益氣健脾法對脾虛痰濁AS豬腎組織AQP的影響?

石月萍，賈連群，宋 囡，劉晶晶，楊關(guān)林

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)， 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臟象理論及應(yīng)用教育部重點實驗室，沈陽 110847)

【實驗研究】

益氣健脾法對脾虛痰濁AS豬腎組織AQP的影響?

石月萍，賈連群，宋 囡，劉晶晶，楊關(guān)林Δ

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)， 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臟象理論及應(yīng)用教育部重點實驗室，沈陽 110847)

目的：探討脾虛痰濁動脈硬化(AS)巴馬小型豬腎組織水通道蛋白的改變及益氣健脾法的干預(yù)作用及機制。方法：將15只巴馬小型豬隨機分為正常組、模型組(脾虛痰濁AS模型)、益氣健脾組各5只，以高脂飲食喂飼加跑步勞倦結(jié)合冠脈球囊拉傷建立脾虛痰濁AS模型。正常組巴馬小型豬喂飼正常飼料，模型組球囊冠脈拉傷后高脂飼料結(jié)合跑步過勞制備脾虛痰濁AS模型，益氣健脾組在模型組處理基礎(chǔ)上于高脂飼料中添加益氣健脾中藥，觀察48周后各組巴馬小豬的腎臟組織病理形態(tài)學(xué)改變，腎組織環(huán)磷酸腺苷(cAMP)含量、水通道蛋白(AQP)1、2、3及磷酸化蛋白激酶A(p- PKA)、磷酸化cAMP反應(yīng)原件結(jié)合蛋白(p- CREB)表達變化。結(jié)果：與正常組比較模型組腎組織病理形態(tài)學(xué)可見腎小球及腎小管損傷，腎組織AQP1、2、3下調(diào)，cAMP/PKA/CREB通路下調(diào)，與模型組比較益氣健脾組可上調(diào)腎組織AQP1、2、3及cAMP/PKA通路。結(jié)論：脾虛痰濁AS模型可見腎組織病理損傷，腎組織AQP1、2、3下調(diào)，益氣健脾法可改善腎組織病理損傷，上調(diào)脾虛痰濁AS模型腎臟水通道蛋白的異常，其機制可能與調(diào)節(jié)cAMP/PKA通路相關(guān)。

益氣健脾法；脾虛痰濁；動脈粥樣硬化；水通道蛋白

隨著人們飲食結(jié)構(gòu)的改變，過多高脂飲食的攝入使脂質(zhì)逐漸沉積在人體動脈血管壁形成動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)，AS也是冠心病、糖尿病、腦梗死等疾病的基本病理基礎(chǔ)。脾虛痰濁是高脂血癥及當(dāng)今冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的主要證候[1- 2]。中醫(yī)理論認為肥甘厚味為“膏脂”，過量膏脂飲食超過人體脾胃的運化能力，不能化為精微運化至全身，停于體內(nèi)而成脂濁，阻滯氣血脈道，最終致痰瘀阻于心脈而致胸痹(冠心病)。楊關(guān)林教授課題組梳理了古今從脾論治冠心病文獻[3]，總結(jié)了路志正、鄧鐵濤等名老中醫(yī)從脾論治冠心病的經(jīng)驗[4]，課題組在以痰瘀論治冠心病的臨床實踐基礎(chǔ)上[5- 7]，提出冠心病痰瘀互結(jié)證從脾胃論治[8- 10]的心脾同治理念[11]。課題組建立了脾虛痰濁高脂大鼠模型，探討了脾虛膏脂轉(zhuǎn)輸異常的現(xiàn)代生物學(xué)機制[12]。在脾虛高脂及AS中，脾虛痰濁內(nèi)生的主要機制之一為脾虛膏脂轉(zhuǎn)輸異常，膏脂不化而成痰濁(脂濁)；而脾虛則運化水濕失常、水濕內(nèi)停，也是脾虛痰濁證必然存在的病理狀態(tài)。在脾虛高脂大鼠模型及脾虛痰濁AS模型中可見腹瀉或便溏癥狀，說明脾虛高脂模型存在脾虛水濕不化、留滯于胃腸的濕郁狀態(tài)，濕郁狀態(tài)必然會阻滯氣機和氣血運行。

水通道蛋白(aquaporins，AQPs)與細胞上轉(zhuǎn)運水的通道蛋白及細胞內(nèi)外的水平衡具有密切聯(lián)系，因此濕病與水通道蛋白的異常表達密切相關(guān)[13]。而腎組織水通道蛋白的表達與全身的水鹽代謝有密切關(guān)系[14]，全身的濕郁狀態(tài)可能與腎臟水通道蛋白表達失常有關(guān)。

課題組在益氣健脾法調(diào)節(jié)脾虛高脂大鼠膏脂轉(zhuǎn)輸異常及機制的研究基礎(chǔ)上[15]，建立巴馬豬脾虛痰濁AS巴馬豬模型，發(fā)現(xiàn)巴馬豬出現(xiàn)血脂的升高及冠狀動脈的斑塊形成[16]。通過動物行為學(xué)及量表觀察，出現(xiàn)脾虛證候[17- 18]表明，脾虛痰濁AS模型成功，模型豬存在便溏之脾虛濕盛狀態(tài)[19]。為進一步探討脾虛濕郁形成機制，本研究觀察脾虛痰濁巴馬豬腎組織AQPs的表達及益氣健脾法的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6～8月齡普通級去勢巴馬小型豬15只，體質(zhì)量(29.88±2.27) kg，由泰州泰和生物科技有限公司提供(許可證號SCXK(蘇)2001- 0002)。醫(yī)學(xué)倫理符合遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物管理條例規(guī)定和中華人民共和國衛(wèi)生部動物實驗管理條例(55,2001)。巴馬小型豬在實驗室溫度為(20.80±2.97)℃、濕度(47.30±15.31)%的環(huán)境中單籠飼養(yǎng)。

1.2 實驗藥物

選用益氣健脾中藥，采用免煎配方顆粒，購于江蘇江陰天江藥業(yè)有限公司。藥物組成：黨參(批號1403032)、白術(shù)(批號1403081)、茯苓(批號1403097)等，巴馬小型豬給藥劑量為0.825 g/kg。于脾虛痰濁AS造模成功后給藥，將上述顆粒劑溶于100 ml生理鹽水中，混于飼料中(每周稱重，按照3%豬的體質(zhì)量計算)進行喂飼。

1.3 實驗試劑

異氟烷，魯南貝特制藥有限公司(批號H20020267)；利多卡因，上海朝暉藥業(yè)有限公司(批號H31021072)；丙泊酚泛影葡胺，湖南漢森制藥有限公司(批號H43021120)；PBS，Biotopped(批號 140916)；肝素，上海第一生化藥業(yè)有限公司(批號H31022051)；Rabbit Anti- AQP1 antibody (bs- 1506R)、Rabbit Anti- AQP3 antibody (bs- 1253R)、Rabbit Anti- AQP4 antibody (bs- 0634R)，均購于北京博奧森生物科技有限公司。AQP2抗體(H- 40)Sc- 28629、PKAα/β/γcat抗體(H- 55)(Sc- 98951)、磷酸化特異性抗體PKA(Sc- 32986)均購于Santa Cruz。cAMP Elisa試劑盒購自上海滬宇生物科技有限公司；SDS- PAGE凝膠試劑盒(37K00130)、BCA蛋白定量試劑盒(37B00150)、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體均購于北京鼎國昌盛生物科技有限公司。

1.4 實驗儀器

小動物吸入麻醉機，北京益仁恒業(yè)科技有限公司(型號 VMR);6F 鞘管日本 TERUMO(型號 RS×A6K10SQ);數(shù)字減影血管造影機，DSA：荷蘭 PHILIPS(型號 Arrula);PT2 指引導(dǎo)絲，美國 BOSTON SCIENTIFIC CORPORATION(型號 38931- 01);超薄切片機(LKB- 1)、臺式高速冷凍離心機(3K15)，Sigma公司；全自動生化檢測儀(7170A)，日本日立公司；酶標(biāo)儀、ChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Bio- Rad)，美國伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；垂直電泳儀(HE- 180)、轉(zhuǎn)移電泳槽(VE- 1861)，上海天能科技有限公司。

1.5 模型復(fù)制

按文獻[20]法采用高脂飲食及疲勞過度法建立巴馬豬脾虛痰濁證候模型，以高脂飲食結(jié)合前降支中遠段1/3處的冠脈球囊拉傷法復(fù)制AS疾病模型，模型評價參見文獻[16- 19]。

正常組巴馬小型豬給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，不進行跑步及冠脈球囊拉傷。模型組及益氣健脾組巴馬豬給予高脂肪高熱量飼料喂養(yǎng)2周，于第3周行冠脈球囊拉傷術(shù)，術(shù)前禁食水，采用丙泊酚及5%異氟烷吸入復(fù)合麻醉，右股動脈穿刺后，數(shù)字減影血管造影機透視下將 6Fjudkins R3.5 指引導(dǎo)管沿著導(dǎo)絲送至左冠狀動脈開口，推注造影劑泛影葡胺(30 ml)后造影將指引導(dǎo)絲(PT2 導(dǎo)絲)送至前降支中遠段1/3處，以8～14 atm擴張球囊，移動球囊幅度大約5 mm，連續(xù) 5次，每次30 s，間隔30 s。造影觀察即刻血管影像，沿導(dǎo)絲送入超聲導(dǎo)管行血管內(nèi)超聲檢查。第6周開始每日使用跑步機(小型豬專用)，以0.8 km/h為初始速度，以30 s為穩(wěn)態(tài)時間間隔，增加0.3 km/h或其倍數(shù)，達到最高跑步速度2.1～5.4 km/h，持續(xù)15 min內(nèi)，使巴馬小型豬跑步力竭(趴地不起為止)。24周后益氣健脾組將益氣健脾中藥免煎顆粒水溶后拌于高脂飼料中，喂飼飼料量以每周稱重后計算，日進食量以體質(zhì)量的3%投放飼料，加入中藥(0.825 g/kg飲片劑量)拌于飼料中。實驗48周麻醉巴馬小型豬后于其動脈取血離心取上清，-80℃冰箱凍存?zhèn)溆?；分離切取腎組織，生理鹽水清洗，冰下將皮質(zhì)部位切成小塊1 cm3，一部分固定于4%多聚甲醛中，一部分置于-80℃冰箱保存待測。

1.6 ELISA法檢測腎組織環(huán)磷酸腺苷含量

取-80℃冰箱凍存的腎臟組織，每只小型豬腎組織稱重切取100 mg冰上制備勻漿，測定蛋白濃度，取96孔板按照說明書設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔和空白孔。在標(biāo)準(zhǔn)孔中加入50 μl梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品。于樣品孔中加入稀釋液40 μl，再加入樣品10 μl，即待測樣品為5倍稀釋。溫育30 min后，加入酶標(biāo)試劑100 μl洗滌5次。加顯色液A、B各50 μl，顯色15 min，終止液50 μl，終止反應(yīng)后15 min，在450 nm波長處測定各孔吸光度。計算各樣品濃度(ELISA Calc 回歸/擬合計算程序軟件v0.1)。

1.7 蘇木素(Hematoxylin)- 伊紅(Eosin)染色觀察腎組織病理形態(tài)學(xué)

取固定后的腎組織皮質(zhì)部分常規(guī)脫水，石蠟包埋，制作石蠟切片。石蠟切片經(jīng)二甲苯、無水乙醇脫蠟、染色(蘇木精- 伊紅)，每只動物腎組織切片于顯微鏡下取10個視野，拍照后觀察腎小球及腎小管形態(tài)。

1.8 Western- blot法測定腎組織AQP1、2、3，PKA、pPKA、CREB、p- CREB表達

取冰凍腎組織100 mg加入裂解液1 ml，勻漿器中勻漿，4℃12000 r/min離心10 min取上清，BCA試劑盒測定蛋白濃度、制膠、上樣，在垂直電泳槽中進電泳。將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，5 %脫脂奶粉中37 ℃封閉120 min，加AQP1、2、3及PKA、p- PKA、CREB、p- CREB一抗孵育，TBS- T洗膜液洗滌 3次，辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗孵育，TBS- T洗膜、ECL顯影、掃描成像，并用Alphaview SA圖像分析軟件分析各組蛋白條帶灰度值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 腎組織病理形態(tài)學(xué)改變

圖1顯示，正常組腎小球結(jié)構(gòu)清晰，腎小囊、腎小管腔隙明顯。模型組腎小球腫脹，腎小囊、腎小管腔隙變窄，腎小管可見排列紊亂，集合管中可見管型，腎小管細胞腫脹，排列紊亂。益氣健脾組腎小囊、腎小管可見腔隙，但較正常組變窄，腎小球腫脹較模型組有緩解，但腎小管的排列紊亂沒有減輕，腎小管腔隙增寬，但腎小管損傷明顯，并有炎癥細胞浸潤。

圖1 光鏡下各組腎肌組織病理變化(200×)

2.2 各組巴馬小型豬腎組織cAMP含量

表1顯示，模型組腎組織cAMP較正常組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。益氣健脾組較模型組cAMP升高并有恢復(fù)作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 腎組織cAMP含量比較

注：與模型組組比較:*P<0.05

2.3 各組腎組織AQP1、2、3，PKA、p- PKA、CREB、p- CREB蛋白表達

表2圖2～4顯示，與正常組比較，模型組腎組織AQP1、2、3蛋白表達均有下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；PKA及CREB蛋白表達無下調(diào)(P>0.05)，而p- PKA、p- CREB蛋白表達有下調(diào)(P<0.05)，說明模型組腎臟AQP1、2、3表達下調(diào)，與cAMP依賴的PKA磷酸化、CREB磷酸化激活A(yù)QP的表達有關(guān)。與模型組比較，益氣健脾組AQP1、2、3、p- PKA蛋白表達均有上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明益氣健脾組具有上調(diào)cAMP/PKA通路和腎組織AQP1、2、3而起到恢復(fù)腎臟濃縮功能作用。

表2 腎組織AQP1、2、3，PKA、p- PKA、CREB、p- CREB蛋白表達比較

注：與模型組比較：*P<0.05，P<0.01

圖2 各組腎組織AQP1、2、3蛋白表達

圖3 各組腎組織PKA、p- PKA蛋白表達

圖4 各組腎組織CREB、p- CREB蛋白表達

3 討論

AQPs是體內(nèi)調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外水平衡的跨膜蛋白，在機體內(nèi)廣泛分布于與體液分泌、吸收相關(guān)的上皮細胞及內(nèi)皮細胞中，參與各部位的水重吸收、體液分泌以及細胞外的水平衡。近年認為，體內(nèi)津液代謝疾病均有局部及全身水通道蛋白的失調(diào)[21]。AQP 在腎、肺和消化系統(tǒng)等器官廣泛存在，中醫(yī)理論認為機體津液代謝主要與肺、脾、腎三臟相關(guān)，脾主運化水液是中醫(yī)津液代謝樞紐，因此AQP 的正常表達可能是脾主運化水液的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

腎臟AQP包括AQP1、2、3、4、6，其中與尿液濃縮密切相關(guān)的是AQP1、2、3。AQP1分布于腎臟近曲小管及亨氏袢降支細段管腔膜，90%腎小球濾過液通過AQP1轉(zhuǎn)運，并經(jīng)AQP1濃縮。AQP2分布于腎臟近曲小管主細胞和內(nèi)髓部集合管上皮細胞頂部質(zhì)膜上，約10%腎小球濾過液經(jīng)過AQP2被重吸收。AQP3位于腎臟集合管上皮細胞基側(cè)質(zhì)膜，除了在尿液濃縮中起作用外，還可轉(zhuǎn)運尿素、甘油等[22]。綜上所述，腎臟AQP1、2、3的表達異常影響決定全身的水代謝。

AQP受滲透壓、PH、糖皮質(zhì)激素、鹽皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)以及其他蛋白調(diào)節(jié)。宋囡[23]等觀察脾虛證大鼠胃組織cAMP/PKA通路表達，說明cAMP/PKA通路與脾虛證相關(guān)。其中cAMP/PKA信號通路不僅調(diào)節(jié)AQP的表達，也參與調(diào)節(jié)糖代謝，并與脾虛證有關(guān)[24]。cAMP/PKA/CREB途徑是細胞內(nèi)經(jīng)神經(jīng)遞質(zhì)及激素作用于細胞膜上的G蛋白耦聯(lián)受體，激活腺苷酸環(huán)化酶，腺苷酸環(huán)化酶催化ATP水解生成cAMP，繼而cAMP與PKA的調(diào)節(jié)亞基結(jié)合，活化cAMP依賴的PKA，使PKA磷酸化，PKA可使AQP的4個絲氨酸位點(Ser256、Ser261、Ser264、Ser269)中的Ser256、Ser264、Ser269位點磷酸化增加，Ser261磷酸化減少。而cAMP與PKA的調(diào)節(jié)亞基結(jié)合后釋放的催化亞基轉(zhuǎn)位至細胞核內(nèi)，激活CREB在Ser133位點磷酸化，啟動AQP的轉(zhuǎn)錄而調(diào)節(jié)AQP 的表達[25]，說明cAMP/PKA通路調(diào)節(jié)AQP的表達，從而調(diào)節(jié)膜對水的通透性。

綜上所述，AQPs與濕郁有關(guān)[13]，全身的濕郁狀態(tài)可能與腎臟AQPs失常有關(guān)[14]。課題組建立了巴馬豬脾虛痰濁AS巴馬豬模型，結(jié)果巴馬豬不僅出現(xiàn)血脂升高及冠狀動脈的斑塊形成[16]，動物行為學(xué)及量表評價，出現(xiàn)懶動、便溏等癥，說明脾虛證候成立[17- 18]，脾虛痰濁AS模型可能伴隨脾虛濕郁狀態(tài)。為進一步探討可能的濕郁形成機制，本研究觀察脾虛痰濁巴馬豬腎組織AQP的表達及益氣健脾法的作用。

研究結(jié)果顯示，以動物行為學(xué)及動物脾虛量表進行脾虛痰濁證候模型評價[18]，模型組巴馬豬出現(xiàn)倦怠懶動、皮毛不光澤、便溏等脾虛癥狀，表明脾虛痰濁證候模型復(fù)制成功[20]。模型組血脂高于正常組，血脂數(shù)值課題組已發(fā)表文獻[16]，冠脈造影及血管內(nèi)超聲評價冠脈拉傷處內(nèi)膜損傷，病灶處血管內(nèi)膜下可見大量泡沫細胞證明AS病理改變[16]，通過以上綜合評價表明脾虛痰濁AS證候及疾病模型復(fù)制成功。

脾虛痰濁AS巴馬豬出現(xiàn)便溏、倦怠等脾虛的一般癥狀，說明脾虛痰濁巴馬豬可能存在脾虛濕郁的病理狀態(tài)。脾虛痰濁AS巴馬豬模型腎組織可見腎小球腫脹、腎小管細胞排列紊亂腫脹、間隙變小的改變，模型組腎組織AQP1、2、3蛋白表達比正常組下調(diào)，模型組的cAMP、p- PKA、p- CREB表達同時下調(diào)，而AQP又受cAMP依賴的PKA調(diào)節(jié)，說明脾虛痰濁AS巴馬豬的腎小管的損傷，與分布于腎小管細胞的AQPs下調(diào)有一定聯(lián)系，腎臟AQPs的表達與全身的水鹽代謝有著密切聯(lián)系，腎臟AQP下調(diào)可能受cAMP/PKA/CREB信號通路的調(diào)節(jié)。模型組腎組織改變和水通道蛋白變化及cAMP/PKA/CREB通路可能與脾虛痰濁模型的濕郁狀態(tài)有關(guān)。

益氣健脾組腎組織的腎小球腫脹減輕，腎小管細胞腫脹及排列紊亂均有減輕，腎組織AQP1、2、3蛋白表達及cAMP、p- PKA蛋白表達均有上調(diào)，但對于p- CREB沒有上調(diào)，說明益氣健脾法能夠減輕脾虛痰濁AS巴馬豬模型的腎小球及腎小管損傷，與上調(diào)腎組織AQP1、2、3作用與cAMP/PKA通路有關(guān)，而益氣健脾組對于p- CREB的表達沒有上調(diào)，分析可能有其他蛋白分子參與PKA下游p- CREB的調(diào)節(jié)。益氣健脾法對脾虛痰濁AS模型腎組織病理改變及對水通道蛋白的調(diào)節(jié)可能與恢復(fù)脾虛痰濁模型的濕郁狀態(tài)有關(guān)。

本研究結(jié)果說明，以高脂喂飼加跑步勞倦結(jié)合冠脈球囊拉傷血管內(nèi)皮方法復(fù)制的脾虛痰濁AS模型豬存在腎小球及腎小管損傷及腎臟AQP1、2、3、cAMP/PKA通路下調(diào)。益氣健脾法對脾虛痰濁AS模型豬腎小球及腎小管損傷有保護作用，并能上調(diào)脾虛痰濁巴馬豬腎組織AQP1、2、3蛋白表達，可能與調(diào)節(jié)cAMP/PKA信號通路有關(guān)。

[1] 聞莉,劉松林,梅國強.高脂血癥的中醫(yī)臨床證型分布及辨證規(guī)律研究[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2008,14(3):220- 221．

[2] 楊陽,李方杰.冠心病中醫(yī)證候及脾虛痰濁證與冠脈病變的關(guān)系對比觀察[J].中華中醫(yī)藥雜志,2010,25(3):352- 354．

[3] 寇曉忱,劉悅,張哲,等.從脾論治冠心病文獻評析[J].2015,17(3):140.

[4] 趙娜,呂曉濛,曲文彥,等.從脾論治冠心病名老中醫(yī)經(jīng)驗匯集[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報, 2016,18(3):51- 53.

[5] 羅智博,楊關(guān)林,陳旭,等.痰瘀論治冠心病[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2009,27(4):710- 713.

[6] 邱倩,張哲,陳蘇寧,等.祛痰化瘀中藥干預(yù)冠心病穩(wěn)定型心絞痛痰瘀互結(jié)證臨床觀察[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2013,31(7):1561- 1564.

[7] 王建,楊關(guān)林.祛痰化瘀顆粒劑對冠心病患者血管內(nèi)皮功能的影響[J].遼寧中醫(yī)雜志,2005, 32(5):430.

[8] 李崢,楊關(guān)林.楊關(guān)林教授治療胸痹心痛痰瘀互結(jié)證從脾胃論治臨床經(jīng)驗總結(jié)[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2016,34(3):569- 571.

[9] 劉光穎,張哲,楊關(guān)林.楊關(guān)林教授從脾胃論治胸痹心痛臨床經(jīng)驗總結(jié)[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2013,15(9):64- 66.

[10] 張會永,崔家鵬,楊關(guān)林.從《內(nèi)經(jīng)》脾病“脈道不利”探討從脾論治冠心病[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2013,19(11):1256- 1258．

[11] 何信用,王俊巖,賈連群，等.淺談從“心脾論治”防治冠心病[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報,2016, 22(16):12- 14.

[12] 賈連群,楊關(guān)林,張哲.從“脾主運化”理論探討膏脂轉(zhuǎn)輸與膽固醇逆向轉(zhuǎn)運[J].中醫(yī)雜志,2013,54(20):1793- 1795.

[13] 李姿慧,王鍵,蔡榮林.濕病與水通道蛋白的相關(guān)性研究進展[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報,2011, 9(1): 5- 10.

[14] 蔣豐智.新生鼠腎臟急性缺血再灌注損傷 AQP1、2、3、4 表達和 Na- K- ATPase 活性改變及其相關(guān)性研究[D].廣州：廣州醫(yī)學(xué)院,2009.

[15] 王瑩,賈連群,宋囡.香砂六君子丸對脾虛痰濁大鼠小腸組織cAMP/PKA信號通路的影響[J].遼寧中醫(yī)雜志,2015,42(8):1553- 1555.

[16] 姜鈞文.脾虛痰濁AS巴馬小豬模型建立及冠脈AS通路基因差異性表達[J].沈陽:遼寧中醫(yī)藥大學(xué),2016.

[17] 楊關(guān)林,張會永,龐琳琳.跑步運動聯(lián)合高脂單籠喂飼建立脾虛痰濁證動物模型[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2016,34(9):2056- 2060.

[18] 周鶴,張會永,龐琳琳，等.小型豬脾虛痰濁證模型評價量表研制與考評[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2016,18(9):71- 74.

[19] 楊茗茜.巴馬小型豬脾虛痰濁模型建立與評價[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué),2016.

[20] 李欣志,劉建勛,任建勛.痰瘀互結(jié)證冠心病小型豬模型的建立[J].中國中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2009,9(3):228- 232.

[21] 李思思,張琦,賴宇，等.溫陽消飲法對胸腔積液模型大鼠腎臟水通道蛋白2表達影響的研究[J].四川中醫(yī),2014,32(5):69- 70.

[22] 張艷敏,郭勇.腎臟水通道蛋白的研究進展[J].四川解剖學(xué)雜志,2003,11(2):29- 31.

[23] 安宇,張劍釗,李學(xué)軍.水通道蛋白的表達及其調(diào)節(jié)[J].國家藥學(xué)研究雜志,2008，35(5):355- 359.

[24] 宋囡,賈連群,王俊巖，等.脾虛證大鼠模型胃組織cAMP/PKA信號傳導(dǎo)通路變化的研究[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2015,21(6):653- 689.

[25] 冷雪,楊關(guān)林,賈連群，等.脾虛痰濁證大鼠主動脈cAMP/PKA信號通路變化的實驗研究[J].遼寧中醫(yī)雜志,2015,42(9):1789- 1791.

[26] 劉欣健,賈智明,文建國.水通道蛋白- 2及其在腎臟疾病中的研究進展[J].現(xiàn)代泌尿外科雜志,2015,20(12):914- 918.

Effect of Replenishing Spleen Qi Deficiency Phlegm Method on AQP in the as Kidney Tissue

SHI Yue- ping, JIA Lian- qun, SONG Nan, LIU Jing- jing, YANG Guan- linΔ

(Liaoning University of Traditionnal Chinese Medicine，Shenyang 110847, China)

Object：To observe the changes of kidney water channel protein and cAMP/PKA signal pathway with the spleen dificiency and phlegm atherosclerosis bana mini- pig model and effect of the replenishing spleen on the model. Method: Fifteen bama minipigs were randomly divided into normal group，model group and replenishing spleen group with five in each. The spleen dificiency and phlegm atherosclerosis model were instant by high fat diet combined tied by running after balloon injury in the coronary artery.The bama minipigs of normal group were fed normal basic diet for 48 weeks,model group were fed high fat and high calorie fodder for 48 weeks. The bana mini- pigs of replenishing spleen group were gived replenishing spleen recipe on the basis of the method on model group after 24 weeks. Observing Cyclic adenosine monophosphate(cAMP)、morphology and the protein expression of aquaporins (AQP)1、2、3、phosphorylation protein kinase A(p- PKA)、phosphorylated cAMP- response element binding protein(p- CREB) in the mini- pigs kidney after 48weeks.Result：Compared with normal group，morphology of kidney of the model group show the pathological damage in the glomerular and tubular，expression of AQP1、2、3 and cAMP/PKA/CREB pathway were reduced.Compared with normal group，replenishing spleen group increased expression of AQP1、2、3 and cAMP/PKA pathway in the bama mini- pigs kidney.Conclusion: Spleen deficienly and phlegm atherosclerosis model show morphology of the kidney and decrease of AQP1，2，3，methods for replenishing spleen can regulate abnormal water metabolism regulatory proteins，possibly related to cAMP/PKA pathway.

Method for replenishing spleen Qi; Spleen dificiency and phlegm; Atherosclerosis; Aquaporins

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臟象理論及應(yīng)用國家教育部重點實驗室開放基金資助項目(ZYZX1515);遼寧省中醫(yī)外治心血管系統(tǒng)疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心建設(shè)資助項目(2014225004)

石月萍(1968- )，女，遼寧鞍山人，教授，醫(yī)學(xué)博士，從事中醫(yī)藥防治心血管疾病的臨床與研究。

R285.5

B

1006- 3250(2017)07- 0939- 05

2017- 01- 15

△通訊作者：楊關(guān)林，男，黑龍江肇東人，教授，博士研究生導(dǎo)師，從事中醫(yī)藥防治心腦血管疾病與中醫(yī)藏象理論研究，Tel：024- 31207046，E- mail：yang_guanlin@163.com。