丹參通絡(luò)解毒湯對骨髓干細(xì)胞移植急性心肌梗死模型大鼠NF- κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)影響?

李鑫輝，李雅婧，黃淼鑫，許福麗，肖 青，郭晨鶴

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，長沙 410208)

【實驗研究】

丹參通絡(luò)解毒湯對骨髓干細(xì)胞移植急性心肌梗死模型大鼠NF- κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)影響?

李鑫輝，李雅婧，黃淼鑫，許福麗，肖 青，郭晨鶴

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，長沙 410208)

目的： 探討丹參通絡(luò)解毒湯對骨髓干細(xì)胞(BMSCs)移植急性心肌梗死(AMI)模型大鼠核因子- κB(NF- κB)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的影響。方法：80只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為SH組(假手術(shù)組)、AMI組(模型組)、BMSCs組(BMSCs移植組)、DSTLJD組(丹參通絡(luò)解毒湯組)、 DSTLJD+ BMSCs組(丹參通絡(luò)解毒湯+ BMSCs移植)各10只，BMSCs細(xì)胞懸液直接注入梗死區(qū)邊緣心肌組織，給予中藥或生理鹽水灌胃，4周后采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定各組大鼠血清腫瘤壞死因子- α(TNF- α)、白細(xì)胞介素- 6(IL- 6)的含量，免疫組化法觀察心肌核因子- κB(NF- κB)蛋白表達(dá)，并用HE染色觀察心肌組織形態(tài)病理變化。結(jié)果：與AMI組比較，BMSCs組、DSTLJD組、DSTLJD+ BMSCs組大鼠心肌NF- κB蛋白表達(dá)明顯降低，且血清炎癥因子TNF- α和IL- 6水平明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，心肌損傷程度明顯改善；DSTLJD+ BMSCs組優(yōu)于單純BMSCs組、單純DSTLJD組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：BMSCs移植聯(lián)合丹參通絡(luò)解毒湯能夠改善AMI 模型大鼠的心肌損傷，減輕炎癥反應(yīng)，修復(fù)缺血心肌，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié) NF- κB 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有關(guān)。

丹參通絡(luò)解毒湯；急性心肌梗死；核因子- κB；白細(xì)胞介素- 6；腫瘤壞死因子- α；炎癥反應(yīng)

急性心肌梗死(AMI)是心血管疾病致死及致殘的主要原因，且發(fā)病率逐年上升。近年來，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)因其取材方便、體外擴(kuò)增能力強(qiáng)、可來源于自身等優(yōu)勢[1]，移植到缺血梗死部位，在心臟微環(huán)境的影響下可以分化為心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等，進(jìn)而促進(jìn)心肌組織修復(fù)，調(diào)節(jié)梗死區(qū)域心肌細(xì)胞的凋亡，改善心臟功能，因而逐漸成為治療AMI的新途徑。同時有研究表明，中藥能改善干細(xì)胞移植的微環(huán)境，對干細(xì)胞的動員、歸巢、增殖和分化有優(yōu)勢互補(bǔ)、協(xié)同增效的作用[2- 3]。本研究的目的在于探討丹參通絡(luò)解毒湯聯(lián)合BMSCs移植對AMI鼠核因子- κB介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的影響。

1 實驗材料

1.1 動物

4～6周幼齡SD大鼠20只用以提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。SD大鼠80只，體質(zhì)量200～250 g用以造AMI模型；喂養(yǎng)方式為普通飼料,自由飲食，12 h/12 h明暗環(huán)境交替，實驗動物購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心(許可證號SYXK(湘)2013- 0005)。

1.2 藥物和主要試劑

NF- κB免疫組化試劑盒，中杉金橋生物有限公司；TNF- α、IL- 6 酶聯(lián)免疫吸附試劑盒，武漢博士德有限公司。丹參通絡(luò)解毒湯組成：丹參15 g，當(dāng)歸15 g，紅花10 g，玄參15 g，檀香10 g，水蛭6 g，黃芪30 g，川芎10 g，黃芩10 g，梔子15 g，黃連6 g等)。浸泡、去渣，水煎濃縮至藥液濃度0.35 g·ml-1(含生藥)，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供。

1.3 主要儀器

動物呼吸機(jī)DW- 2000型,上海嘉鵬科技有限公司；顯微攝像系統(tǒng)Motic B5型，麥克奧迪實業(yè)集團(tuán)公司；CO2培養(yǎng)箱Galaxy型，英國New Brunswick公司；多道生理信號采集處理系統(tǒng)RM- 6280型,成都儀器廠制造。

2 方法

2.1 BMSCs的制備和培養(yǎng)

采用全骨髓貼壁法結(jié)合密度梯度離心法進(jìn)行分離培養(yǎng)。拉頸法處死,75%酒精中浸泡10～15 min,收集股骨髓腔中的細(xì)胞，加入含有15%胎牛血清的完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)，經(jīng)多次換液和消化后獲得第三代BMSCs。鑒定方法：采用流式細(xì)胞儀檢查細(xì)胞表面抗原，標(biāo)準(zhǔn)為CD34 陽性率低于5%，且CD90、CD44 陽性率高于95%，即可認(rèn)為該細(xì)胞為高純度的BMSCs[4]。

2.2 造模方法

大鼠用10%水合氯醛按照體質(zhì)量250 g·ml-1腹腔麻醉后固定，記錄標(biāo)準(zhǔn)II導(dǎo)聯(lián)心電圖。氣管切開并連接動物呼吸機(jī)，打開胸腔暴露心臟，于左心耳下左冠狀動脈前降支上1/3處穿線，在線兩段各穿一結(jié)扎環(huán)以阻斷冠脈血流。以心電圖QRS波群增高增寬、ST段抬高、心肌顏色發(fā)紺為結(jié)扎成功[5- 6]。

2.3 分組及給藥

80只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為SH組(假手術(shù)組)、AMI組(AMI模型組)、BMSCs組(BMSCs移植組)、DSTLJD組(丹參通絡(luò)解毒湯組)、 DSTLJD+ BMSCs組(丹參通絡(luò)解毒湯+ BMSCs 移植組)5組各10只。除假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎外，其余組行AMI術(shù)，并在造模成功后30 min，于心肌梗死區(qū)邊緣心肌組織的3個位點直接注入共100 μL(含細(xì)胞數(shù)3×106)的BMSCs細(xì)胞懸液，假手術(shù)組和AMI組則注入100 μL的PBS緩沖液。術(shù)后連續(xù)14 d丹參通絡(luò)解毒湯組與參通絡(luò)解毒湯+ BMSCs 移植組分別灌胃丹參通絡(luò)解毒湯10 ml·kg-1·d-1，余各組用等量生理鹽水灌胃。

2.4 心肌組織病理改變的觀察

處死大鼠取出心臟，用冰冷的生理鹽水沖洗后，取缺血處心肌組織置于多聚甲醛中固定后，常規(guī)石蠟包埋切片，經(jīng)HE染色后觀察心肌組織的病理改變。

2.5 血清TNF- α、IL- 6水平檢測

通過腹主動脈采集大鼠全血，離心后取血清用ELISA法測定，嚴(yán)格按試劑說明書進(jìn)行操作。

2.6 心肌NF- κB蛋白表達(dá)檢測

大鼠處死后，取心肌梗死區(qū)制作成切片，嚴(yán)格按照免疫組化試劑說明書操作。在光學(xué)顯微鏡下400倍放大拍照，每張切片在近梗死區(qū)隨機(jī)觀察5個視野，每組共50個視野，用彩色病理圖像分析系統(tǒng)測量平均灰度。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 對心肌組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

圖1顯示，HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組心肌組織未見明顯的病理形態(tài)異常改變；AMI組大鼠心肌組織可以觀察到心肌細(xì)胞變性、壞死，肌束排列不整齊，心肌間質(zhì)有大量炎性細(xì)胞浸潤，細(xì)胞明顯腫脹，病理學(xué)改變較為明顯；BMSCs移植組和DSTLJD組大鼠心肌細(xì)胞有炎性細(xì)胞浸潤，細(xì)胞腫脹輕度，肌束紊亂程度較輕，且腫脹及肌束紊亂程度較AMI組明顯改善；DSTLJD+ BMSCs組肌束排列較整齊，細(xì)胞腫脹輕度，炎性細(xì)胞浸潤改善，細(xì)胞溶解情況減少。

圖1 各組大鼠心肌病理形態(tài)比較(HE染色 ×400)注：A.SH組； B.AMI組； C.BMSCs組； D. DSTLJD組； E.DSTLJD+BMSCs組

3.2 丹參通絡(luò)解毒湯對大鼠血清TNF- α、IL- 6的影響

表1顯示，與AMI組比較，BMSCs組、DSTLJD組和DSTLJD+ BMSCs組TNF- α、IL- 6水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；BMSCs組與DSTLJD組比較，TNF- α、IL- 6水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與BMSCs組和DSTLJD組比較,DSTLJD+ BMSCs組TNF- α、IL- 6水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。研究顯示，丹參通絡(luò)解毒湯可以明顯降低TNF- α、IL- 6水平，當(dāng)聯(lián)合BMSCs移植時效果更強(qiáng)。

表1 丹參通絡(luò)解毒湯對大鼠血清TNF- α、IL- 6水平的影響

注：與SH組比較：*P<0.05，**P<0.01；與AMI組比較：#P<0.05，##P<0.01；與BMSCs組比較：△P<0.05，△△P<0.01；與DSTLJD組比較：▲P<0.05，▲▲P<0.01

3.3 丹參通絡(luò)解毒湯對心肌NF- κB蛋白表達(dá)的影響

表2圖2顯示，與AMI組比較，BMSCs組、DSTLJD組和DSTLJD+ BMSCs組大鼠心肌NF- κBp65蛋白表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；BMSCs組與DSTLJD組比較，大鼠心肌NF- κBp65蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與BMSCs組和DSTLJD組比較, DSTLJD+ BMSCs組大鼠心肌NF- κBp65蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。研究顯示，丹參通絡(luò)解毒湯可以明顯降低大鼠心肌NF- κBp65蛋白表達(dá)，當(dāng)聯(lián)合BMSCs移植時效果更強(qiáng)。

表2 丹參通絡(luò)解毒湯對心肌NF- κB蛋白表達(dá)平均灰度比較(平均灰度

注：與SH組比較：*P<0.05，**P<0.01；與AMI組比較：#P<0.05，##P<0.01；與BMSCs組比較：△P<0.05，△△P<0.01；與DSTLJD組比較：▲P<0.05；▲▲P<0.01

圖2 各組大鼠NF- κBp65蛋白表達(dá)的免疫組化染色檢測(SP×400)注：A.SH組； B.AMI組； C.BMSCs組； D.DSTLJD組； E.DSTLJD+BMSCs組

4 討論

心肌梗死后，由于組織缺血缺氧等因素激活自身病理性免疫炎癥調(diào)節(jié)系統(tǒng)，誘導(dǎo)心肌組織細(xì)胞壞死、凋亡等梗死后效應(yīng)。機(jī)體為清除壞死細(xì)胞又進(jìn)一步激活炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致心肌組織損傷加重[7- 8]。BMSCs作為一種存在于骨髓組織中具有自我增殖及能分化為心肌組織細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞潛能的多能干細(xì)胞。有研究顯示，BMSCs不僅具有獨特的免疫學(xué)特性，還能在移植后宿主體內(nèi)存活并對AMI后病理性免疫反應(yīng)起到一定的調(diào)節(jié)作用[9]。然而組織缺血、缺氧損傷發(fā)生后會出現(xiàn)相應(yīng)的炎癥反應(yīng)及病理變化,造成缺血損傷微環(huán)境對BMSCs存活率產(chǎn)生影響。有研究表明，中藥干預(yù)BMSCs可為BMSCs移植提供良好的微環(huán)境作用，可促進(jìn)BMSCs的歸巢、定植以及分化，為BMSCs移植提供良好的微環(huán)境，從而提高移植后的成活率，對缺血心肌保護(hù)作用具有增強(qiáng)促進(jìn)作用[10]。

NF- κB是介導(dǎo)炎癥因子釋放的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子，正常生理狀況下，其以無活性狀態(tài)與抑制性蛋白IκB結(jié)合以同源二聚體形式存在，當(dāng)多種病理因素刺激時，NF- κB與IκB解體而被磷酸化激活，進(jìn)而調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄，釋放相關(guān)炎癥因子，如IL- 6、TNF- α等[11]。同時TNF- α、IL- 6等物質(zhì)的釋放不僅能損傷心肌細(xì)胞，還可以通過機(jī)體反饋作用維持NF- κB的活性，使心肌損傷不斷加重。本實驗結(jié)果顯示，干細(xì)胞移植和丹參通絡(luò)解毒湯都可以明顯抑制AMI炎癥反應(yīng)，減少心肌NF- κB蛋白表達(dá)，降低TNF- α、IL- 6水平，改善心肌病理形態(tài)，且兩者保護(hù)作用相當(dāng)；而丹參通絡(luò)解毒湯聯(lián)合干細(xì)胞移植對心肌保護(hù)作用最強(qiáng)，兩者具有相互促進(jìn)作用。因此我們推測丹參通絡(luò)解毒湯保護(hù)心肌的重要機(jī)理之一，可能是處方改善BMSCs移植、增殖、分化的微環(huán)境，增加BMSCs歸巢量，通過細(xì)胞的旁分泌作用，促使干細(xì)胞分泌一些有益細(xì)胞因子，降低心肌NF- κB蛋白表達(dá)，從而降低血清TNF- α、IL- 6水平，抑制急性心肌梗死后炎癥反應(yīng)進(jìn)而保護(hù)心肌。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，急性心肌梗死屬于胸痹心痛、真心痛等范疇。人體感受外邪和內(nèi)邪積聚體內(nèi)，日久化熱化毒，形成瘀熱壅毒、毒損心營、閉阻心脈引發(fā)心肌梗死。丹參通絡(luò)解毒湯是在《溫病條辨》清營湯和《時方歌括》丹參飲基礎(chǔ)上，結(jié)合葉天士絡(luò)病理論及臨床實踐化裁而來。方中丹參活血化瘀、清心止痛，玄參清營養(yǎng)陰、瀉火解毒，二者共為君藥，臣藥有當(dāng)歸、川芎、紅花、檀香行氣活血、通絡(luò)止痛。黃芩、黃連、梔子瀉火解毒，又由于冠心病病程反復(fù)發(fā)作，邪踞日久，耗氣傷正，方中佐以黃芪益氣扶正，以增加益氣活血功效。加水蛭增強(qiáng)活血通絡(luò)作用，借其“蠕動之物可以松透病根”而直入絡(luò)分搜剔血絡(luò)，全方具有活血通絡(luò)、清營解毒、益氣養(yǎng)陰的功效，臨床治療冠心病取得一定的療效[12]。范桄溥[13]采用抑制IκBα及NF- κB激活的心肌梗死模型小鼠，結(jié)果顯示IL- 6、TNF- α的生成減少，梗死后炎癥反應(yīng)及心肌細(xì)胞損傷均減輕。李靜等[14]發(fā)現(xiàn)，玄參提取物降低炎癥細(xì)胞因子 TNF -α、IL- 6的濃度，抑制NF-kB的過量表達(dá)，從而對心肌具有明顯保護(hù)作用。

綜上所述，炎癥反應(yīng)在急性心肌梗死發(fā)生發(fā)展過程中具有重要影響。通過調(diào)節(jié)AMI后免疫炎癥反應(yīng)來減輕心肌組織缺血性損傷至關(guān)重要，而丹參通絡(luò)解毒湯聯(lián)合BMSCs移植，可以抑制AMI大鼠炎癥反應(yīng)，保護(hù)缺血心肌，其機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)NF- κB實現(xiàn)的。

[1] DHARMASAROJA P.Bone marrow- derived mesenchymal stem cells for the treatment of ischemic stroke[J].J Clin Neurosci,2009,16(1):12- 20.

[2] 李慶雯,譚俊珍,南亞昀,等.丹酚酸B干預(yù)內(nèi)皮祖細(xì)胞對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌分化早期基因表達(dá)的影響[J].中國老年學(xué)雜志,2010,30(1):49- 45.

[3] 李慧影，馬亞珂，楊岳，等.中藥干預(yù)骨髓干細(xì)胞治療缺血性心臟病研究進(jìn)展[J].湖北中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2015,17(6):107- 109.

[4] 李鑫輝，吳若霞，廖菁，等.柴胡疏肝散聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對心肌梗死大鼠心肌的保護(hù)作用[J].上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2015,29(5):57-60.

[5] 李鑫輝，黃政德，葛金文，等．味丹參飲對心肌IRI大鼠骨髓干細(xì)胞動員作用的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2014，12(6)：723- 725.

[6] 李鑫輝，黃政德，謝雪姣，等．疏肝活血中藥對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植心肌缺血再灌注損傷大鼠心功能和心肌病理形態(tài)的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2014，21(8)：54- 56.

[7] FRANGOGIANNIS N G. Regulation of the inflammatory response in cardiac repair[J]. Circ Res,2012,110(1)：159- 173.

[8] 李麗，龍子江，黃靜，等．黃精多糖對急性心肌梗死模型大鼠NF- κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及心肌組織形態(tài)的影響[J].中草藥，2015，46(18)：2750- 2754.

[9] 李雅婧，李鑫輝，黃淼鑫，等.解毒活血通絡(luò)法對骨髓干細(xì)胞移植急性心肌梗死模型大鼠NF- κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的影響[C].棗莊：第三次全國溫病學(xué)論壇暨溫病學(xué)辨治思路臨床拓展應(yīng)用高級研修班論文集，2016: 201- 208.

[10] 李慧影,馬亞珂,楊岳,等.中藥干預(yù)骨髓干細(xì)胞治療缺血性心臟病研究進(jìn)展[J].湖北中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2015,17(6)：107- 109.

[11] BUJAK M, FRANGOGIANNIS N G. The role of IL- 1 in the pathogenesis of heart disease [J]. Arch ImmunolTherExp, 2009, 57(3): 165- 176.

[12] 李雅婧，李鑫輝，黃淼鑫，等. 李鑫輝教授治療冠心病經(jīng)驗 [J]. 中國中醫(yī)急癥，2015，24(11)：1954- 1955.

[13] 范桄溥.Tisp40在心肌梗死炎癥反應(yīng)中的作用與機(jī)制研究 [D]. 武漢: 華中科技大學(xué), 2012.

[14] 李靜，陳長勛，高陽，等.玄參提取物抗炎與抗動脈硬化作用的探索[J]. 時珍國醫(yī)國藥，2010，21(3): 532- 534.

Effects of Danshen Tongluo Jiedu Decoction on NF-kappa B Mediated Inflammatory Response in Bone Marrow Stem Cell Transplantation Rats With Acute Myocardial Infarction

LI Xin- hui， LI Ya- jing， HUANG Miao- xin, XU Fu- li, XIAO Qing, GUO Chen- he

(Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208,China)

Objective: To explore the effect of Danshen Tongluo Jiedu Decoction on the inflammatory reaction mediated by NF- κB in acute myocardial infarction (AMI) rats by Bone marrow stem cell transplantation.Methods:The whole bone marrow adherent method was adopted for BMSCs separation and culture. The AMI model was established by closing the left anterior descending coronary artery of SD rats. SD rats were randomly divided into SH (sham group), AMI group (acute myocardial infarction group), BMSCs (BMSCs transplantation group), DSTLJD group (Danshen Tongluo Jiedu group), DSTLJD + BMSCs group (Danshen Tongluo Jiedu combined with BMSCs transplantation group), 10 in each group. BMSCs cell suspension injected directly into the edge of the myocardial tissue infarction area; Chinese medicine or physiological saline were administered by gavage.4 weeks later, by using enzyme- linked immunosorbent (ELISA) measure each group rats serum TNF -α、IL- 6 content was detected. Using immunohistochemical method to observe the myocardial NF- κB protein expression, and HE staining to observe the myocardial tissue pathological changes. Results: Compared with The AMI group, BMSCs, DSTLJD group, DSTLJD + BMSCs group rats serum level of TNF- α、IL- 6 and myocardial nuclear factor NF- κB protein expression were significantly reduced, the difference has statistically significant,the degree of myocardial injury was significantly improved; DSTLJD + BMSCs group was better than that of pure stem cell transplantation, and simple DSTLJD group, the difference has statistically significant.Conclusion: Bone marrow stem cell transplantation combined with Danshen Tongluo Jiedu Decoction can improve the myocardial injury, reduced the inflammatory reaction, and repair the ischemic myocardium in AMI rats. The mechanisms may be related to regulate the inflammatory reaction mediated by NF- κB.

Danshen Tongluo Jiedu Decoction; Acute myocardial infarction; NF- κB; IL- 6; TNF- α; Inflammatory reaction

湖南省教育廳科學(xué)研究重點項目(15A143);湖南省中醫(yī)藥科研計劃項目(201559)；國家中醫(yī)藥管理局重點學(xué)科“中醫(yī)各家學(xué)說”開放基金項目(2014GJXS02)

李鑫輝(1974-)，男，山西長治人，副教授，醫(yī)學(xué)博士，碩士研究生導(dǎo)師，從事心血管疾病的臨床與研究。

R285.5

B

1006- 3250(2017)07- 0931- 03

2016- 12- 15