抗性和敏感生物型菵草代謝精唑禾草靈的速度差異

顏欣茹+楊俊雪+薛君+劉嘉慧+李凌緒

摘要：為了測定菵草抗性生物型SD-04-SS和敏感生物型SD-12對精唑禾草靈代謝速度的差異，建立了精唑禾草靈及其主要代謝產(chǎn)物精唑禾草酸、6-氯苯并唑酮的高效液相色譜（HPLC）分析方法。結(jié)果表明，在0.123～30.000 μg/mL范圍內(nèi)、0.977～1 000.000 μg/mL范圍內(nèi)、0.469～30.000 μg/mL范圍內(nèi)6-氯苯并唑酮、精唑禾草酸、精唑禾草靈濃度與響應值線性關系良好，相關系數(shù)（r）分別為0.991 2、0972 2、0.996 3。應用上述方法分析發(fā)現(xiàn)，精唑禾草靈處理后2 h在菵草體內(nèi)即可檢測到精唑禾草酸和6-氯苯并唑酮，藥后2～96 h抗性生物型SD-04-SS體內(nèi)精唑禾草靈的含量始終略高于敏感生物型SD-12，藥后24～72 h抗性生物型SD-04-SS體內(nèi)精唑禾草酸的含量顯著低于敏感生物型SD-12，說明抗性生物型降解精唑禾草酸的速度比敏感生物型更快。

關鍵詞：菵草；精唑禾草靈；代謝；高效液相色譜；除草劑抗性

中圖分類號：S482.4文獻標志碼：A文章編號：1003-935X（2017）01-0015-05

Differences in Metabolism Rate of Fenoxaprop-P-Ethyl Among

Beckmannia syzigachne Biotypes

YAN Xinru，YANG Junxue，XUE Jun，LIU Jiahui，LI Lingxu

（Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China）

Abstract： An HPLC method was developed to analyze the concentration of fenoxaprop-P-ethyl，fenoxaprop-P and 6-chlorobenzoxazolone in Beckmannia syzigachne，and to determine differences in the rate of fenoxaprop-P-ethyl degradation between the resistant biotype SD-04-SS and susceptible biotype SD-12. Excellent linearity was obtained in the range of 0.123-30 μg/mL，0.977-1000 μg/mL and 0.469-30 μg/mL for 6-chlorobenzoxazolone，fenoxaprop-P and fenoxaprop-P-ethyl，respectively，with correlation coefficient of 0.9912，0.9722 and 0.9963，respectively. The method was employed to analyze the concentration of fenoxaprop-P-ethyl，fenoxaprop-P and 6-chlorobenzoxazolone in both biotypes. Fenoxaprop-P and 6-chlorobenzoxazolone could be detected in B. syzigachne 2 hours after treatment with fenoxaprop-P-ethyl. The concentration of fenoxaprop-P-ethyl in SD-04-SS （R） was always higher than that in SD-12 （S） within 2～96 hours after treatment （HAT），but the concentration of fenoxaprop-P in

收稿日期：2016-12-20

基金項目：國家自然科學基金（編號：31301680）；青島農(nóng)業(yè)大學2015年大學生科技創(chuàng)新基金。

作者簡介：顏欣茹（1995—），女，本科生。E-mail：2323458818@qq.com。

通信作者：李凌緒，博士，副教授，主要從事雜草抗藥性研究。E-mail：lingxulipvi@126.com。SD-04-SS （R） was always higher than that in SD-12 （S） within 24～72 hours. Thefore the resistant biotype SD-04-SS degrades fenoxaprop-P faster than the susceptible biotype SD-12.

Key words： Beckmannia syzigachne；fenoxaprop-P-ethyl；metabolism；HPLC；herbicidal resistance

菵草（Beckmannia syzigachne）為禾本科菵草屬一年生雜草，是長江中下游地區(qū)稻茬麥田的主要雜草之一[1-3] 。精唑禾草靈（fenoxaprop-P-ethyl）屬于乙酰輔酶A羧化酶（ACCase）抑制劑類除草劑，是小麥田苗后選擇性防治禾本科雜草的主要除草劑品種之一。精唑禾草靈在禾本科雜草體內(nèi)代謝為精唑禾草酸（fenoxaprop-P）起到除草作用，精唑禾草酸進一步代謝為6-氯苯并唑酮（6-chlorobenzoxazolone）等化合物后失去除草效果[4-5]。我國自1990年代開始應用精唑禾草靈防除稻茬麥田菵草，如今江蘇、安徽、山東等部分地區(qū)的菵草已對精唑禾草靈產(chǎn)生了抗性[6-9]。筆者所在課題組發(fā)現(xiàn)采自山東省魚臺縣的SD-04生物型對精唑禾草靈產(chǎn)生了236.8倍抗性，克隆其ACCase序列測序比對后在其ACCase CT亞基上鑒定出了已知的抗性位點Gly-2 096-Ala[10]。應用CAPS技術從SD-04生物型中分離到2 096 位等位基因野生型SD-04-SS，經(jīng)生物測定后發(fā)現(xiàn)SD-04-SS對精唑禾草靈仍然有635倍抗性[11]，可見SD-04-SS很可能存在對精唑禾草靈的非靶標抗性，代謝速度差異可能是其抗性機理之一。為了明確SD-04-SS與敏感型菵草代謝精唑禾草靈的速度是否存在差異，本研究建立了分析菵草體內(nèi)精唑禾草靈及其主要代謝產(chǎn)物精唑禾草酸、6-氯苯并唑酮含量的高效液相色譜（HPLC）方法，并測定了抗性生物型菵草SD-04-SS和敏感型菵草SD-12體內(nèi)精唑禾草靈及其主要代謝產(chǎn)物精唑禾草酸的含量，以明確抗性生物型SD-04-SS和敏感生物型SD-12代謝精唑禾草靈及精唑禾草酸速度的差異。

1 材料與方法

1.1 材料

供試雜草：抗性生物型菵草SD-04-SS是分離自精唑禾草靈抗性生物型SD-04的等位基因野生型植株，敏感生物型SD-12采自山東省泰安市渿河公園。

供試藥劑：精唑禾草靈對照品（阿拉丁）、精唑禾草酸對照品（Dr. Ehrenstorfer GmbH）、6-氯苯并唑酮對照品（Sigma-Aldrich）、95%精唑禾草靈原藥（山東濱農(nóng)科技有限公司）、甲醇（色譜純）、超純?nèi)ルx子水，其余試劑均為分析純。

儀器：Agilent 1200型高效液相色譜儀（含VWD紫外檢測器）、手動進樣器、柱溫箱、工作站（美國安捷倫公司）；3WP-2000型自行式噴霧塔（農(nóng)業(yè)部南京農(nóng)業(yè)機械化研究所）。

1.2 方法

1.2.1 雜草培養(yǎng)與樣品制備 菵草種子萌發(fā)參考Li等的方法[12]，待種子萌發(fā)后種入裝有壤土的塑料花盆中（直徑20cm），每盆植入8株，在溫室內(nèi)培養(yǎng)至兩葉一心期間苗，保留長勢一致的5株幼苗，然后剪去地上部分，待其長出新葉以增加受藥的面積。菵草重新長到三葉一心期時用3WP-2000型自行式噴霧塔噴施精唑禾草靈，用量為310.5 g a.i./hm2。分別在藥劑處理后2、8、24、48、72、96、144 h剪下地上部分，稱質(zhì)量，立即在液氮中磨碎，加入3倍體積（V/m）甲醇室溫下微波振蕩提取60 min，提取液12 000 r/min離心，取上清液。上清液用氮氣吹干，用5 mL甲醇重新溶解定容，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，取濾液作為供試樣品溶液。試驗中以每3盆菵草為1個處理，每處理重復3次。

1.2.2 分析方法

1.2.2.1 色譜條件 色譜柱為Shim-pack VP-ODS-C18柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為甲醇 ∶ 水=8 ∶ 2，體積流量為0.8 mL/min，檢測波長為238 nm，進樣量為20 μL，柱溫為25 ℃。

1.2.2.2 線性關系 考察精密稱取6-氯苯并唑酮，用甲醇配制成0.123～30 μg/mL的系列標準溶液，取上述系列標準溶液進樣 10 μL，以峰面積積分值為縱坐標、質(zhì)量濃度為橫坐標制作標準曲線。同法測得其他2種成分的回歸方程和線性范圍。

1.2.2.3 加樣回收率 試驗精密稱取精唑禾草靈、精唑禾草酸、6-氯苯丙唑酮3種對照品各1 mg，用甲醇溶解，配制成3種藥品的濃度均為 100 μg/mL 的混合溶液。取未噴施精唑禾草靈的菵草，按“1.2.1”節(jié)的方法制得提取液，用提取液將上述藥品混合溶液稀釋成1、10、30 μg/mL，分別進樣，測定3種對照品在不同濃度下的回收率（n=3）。

1.2.3 不同生物型菵草代謝精唑禾草靈速度差異的分析 取供試樣品溶液，進樣20 μL，以外標法用峰面積積分值計算菵草中精唑禾草靈、精唑禾草酸和6-氯苯并唑酮的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 分析方法

在上述色譜條件下，檢測得目標化合物精唑禾草靈、精唑禾草酸和6-氯苯并唑酮的保留時間分別是15.841、4.489、3.364 min，分離度良好（圖1）。

線性關系考察得到6-氯苯并唑酮的回歸方程為y=66.448x+46.056，r2=0.991 2，線性范圍為0.123～30.000 μg/mL；精唑禾草酸回歸方程為y=52.478x+1 971.1，r2=0.972 2，線性范圍為0.977～1 000.000 μg/mL；精唑禾草靈回歸方程為y=87.726x+38.241，r2=0.996 3，線性范圍為0.469～30.000 μg/mL。

加樣回收率試驗結(jié)果（表1）表明，精唑禾草靈的回收率在91.0%～98.0%之間，RSD為53%～7.9%；精唑禾草酸的回收率在80.0%～112.1%之間，RSD為4.9%～12.5%；6-氯苯丙唑酮回收率在96.0%～104.0%之間，RSD為7.8%～12.6%。

2.2 不同生物型菵草代謝精唑禾草靈速度差異的分析

2.2.1 樣品中精唑禾草靈含量的變化 在藥后2～144 h，SD-04-SS生物型和SD-12生物型中精唑禾草靈的含量呈不斷下降趨勢，SD-04-SS生物型精唑禾草靈的含量總體略高于SD-12生物型。SD-04-SS生物型和SD-12生物型中精唑禾草靈的含量在藥后2 h到藥后 8 h 略有下降，在施藥后8 h后開始快速下降，施藥后 72 h 后精唑禾草靈含量下降的速度趨緩，施藥后 96 h 后SD-04-SS生物型和SD-12生物型的精唑禾草靈含量已基本相同（表2）。

2.2.2 樣品中精唑禾草酸含量的變化 精唑禾草酸是精唑禾草靈在雜草體內(nèi)被水解后的產(chǎn)物，是起到除草作用的活性成分。由表3可知，在施藥后2 h即可在菵草中檢測到精唑禾草酸，說明精唑禾草靈在施用后很快就被菵草吸收降解，這與前人在土壤微生物和大穗看麥娘上的研究[13-14]一致。在藥后2～144 h，SD-04-SS生物型和SD-12生物型中精唑禾草酸的含量呈不斷上升的趨勢。藥后2、8 h，SD-04-SS生物型和 SD-12生物型精唑禾草酸的含量并無明顯差異，但藥后24～144 h生物型SD-12的精唑禾草酸含量顯著高于抗性生物型SD-04-SS，說明在此時間段內(nèi)抗性生物型SD-04-SS降解精唑禾草酸的速度快于敏感生物型 SD-12，這與2種生物型對精唑禾草靈的敏感性呈現(xiàn)負相關。

2.2.3 樣品中6-氯苯并唑酮含量的變化 精唑禾草酸在雜草體內(nèi)進一步代謝為6-氯苯丙唑酮后失去除草活性，經(jīng)HPLC測定，抗性生物型SD-04-SS和敏感生物型SD-12生物型體內(nèi)6-氯苯丙唑酮的含量呈緩慢增加趨勢，在施藥后2 h即可檢測到6-氯苯丙唑酮的存在（表4），說明敏感生物型和抗性生物型都能具備把精唑禾草酸降解為6-氯苯丙唑酮的能力。在施藥后2～144 h，敏感生物型和抗性生物型菵草體內(nèi)6-氯苯丙唑酮含量均無規(guī)律性變化，說明6-氯苯丙唑酮含量不能體現(xiàn)菵草是否存在對精唑禾草靈的抗性，類似的現(xiàn)象曾在小麥和敏感馬唐、抗性大穗看麥娘和敏感大穗看麥娘之間觀察到過[2-3]。

3 結(jié)論與討論

精唑禾草酸是精唑禾草靈在雜草體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物，是起到除草作用的活性成分，被進一步代謝為6-氯苯丙唑酮后失去活性。雜草可通過降低精唑禾草靈水解的速度或加速精唑禾草酸的降解以降低體內(nèi)精唑禾草酸的含量，減輕或免受除草劑的毒害作用。在雜草抗性研究中，一般采用放射性同位素標記-高效液相色譜法對目標化合物進行分析。該方法靈敏可靠，可對樣品進行定性和定量分析，但同位素標記試劑會損害身體健康、價格昂貴、廢棄物難以處理，而且需要在專門的實驗室借助于專門設備才能進行。高效液相色譜分離效率高、靈敏、快速、準確，相比放射性同位素標記法其成本低廉、對人體健康影響小、廢棄物易處理。本研究建立的精唑禾草靈及其主要代謝產(chǎn)物的HPLC分析方法穩(wěn)定、可靠，能反映出不同生物型菵草降解精唑禾草靈和精唑禾草酸速度的差異，具有更好的適用性。

本研究發(fā)現(xiàn)，在施藥后2 h就能在菵草體內(nèi)檢測到精唑禾草酸和6-氯苯丙唑酮的存在，說明菵草很快就能吸收精唑禾草靈并進行代謝反應。從藥后24 h開始，敏感生物型體內(nèi)的精唑禾草酸含量顯著高于抗性生物型，說明抗性生物型 SD-04-SS降解活性成分精唑禾草酸的速度顯著快于敏感生物型SD-12，這是SD-04-SS生物型對精唑禾草靈產(chǎn)生抗性的代謝基礎。

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