72只，8周齡，體質(zhì)量180～200 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物有限公司(合格證號SCXK- (京)2012- 0001)。

2 方法

2.1 分組、模型制備及給藥

適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、tofacitinib組(15 mg·kg-1)和風(fēng)濕寧高、中、低劑量組(1.32，0.66，0.33 g·kg-1)6組。造模當(dāng)日，除正常組外將其余各組大鼠置氣候箱中模擬寒濕環(huán)境[RH=(90±4)%，T=(6±2)℃]持續(xù)刺激8 h，每日1次，連續(xù)14 d；造模第7天，除正常組外其余各組大鼠均于右后肢足爪、尾根、背部各注射Ⅱ型膠原乳液(1 mg·mL-1)0.1 mL，正常組大鼠于相同部位皮下注射等量生理鹽水；造模第14天同法免疫加強(qiáng)1次，以制備寒濕痹阻型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠動物模型。次日開始給藥干預(yù)(記為1 d)，各組大鼠分別灌胃相應(yīng)藥物，正常組、模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水，每日1次，連續(xù)28 d。

2.2 指標(biāo)檢測

表1顯示，從第1天開始，每7 d采用容積法檢測各組大鼠右后肢容積，按下列計(jì)算關(guān)節(jié)腫脹度：腫脹度=(造模前容積-造模后容積)/造模前容積×100%。于末次給藥24 h后處死大鼠，取右踝關(guān)節(jié)滑膜組織，分別采用免疫熒光和Western blot法檢測滑膜中JAK2、STAT3和SOCS3蛋白的表達(dá)水平，采用Real time- PCR法對滑膜組織中JAK2、STAT3及SOCS3 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果分析采用2- △△CT法。

表1 JAK2、STAT3及SOCS3基因PCR 引物序列和反應(yīng)條件

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 風(fēng)濕寧對大鼠關(guān)節(jié)腫脹度的影響

表1顯示，在整個(gè)給藥周期中，模型組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度較正常組顯著升高(P<0.05)；自給藥第14天起，風(fēng)濕寧高、中劑量組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度較模型組顯著降低(P<0.05)，至第28天，風(fēng)濕寧各劑量組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度均較模型組顯著降低(P<0.05)，其中高、中劑量組抗關(guān)節(jié)腫脹作用明顯優(yōu)于低劑量組(P<0.05)，但高、中劑量組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 風(fēng)濕寧對大鼠關(guān)節(jié)腫脹度的影響

注：與正常組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05；與風(fēng)濕寧低劑量組比較：△P<0.05

3.2 風(fēng)濕寧對大鼠關(guān)節(jié)滑膜JAK2、STAT3及SOCS3 mRNA表達(dá)的影響

表2顯示，與正常組比較，模型組和風(fēng)濕寧各劑量組大鼠滑膜組織中JAK2、STAT3和SOCS3 mRNA表達(dá)均顯著升高(P<0.05)；tofacitinib組JAK2、SOCS3 mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)，但STAT3 mRNA的表達(dá)未見明顯改變(P>0.05)；與模型組比較，tofacitinib組、風(fēng)濕寧高、中劑量組JAK2 mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)；風(fēng)濕寧高劑量組STAT3 mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)，風(fēng)濕寧各劑量組SOCS3 mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05)，tofacitinib組中SOCS3 mRNA的表達(dá)顯著降低(P<0.05)。

3.3 風(fēng)濕寧對大鼠關(guān)節(jié)滑膜JAK2、STAT3及SOCS3蛋白表達(dá)的影響

表2圖1顯示，與正常組比較，模型組和風(fēng)濕寧各劑量組大鼠滑膜組織JAK2、STAT3和SOCS3蛋白的表達(dá)顯著升高(P<0.05)；tofacitinib組JAK2、SOCS3蛋白的表達(dá)顯著下降(P<0.05)，而STAT3蛋白的表達(dá)未見明顯改變(P>0.05)。與模型組比較，tofacitinib組、風(fēng)濕寧高、中劑量組JAK2蛋白的含量顯著降低(P<0.05)；tofacitinib組、風(fēng)濕寧高劑量組STAT3蛋白的表達(dá)顯著降低(P<0.05)，風(fēng)濕寧各劑量組SOCS3蛋白含量均有不同程度的升高(P<0.05)，但各劑量組組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，tofacitinib組中SOCS3蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。

表2 風(fēng)濕寧對大鼠關(guān)節(jié)滑膜JAK2、STAT3、SOCS3 mRNA及蛋白表達(dá)的影響

注：與正常組比較:*P<0.05；與模型組比較:#P<0.05；與風(fēng)濕寧低劑量組比較:△P<0.05

圖1 風(fēng)濕寧對大鼠關(guān)節(jié)滑膜JAK2、STAT3、SOCS3蛋白表達(dá)的影響注：從左至右依次為正常組、模型組、tofacitinib組、風(fēng)濕寧高、中、低劑量組

3.4 風(fēng)濕寧對大鼠關(guān)節(jié)滑膜JAK2、STAT3蛋白免疫熒光表達(dá)的影響

圖2、3顯示，與正常組比較，模型組大鼠滑膜組織中JAK2和STAT3蛋白表達(dá)顯著增多，tofacitinib組中JAK2和STAT3表達(dá)明顯降低，風(fēng)濕寧高、中劑量組JAK2和STAT3蛋白表達(dá)有不同程度的降低。

圖2 風(fēng)濕寧對大鼠關(guān)節(jié)滑膜JAK2免疫熒光表達(dá)的影響(100×)

圖3 風(fēng)濕寧對大鼠關(guān)節(jié)滑膜STAT3免疫熒光表達(dá)的影響(100×)

4 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎屬于中醫(yī)“痹癥”范疇?！端貑枴け哉摗吩唬骸帮L(fēng)、寒、濕三氣雜至，合而為痹也。”在“三氣致痹學(xué)說”中，寒、濕二邪尤為重要，寒性收引凝滯，客于經(jīng)脈，氣血為其所痹阻，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)冷痛；濕性重濁黏滯，阻礙氣血運(yùn)行，表現(xiàn)為肢體疼痛重著，寒濕相雜，病情多纏綿難愈?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，JAK/STAT信號通路是介導(dǎo)與 RA 發(fā)病有關(guān)細(xì)胞因子傳導(dǎo)的重要途徑，由其所介導(dǎo)并引發(fā)的炎癥級聯(lián)放大效應(yīng)是RA致病的關(guān)鍵[4]。JAK有4個(gè)家族成員，其中JAK3僅在骨髓、淋巴系統(tǒng)中表達(dá)，JAK1、JAK2和TYK2則廣泛分布于機(jī)體的細(xì)胞和組織中[5]。STAT位于JAK下游，是信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子，JAK使其磷酸化后形成二聚體而激活，活化的STAT二聚體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)與相應(yīng)的靶基因啟動子結(jié)合后，進(jìn)而激活基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[6]。SOCS是JAK/STAT信號通路的自身負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子[7]，由其介導(dǎo)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)可抑制因JAK/STAT信號通路持續(xù)開放而造成的細(xì)胞代謝失調(diào)和功能紊亂。RA患者滑膜組織中JAK2、STAT3呈高表達(dá)狀態(tài)[8]，其中，STAT3的激活僅存在于RA患者的滑膜組織中，而在一般關(guān)節(jié)炎患者的滑膜組織中表達(dá)極低[9]。在RA的發(fā)生發(fā)展過程中，滑膜細(xì)胞中STAT3的持續(xù)表達(dá)是引發(fā)滑膜炎癥的主要因素之一。IL- 6、IL- 10和IFNs都可使STAT3激活，從而抑制成纖維滑膜細(xì)胞的凋亡，并增加T淋巴細(xì)胞的活性，進(jìn)一步加重類風(fēng)濕的臨床癥狀[10-11]?；虬邢蜓芯恳驯砻鳎琒OCS3具有對抗IL- 6/STAT3 的作用[12]。

風(fēng)濕寧膠囊具有祛風(fēng)散寒、除濕通絡(luò)、活血止痛之功，主治風(fēng)寒濕兼瘀血阻絡(luò)型痹癥。自20世紀(jì)80年代起，風(fēng)濕寧膠囊以醫(yī)院制劑的形式來治療類風(fēng)濕性疾病，經(jīng)過多年的臨床應(yīng)用證明，其對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的有效率可達(dá)90.8%，可明顯改善患者的臨床癥狀，延緩或阻止病情的繼續(xù)發(fā)展[13]。JAK/STAT信號通路是一條由多種細(xì)胞因子受體刺激的信號傳導(dǎo)通路，IL- 6、IL- 17、IL- 21和IFNα/β等多種因子可通過不同途徑激活 JAK/STAT 信號通路[14]。前期研究表明，風(fēng)濕寧膠囊具有改善機(jī)體免疫失衡、調(diào)節(jié)炎性與抗炎細(xì)胞因子比例等作用，能夠顯著降低外周血Th17 細(xì)胞比率，減少IL- 1β、IL- 4、IL- 6、IL- 10、IL- 17A、TNF- α、IFN- γ等炎性因子的分泌[15-16]。本研究進(jìn)一步觀察了風(fēng)濕寧膠囊對寒濕痹阻型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型大鼠JAK2/STAT3信號通路的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 與正常組比較，模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜中JAK2、STAT3的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著增加。風(fēng)濕寧膠囊可促進(jìn)大鼠滑膜組織中JAK2/STAT3信號通路負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子SOCS3 mRNA和蛋白的表達(dá)，抑制JAK2、STAT3 mRNA和蛋白的過表達(dá)，表現(xiàn)出對JAK2/STAT3通路過度激活狀態(tài)的抑制效應(yīng)。綜上所述，風(fēng)濕寧膠囊抑制JAK2/STAT3信號通路的過度激活作用是其治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的重要機(jī)制之一。

[1] NAKAYAMA H, YAGUCHI T, YOSHIYA S,et al. Resveratrol induces apoptosis MH7A human rheumatoid arthritis synovial cells in a sirtuin 1- dependent manner [J]. Rheumatol INT，2012,32(1)：151- 157.

[2] 陸蕓，于順祿，邢國勝，等.核心肽對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞增殖與凋亡的影響[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14(28)：5199- 5203.

[3] 于子涵，劉英. JAK- STAT1信號通路及細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制蛋白- 1在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的研究進(jìn)展[J].風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎，2014,3(4):66- 69.

[4] NIU X,CHEN G.Clinical biomarkers and pathogenic- related cytokines in rheumatoid arthritis[J]. J Immunol Res, 2014, 69 (8):192- 198.

[5] WALKER J G, AHERN M J, COLEMAN M,et al.Expression of jak3,STAT1,STAT4 and STAT6 ininflammatory arthritis:Unique Jak3 and STAT4 expression in dendritic cells in Seropositive rheumatoid arthritis[J].Ann Reum Dis,2006,65(2):149- 156.

[6] YU H, JOVE R. The STATs of cancer- new molecular targets come of age[J].Nat Rev Cancer,2004, 4(2):97- 105.

[7] RAM P A, WAXMAN D J. Interaction of growth hormne- activated STATS with SH2- containing phosphatase SHP- 1 and nuclear JAK2 tyrosine kinase[J].J Biol.Chem,1997,272(28)：17694- 17702.

[8] MONARI C, BEVILACQUA S, PICCIONI M, et al.A microbial polysaccharide reduces the severity of rheumatoid arthritis by influencing Th17 differentiation and proinflammatory cytokines production[J]. J Immunol,2009,183(1):191- 200.

[9] SHOUDA T, YOSHIDA T, HANADA T, et al. Induction of the cytokine signal regulator SOCS3/ CIS3 as a therapeutic strategy for treating inflammatory arthritis[J]. J Clin Invest，2001，108(12):1781- 1788.

[10] WALKER J G, SMITH M D. The JAK- STAT pathway in rheumatoid arthritis[J].J Rheumatol, 2005，32(9)：1650- 1653.

[11] GADINA M, HILTON D, JOHNSTON J A, et al.Signaling by Type I and II cytokine receptors:ten years after[J]. Curr Opin Immunol，2001，13(3)：363- 373.

[12] 薛翔，劉紅梅，邵旦兵，等. JAK/STAT信號通路調(diào)節(jié)機(jī)制的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2015，15(11)：2161- 2165.

[13] 趙建平，劉光珍，王裕頤.風(fēng)濕寧膠囊治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎療效觀察[J].山西中醫(yī)，1999,15(6)：8- 9.

[14] 楊千姣，余金迪，潘德思，等.治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎選擇性JAK抑制劑的研究進(jìn)展[J]. 中國新藥雜志，2015，24(1)：39- 45.

[15] 張曉園，王永輝，李艷彥，等.風(fēng)濕寧膠囊對寒濕閉阻型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型大鼠作用機(jī)制研究[J].山西中醫(yī)，2016，32(5)：54- 56.

[16] 趙建平，馮振宇，孟霜，等.風(fēng)濕寧膠囊對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠 Th17/Treg平衡和局部炎性因子的影響[J].世界科學(xué)技術(shù):中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2015，17(8)：1656- 1663.

Functional Mechanism of Fengshining Capsule on the Cold Dampness Blockage Type of Rheumatoid Arthritis Based on the Jak2/Stat3 Signaling Pathway

WANG Yong- hui1, ZHANG Xiao- yuan2, LI Yan- yan1, ZHOU Ran1

(1. Shanxi University of Traditional Chinese Medicine，Shanxi Jinzhong 030619,China; 2. Shanxi Provincial Hospital of traditional Chinese Medicine， Taiyuan 030012,China)

Objective: Investigating the effects and mechanism of Fengshining capsules (FSN) on CIA (Type of Cold dampness Blocked in Joints, CDM) rats model via JAK2 / STAT3 signal pathway. Method: SD rats were randomly divided into 6 groups, each group of 12, using artificial climate chamber simulated cold- dampness environment and type II collagen induced CWM rats model，and treated by FSN (1.32,0.66,0.33 g · kg-1),1times daily, for 28 consecutive days. Observed rats ankle swelling, mRNA and protein expression of JAK2, STAT3 and SOCS3 in synovial tissue. Results：FSN can effectively reduce the CWM rats ankle swelling degree, reduced mRNA and protein expression of JAK2 and STAT3, promoted the mRNA and protein expression of SOCS3. Conclusion: FSN has obvious therapeutic effect on CWM rats model, the mechanism was related to inhibitory action on the excessive activation of JAK2/STAT3 signal pathway.

Fengshining Capsules; CIA rats; Type of Cold dampness Blocked in Joints; JAK2/STAT3 signal pathway

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81473589)-基于JAK- STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路利用蛋白組學(xué)技術(shù)從方病證相關(guān)角度研究風(fēng)濕寧膠囊治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制

王永輝(1974- )，男，山西忻州人，副教授，醫(yī)學(xué)博士，從事方藥功用物質(zhì)基礎(chǔ)與藥理作用研究。

R285.5

B

1006- 3250(2017)07- 0949- 04

2017- 02- 14