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    布渣葉總黃酮大孔吸附樹脂純化工藝研究

    2017-08-30 13:38:22李智勇孫冬梅王洛臨
    中醫(yī)藥信息 2017年5期
    關鍵詞:大孔刻度容量瓶

    李智勇,孫冬梅*,王洛臨

    (1.廣東省中醫(yī)藥工程技術研究院,廣東 廣州 510095;2.廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點實驗室,廣東 廣州 510095)

    布渣葉總黃酮大孔吸附樹脂純化工藝研究

    李智勇1,2,孫冬梅1,2*,王洛臨1,2

    (1.廣東省中醫(yī)藥工程技術研究院,廣東 廣州 510095;2.廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點實驗室,廣東 廣州 510095)

    目的:確定布渣葉總黃酮(total flavonoids inMicrocospaniculataL.,TFMP)的大孔吸附樹脂純化工藝參數。方法:采用單因素試驗法篩選適宜的大孔樹脂;并對其純化工藝條件進行優(yōu)化。結果:D101分離TFMP的工藝條件為上柱藥液濃度為0.15 g/mL,上柱流速0.5 BV/h,上樣體積8.5 BV,樹脂柱徑高比為1∶8,以5 BV水洗脫,洗脫溶劑為80%的乙醇,洗脫流速1 BV/h,洗脫體積3.75 BV,大孔樹脂可重復利用5次,TFMP純化后含量達84.09%,精制度達220.03%。結論: D101可以用于富集,純化TFMP。

    布渣葉總黃酮;大孔吸附樹脂;純化工藝

    布渣葉為椴樹科植物破布葉(MicrocospaniculataL.)的葉,具有消食化滯,清熱利濕等功效,主要含有黃酮、生物堿、三萜、揮發(fā)油等化合物。前期研究發(fā)現(xiàn),布渣葉提取物能顯著降低高脂血癥小鼠模型血清中總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)的含有量,其中黃酮類化合物為其主要有效成分。本研究在前期布渣葉總黃酮提取研究的基礎上[1],采用大孔樹脂進行純化工藝研究,為其有關制劑提供物質基礎。

    1 儀器與試藥

    紫外分光光度計UV PC-2550(島津);Sartorius BP 211D電子分析天平;Agilent 6890-5973N GC-MS氣質聯(lián)用儀;Agilent 7694E頂空進樣器;大孔吸附樹脂:D101(天津市海光化工有限公司),AB-8(南開大學化工廠),HPD100、HPD300、HPD400、HPD450(河北滄州寶恩化工有限公司)。

    布渣葉藥材購于廣州養(yǎng)和醫(yī)藥有限公司,經廣東省中醫(yī)藥工程技術研究院孫冬梅主任中藥師鑒定為正品;TFMP提取物(自制);蘆丁對照品(080-9303,中國藥品生物制品檢定所);藥用乙醇(廣寧縣順寧葡萄糖藥業(yè)有限公司);鹽酸,氫氧化鈉,亞硝酸鈉,硝酸鋁均為分析純。

    2 方法與結果

    2.1 TFMP的UV測定

    2.1.1 對照品溶液的配制

    精密稱取在120℃干燥至恒重的蘆丁對照品20.5 mg置100 mL容量瓶中,加70%乙醇至刻度,搖勻,制成每1 mL含0.205 mg蘆丁的對照品溶液。

    2.1.2 供試品溶液的配制

    取布渣葉提取物(約相當于2.5 g布渣葉),精密稱定,置具塞三角瓶中,精密加入70%乙醇50 mL,密塞,稱定重量,超聲處理(功率200 W,頻率40 KHz)1 h,放冷,再稱定重量,用70%乙醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取濾液,即得[2]。

    2.1.3 方法學考察

    精密吸取對照品溶液0,0.5,1.0,2.0,3.0,4.0和5.0 mL,分別置25 mL容量瓶中,加水至6 mL,加5%亞硝酸鈉溶液1 mL,搖勻,放置6 min,加10%硝酸鋁溶液1 mL,搖勻,放置6 min,加氫氧化鈉試液5 mL,再加水至刻度,搖勻,放置15 min;以相應試劑為空白,測定500 nm處吸光度[2],以吸光度(A)為縱坐標,濃度為橫坐標(C),繪制標準曲線,得回歸方程A=0.011 49 C-0.009 64(r=0.999 63),表明線性良好。取同一供試品溶液,在顯色后5,10,15,20,25,30 min測定,結果顯示經過20 min后吸光度明顯下降,因此控制測定時間在顯色后20 min以內。

    2.1.4 測定法

    精密量取供試品溶液0.2 mL,置25 mL容量瓶中,照“2.1.3”項下的方法,自“加水至6 mL”起,依法測定吸光度,從標準曲線上讀取濃度,計算總黃酮含量。經測定,本實驗用布渣葉中總黃酮含量為6.81%。

    2.2 TFMP的大孔吸附樹脂純化工藝研究

    2.2.1 布渣葉提取液的制備

    取布渣葉500 g,照優(yōu)選的提取工藝提取,回收乙醇,濃縮至無醇味,加入一倍量的蒸餾水,攪勻,靜置過夜,濾過,沉淀物用水洗滌2次,洗滌液與濾液合并,置1 000 mL容量瓶中,加水至刻度,搖勻,即得。依法測定吸光度并計算總黃酮的得率為6.29%。

    2.2.2 大孔吸附樹脂的選擇[3]

    稱取已預處理[4]的HPD100、HPD300、HPD400、HPD450、AB-8、D101等大孔吸附樹脂各3 g,置100 mL具塞三角瓶中,加入30 mL布渣葉提取液,搖床振搖12 h,過濾,大孔吸附樹脂以30 mL水洗滌,合并水洗液和濾液,轉移至100 mL容量瓶中,加水至刻度,搖勻,備用;樹脂轉移至100 mL具塞三角瓶中,加入乙醇25 mL,超聲處理(功率200 W,頻率40 KHz)15 min,取出,放置3 h,過濾,繼續(xù)加乙醇洗滌至洗出液呈無色,合并濾液和洗滌液,轉移至100 mL量瓶中,加乙醇至刻度,搖勻,備用;分別測定吸光度,計算比吸附量,比洗脫量和解吸附率,結果如表1。

    表1 不同大孔吸附樹脂對TFMP的吸附考察

    注:比吸附量=(上樣量-殘余量)/樹脂重量;比洗脫量= 醇洗脫量/樹脂重量;解吸附率(%)=醇洗脫量/吸附量×100%。

    結果可知,除HPD450的比吸附量和比洗脫量相對較低外,其余均無顯著差異,但從解吸附率來看,D101型的解吸附率優(yōu)于其他各型號,確定選用D101。

    2.3 吸附條件優(yōu)化

    2.3.1 上樣液pH值對D101總黃酮吸附率的影響[5]

    取布渣葉提取液(pH值為3.4),加入稀HCl試液或稀NaOH試液,調節(jié)使pH值分別為2、4、6、8,吸取原液和各pH值溶液各20 mL,置入已稱取2 g D101的三角瓶中,輕輕振搖,并放置過夜,過濾,D101以30 mL水洗滌,合并,轉移至50 mL容量瓶中,加水至刻度,搖勻,依法測定吸光度,計算總黃酮吸附率[計算公式:吸附率(%)=(上樣量-殘余量)/上樣量×100%]。結果上樣藥液pH值2、3.4、4、6、8時TFMP吸附率分別為93.86%、92.19%、87.56%、88.4%、91.38%,考慮到生產的方便性和實際操作性,選用原液(pH值3.4)上樣。

    2.3.2 上樣濃度對D101總黃酮吸附率的影響[6]

    取布渣葉提取液,分別加水稀釋成每毫升含總黃酮10.76、7.17、4.30、2.69 mg的溶液,以0.5 BV/h的速度通過D101樹脂柱,收集流出液,轉移至50 mL量瓶中,加水至刻度,搖勻,依法測定吸光度,結果 計算得總黃酮吸附率分別為91.67%、90.05%、92.98%、96.83%,考慮上樣濃度過低明顯增加上樣時間,選擇上樣濃度10.76 g/L(約每毫升含0.15 g生藥)。

    2.3.3 上樣流速對D101總黃酮吸附率的影響

    取布渣葉提取液(每毫升含0.15 g生藥),分別以0.5、1、2、3 BV/h的流速通過D101樹脂柱,分別收集流出液,轉移至50 mL容量瓶中,加水至刻度,搖勻,依法測定吸光度,計算得總黃酮吸附率分別為89.02%、82.23%、79.72%、67.75%,故選擇上樣流速為0.5 BV/h。

    2.3.4 樹脂柱徑高比對D101純化TFMP的影響

    稱取D1015份,濕法裝于不同的玻璃柱中,使徑高比分別為1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10,各取6 BV的布渣葉提取液(0.15 g/mL),以0.5 BV/h的速度通過樹脂柱,收集殘余液;取蒸餾水以1 BV/h的速度洗脫至無色,收集水洗液;再以80%乙醇洗至無色,收集醇洗液;殘余液,水洗液和醇洗液,分別濃縮至適量,轉移至100 mL容量瓶中,加水至刻度,搖勻,依法測定吸光度,并計算吸附殘余率,水洗損失率,總黃酮得率及其總和,結果如表2,選擇徑高比為1∶8。

    表2 樹脂柱徑高比對D101純化TFMP的影響

    注:吸附殘余率(%)=吸附殘余量/上樣量×100%; 水洗損失率(%)=水洗損失量/上樣量×100%;總黃酮得率(%)=醇洗脫量/上樣量×100%;總和(%)=吸附殘余率+水洗損失率+總黃酮得率。

    2.3.5 吸附泄漏曲線的考察

    取布渣葉提取液,以0.5 BV/h的流速通過D101樹脂柱(柱體積約20 mL),分段收集流出液,每份10 mL,依法測定吸光度,計算總黃酮濃度,并繪制泄漏曲線圖(如圖1)。結果顯示,在上樣體積180 mL處流出液總黃酮濃度達到47.71 mg/L,約相當于170 mL處流出液濃度25.65 mg/L的2倍,確定上樣溶液的體積為170 mL,約為8.5 BV。

    圖1 TFMP泄露曲線

    2.4 洗脫條件優(yōu)選

    2.4.1 不同濃度醇溶液對總黃酮靜態(tài)解吸附的影響

    稱取D1016份,每份3 g,分別置于100 mL具塞的三角瓶中,加入布渣葉提取30 mL,時時振搖,放置過夜,使充分吸附,濾過,D101水洗至無色,抽干,分別加入對應濃度為40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇各20 mL,搖床振搖6 h后,濾過,并以相同濃度的乙醇分別洗滌,合并洗滌液和濾液,轉移至50 mL容量瓶中,加乙醇至刻度,搖勻。依法測定吸光度,計算。結果總黃酮得率分別為50.18%,63.88%,74.5%,75.57%,82.64%,76.57%。故選用80%乙醇作為洗脫溶劑。

    2.4.2 洗脫速度對總黃酮得率的影響

    取布渣葉提取液4份,分別以0.5 BV/h通過D101樹脂柱,分別用8倍量80%乙醇分別以0.5、1.0、2.0、3.0 BV/h流速洗脫,收集洗脫液,依法測定吸光度,計算得總黃酮得率分別為86.49%、83.59%、76.01%、69.65%,表明隨著洗脫流速加大,總黃酮得率呈下降趨勢,兼顧生產效率和生產實際可操作性,選擇洗脫速度為1 BV/h。

    2.4.3 洗脫體積的選擇[7]

    取布渣葉提取液,以0.5 BV/h的流速通過D101樹脂柱,再用80%乙醇以1 BV/h的流速洗脫,分段收集洗脫液,每份5 mL,依法測定吸光度,計算洗脫液中的總黃酮含量和洗脫體積,并繪制洗脫曲線,結果如圖2。由洗脫曲線可知,當洗脫體積達到45 mL時洗脫液中總黃酮的含量趨近于洗脫平衡,因此可確定洗脫體積為45 mL(約3.75 BV)。

    圖2 TFMP洗脫曲線

    2.5 D101再生重復使用次數考察[7]

    根據確定的D101吸附條件,重復多次吸附與解吸附,每次解吸附后用95%乙醇和蒸餾水依次進行洗脫再生,再進行下一次試驗。分別收集各次80%乙醇洗脫液,依法測定吸光度,計算總黃酮得率。

    總黃酮得率(%)=醇洗脫量/上樣量×100%

    表3 D101不同再生重復使用次數總黃酮得率(n=2)

    結果如表3所示,新D101的總黃酮得率與重復再生1,2,3,4,5次的總黃酮得率差別不大,在重復使用6次后,總黃酮得率明顯下降,不利于總黃酮的富集。因此D101重復利用5次可以保證吸附效果。

    2.6 驗證試驗

    按照確定的純化工藝進行3次驗證試驗(投藥量分別為1 kg、5 kg、20 kg),結果顯示,TFMP純化前總黃酮的平均得率為藥材的4.10%,總黃酮平均含量為38.22%,RSD為0.04%(n=3),純化后的平均含量為84.09%,RSD為2.16%(n=3),精制度達220.03%[精制度(%)=純化后總黃酮含量/純化前總黃酮含量×100%]。說明該純化工藝穩(wěn)定,可靠。

    3 小結與結論

    本研究基于將布渣葉總黃酮提取物用于醫(yī)藥用途,因此在提取、純化、分離工藝中選擇溶劑時盡量避開易燃易爆、毒性較強的有機溶媒,而選用藥用乙醇等作為溶劑,以便利于后續(xù)純化和藥品生產。并在前期提取的研究基礎上,采用單因素考察法對TFMP的大孔樹脂純化工藝參數進行了篩選,確定了其純化工藝,結果顯示其精制度達220.03%,說明采用D101可以較好地富集,純化布渣葉總黃酮,從而為其進一步制劑奠定基礎。

    [1] 譚志燦.廣東道地藥材布渣葉質量評價及調血脂物質基礎研究[D].廣州:廣州中醫(yī)藥大學,2012:66-69.

    [2] 潘天玲,李坤平,賁永光,等.正交試驗法優(yōu)化布渣葉總黃酮提取工藝的研究[J].廣東藥學院學報,2008,24(5):454-456.

    [3] 葛亮,豆浩然,張晉,等.天山雪蓮黃酮類成分大孔樹脂純化工藝優(yōu)選[J].中國實驗方劑學雜志,2014,20(7):1-3.

    [4] 賈存勤,李陽春,屠鵬飛,等.D-101型大孔吸附樹脂預處理方法的研究[J].中草藥,2006,37(2):193-196.

    [5] 王桂玲,房建強,趙雪梅,等.拳參總黃酮的純化研究[J].醫(yī)藥導報,2011,30(2):190-193.

    [6] 張華潭,鄭文麗,魏艷婷,等.大孔樹脂純化黃蜀葵花總黃酮的工藝優(yōu)選[J].中國實驗方劑學雜志,2015,21(1):28-31.

    [7] 張崇禧,鄭友蘭,張春紅,等.大孔樹脂吸附人參總皂苷工藝及再生使用的研究[J].中國藥學雜志,2003,38(9):23-26.

    PurificationProcessofTotalFlavonoidsinMicrocosPaniculatawithMacroporousAdsorptionResin

    LIZhi-yong1,2,SUNDong-mei1,2*,WANGLuo-lin1,2

    (1.GuangdongProvinceEngineeringTechnologyResearchInstituteofT.C.M.,Guangzhou510095,China; 2.GuangdongProvincialKeyLaboratoryofR&DinT.C.M.,Guangzhou510095,China)

    Objective: To determine the parameters of purification process of total flavonoids inMicrocospaniculataL.(TFMP)with macroporous resin. Methods: Single factor test was used to choose the suitable macroporous. Optimize the purification process conditions. Results: D101isolated TFMP process conditions on the concentration was 0.15 g/mL; the flow rate was 0.5 BV/h; the sample volume was 8.5 BV; resin column diameter to height ratio was 1∶8; with 5BV water washed; 3.75 BV ethanol 80% with flow rate 1 BV/h, microporous resin could be reused for 5 times; the purification of TFMP reached 84.09%, up to 220.03% of refining. Conclusion: D101can be used to enrich and purify TFMP.

    Total flavonoids inMicrocospaniculataL.; Macroporous adsorption resin; Purification process

    廣東省科技計劃項目重大科技專項項目(No.2012A080202016)

    李智勇(1977-),男,博士,主任中藥師,主要研究方向:中藥制劑及質量標準研究。

    孫冬梅*(1969-),女,教授,博士研究生導師,主任中藥師,主要研究方向:中藥質量評價研究。

    2016-09-01

    修回日期:2016-09-15

    R284

    :A

    :1002-2406(2017)05-0024-04

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