小柴胡顆粒的高效液相指紋圖譜研究

鄭如文，江志強(qiáng)，程國(guó)華，胡衛(wèi)林，張俊華

(1.廣州白云山光華制藥股份有限公司技術(shù)開發(fā)部，廣東 廣州 510285；2.暨南大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510632)

小柴胡顆粒的高效液相指紋圖譜研究

鄭如文1*，江志強(qiáng)1#，程國(guó)華2，胡衛(wèi)林1，張俊華1

(1.廣州白云山光華制藥股份有限公司技術(shù)開發(fā)部，廣東 廣州 510285；2.暨南大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510632)

目的：采用高效液相指紋圖譜法對(duì)9批小柴胡顆粒進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。方法：色譜柱為Phecda ODS柱(150 mm×4.6 mm，4 μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸溶液，進(jìn)行梯度洗脫，柱溫為30 ℃，流速為1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為276 nm。記錄9批小柴胡顆粒的高效液相指紋圖譜及共有峰，與柴胡、半夏、黃芩、黨參、甘草、大棗、生姜的高效液相色譜圖對(duì)比，對(duì)共有峰進(jìn)行初步歸屬。結(jié)果：9批小柴胡顆粒高效液相指紋圖譜的相似度較好，并初步歸屬了其35個(gè)共有峰中的26個(gè)。結(jié)論：本方法可通過高效液相指紋圖譜來控制小柴胡顆粒的質(zhì)量。

小柴胡顆粒； 高效液相色譜法； 指紋圖譜

小柴胡湯是東漢張仲景所著《傷寒雜病論》中的千年古方，具有和解少陽之功效，被歷代醫(yī)家推崇[1]。小柴胡顆粒是根據(jù)小柴胡湯、運(yùn)用現(xiàn)代制藥技術(shù)研制而成的中藥制劑，由柴胡、黃芩、甘草、黨參、姜半夏、生姜和大棗組成，具有解表散熱、疏肝和胃的功能[2]?，F(xiàn)代藥理研究結(jié)果表明,小柴胡湯具有較好的解熱[3]、抗炎、抗抑郁[4]等作用，體外可抑制多種細(xì)菌生長(zhǎng)，對(duì)肝臟、胰臟、肺臟和胃腸功能有調(diào)節(jié)和保護(hù)作用，在臨床上應(yīng)用廣泛。相關(guān)文獻(xiàn)多采用薄層鑒別法[5]、高效液相色譜法[6]、薄層掃描法[7]等對(duì)小柴胡湯進(jìn)行質(zhì)量控制。本研究在現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的基礎(chǔ)上[8-9]，采用高效液相指紋圖譜法對(duì)9批小柴胡顆粒進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀(Agilent公司)，萬分之一電子天平(北京塞多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，DK-S22型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，DFY-200搖擺式高速中藥粉碎機(jī)(溫嶺市中德中藥機(jī)械有限公司)，KQ-500E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑

乙腈(德國(guó)默克公司)為色譜純，實(shí)驗(yàn)用水為純凈水(華潤(rùn)怡寶食品飲料有限公司)，其他試劑均為分析純。小柴胡顆粒(批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z44020211，批號(hào)：K50065、K50066、K50067、 K50080、K50081、K50082、 K50103、K50104、K50105)及柴胡、半夏、黃芩、黨參、甘草、大棗、生姜藥材均來自廣州白云山光華制藥股份有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Phecda ODS柱(150 mm×4.6 mm，4 μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫(洗脫程序見表1)[10]；柱溫30 ℃[11]；流速1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)276 nm；進(jìn)樣量20 μl。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution procedure

2.2 溶液的制備

2.2.1 小柴胡顆粒供試品溶液：取小柴胡顆粒(批號(hào)：K50065)，研細(xì)，精密稱取約3 g，置于50 ml具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 ml，稱質(zhì)量，超聲(功率：80%，頻率：45 KHz)提取30 min，放冷，以70%甲醇補(bǔ)質(zhì)量，搖勻，取提取液1 ml在14 000 r/min下離心5 min，取上清液，即得[12]。

2.2.2 單味藥材供試品溶液：取單味藥材，分別粉碎過篩(60目)，精密稱取藥粉約1 g，置于50 ml具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 ml，稱質(zhì)量，超聲(功率：80%，頻率：45 KHz)提取30 min，放冷，以70%甲醇補(bǔ)質(zhì)量，搖勻，取提取液1 ml在14 000 r/min下離心5 min，取上清液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn)：取“2.2.1”項(xiàng)下小柴胡顆粒供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均<3.0%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取“2.2.1”項(xiàng)下小柴胡顆粒供試品溶液，室溫下(25 ℃)放置0、6、12、18、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均<3.0%，表明小柴胡顆粒供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品6份，按照“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積的RSD分別在0.9%～2.56%和1.42%～2.73%之間，表明方法重復(fù)性良好。

2.4 小柴胡顆粒指紋圖譜的建立

分別取9批小柴胡顆粒樣品，分別按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密吸取20 μl，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。將9批小柴胡顆粒的數(shù)據(jù)導(dǎo)入“國(guó)家藥典委員會(huì)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件(2004A版)”，生成小柴胡顆粒的指紋圖譜及共有模式圖譜(見圖1—2)，其中5～60 min間有共有峰35個(gè)。以9批小柴胡顆粒的共有模式為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行整體相似度評(píng)價(jià)，見表2。

圖1 9批小柴胡顆粒的高效液相指紋圖譜Fig 1 HPLC fingerprint of 9 batches Xiaochaihu granules

圖2 9批小柴胡顆粒的高效液相指紋圖譜共有模式圖Fig 2 Common HPLC fingerprint of 9 batches Xiaochaihu granules

表2 相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Tab 2 Similarity evaluation results

2.5 指紋圖譜中共有峰的初步歸屬

分別取小柴胡顆粒配方中的7味藥材柴胡、半夏、黃芩、黨參、甘草、大棗、生姜，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備單味藥材供試品溶液，并按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖并同步采集3D圖譜。通過對(duì)比小柴胡顆粒與單味藥材色譜峰的保留時(shí)間和紫外吸收光譜圖(從3D圖譜中獲取)，對(duì)小柴胡顆粒指紋圖譜中的35個(gè)共有峰在其配方藥材中進(jìn)行初步歸屬。

(1)柴胡：小柴胡顆粒指紋圖譜中的8個(gè)共有峰(5、15、17、18、27、31、33、35號(hào)峰)可能來自柴胡藥材，見圖3—4。(2)黃芩：小柴胡顆粒指紋圖譜中的16個(gè)共有峰(3、9、11、13、14、19、20、22、23、24、25、27、28、33、34、35號(hào)峰)可能來自黃芩藥材，見圖5—6。(3)黨參：小柴胡顆粒指紋圖譜中的7個(gè)共有峰(20、24、25、27、30、33、35號(hào)峰)可能來自黨參藥材，見圖7—8。(4)甘草：小柴胡顆粒指紋圖譜中的8個(gè)共有峰(6、8、9、12、21、24、28、30號(hào)峰)可能來自甘草藥材，見圖9—10。(5)大棗：小柴胡顆粒指紋圖譜中的1個(gè)共有峰(3號(hào)峰)可能來自大棗藥材，見圖11。(6)半夏和生姜：半夏和生姜的色譜圖中未能找到對(duì)應(yīng)的小柴胡顆粒指紋圖譜共有峰。

圖3 5批柴胡藥材的高效液相指紋圖譜及與小柴胡顆粒的共有峰Fig 3 HPLC fingerprint chromatogram of 5 batches of R. bupleuri and common peaks in the fingerprints of Xiaochaihu granules

3 討論

本研究曾以甲醇[13]和乙腈作為流動(dòng)相，比較了Agilent TC-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Agilent XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Agilent Zorbax C8柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)和Phecda ODS柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)四種色譜柱對(duì)小柴胡顆粒指紋圖譜色譜峰的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈及Phecda ODS柱對(duì)色譜峰的峰形和分離效果較佳。并在254、276、330、360 nm四個(gè)波長(zhǎng)下對(duì)小柴胡顆粒的指紋圖譜進(jìn)行了觀測(cè)，發(fā)現(xiàn)在276 nm波長(zhǎng)下的色譜峰信息較全，分離度較好，故選擇276 nm作為指紋圖譜的測(cè)定波長(zhǎng)。通過相似度對(duì)比，發(fā)現(xiàn)9批小柴胡顆粒的指紋圖譜相似度在0.976～0.998之間，相似度較高，說明不同批次小柴胡顆粒的質(zhì)量穩(wěn)定[14-15]。通過對(duì)小柴胡顆粒與其組成的7味中藥(黨參、甘草、大棗、生姜、柴胡、黃芩、半夏)的指紋圖譜進(jìn)行對(duì)比分析，本研究初步了解小柴胡顆粒指紋圖譜共有模式中35個(gè)共有峰中的26個(gè)峰在7味中藥中的分布情況；而根據(jù)每味藥材所對(duì)應(yīng)的共有峰特點(diǎn)，可在一定程度上反應(yīng)出小柴胡顆粒中藥材的使用情況，從藥材角度辨別出產(chǎn)品質(zhì)量。

(1)5號(hào)共有峰；(2)15號(hào)共有峰；(3)17號(hào)共有峰；(4)18號(hào)共有峰；(5)27號(hào)共有峰；(6)31號(hào)共有峰；(7)33號(hào)共有峰；(8)35號(hào)共有峰；A.柴胡；B.小柴胡顆粒(1)No.5 common peak；(2)No.15 common peak；(3)No.17 common peak；(4)No.18 common peak；(5)No.27 common peak；(6)No.31 common peak；(7)No.33 common peak；(8)No.35 common peak；A.R. bupleuri；B.Xiaochaihu granules圖4 柴胡藥材與小柴胡顆粒的8個(gè)共有峰的紫外吸收光譜圖Fig 4 The ultraviolet absorption spectrogram of 8 common peaks of R. bupleuri and Xiaochaihu granules

(1)3號(hào)共有峰；(2)9號(hào)共有峰；(3)11號(hào)共有峰；(4)13號(hào)共有峰；(5)14號(hào)共有峰；(6)19號(hào)共有峰；(7)20號(hào)共有峰；(8)22號(hào)共有峰；(9)23號(hào)共有峰；(10)24號(hào)共有峰；(11)25號(hào)共有峰；(12)27號(hào)共有峰；(13)28號(hào)共有峰；(14)33號(hào)共有峰；(15)34號(hào)共有峰；(16)35號(hào)共有峰；A.黃芩；B.小柴胡顆粒(1)No.3 common peak；(2)No.9 common peak；(3)No.11 common peak；(4)No.13 common peak；(5)No.14 common peak； (6)No.19 common peak；(7)No.20 common peak；(8)No.22 common peak；(9)No.23 common peak；(10)No.24 common peak； (11)No.25 common peak； (12)No.27 common peak；(13)No.28 common peak；(14)No.33 common peak；(15)No.34 common peak；(16)No.35 common peak；A.S. baicalensis；B.Xiaochaihu granules圖6 黃芩藥材與小柴胡顆粒的16個(gè)共有峰的紫外吸收光譜圖Fig 6 The ultraviolet absorption spectrogram of 16 common peaks of S. baicalensis and Xiaochaihu granules

圖5 2批黃芩藥材的高效液相指紋圖譜及與小柴胡顆粒的共有峰Fig 5 HPLC fingerprint chromatogram of 2 batches of S. baicalensis and common peaks with Xiaochaihu granules

圖7 黨參藥材的高效液相指紋圖譜及與小柴胡顆粒的共有峰Fig 7 HPLC fingerprint chromatogram of C. pilosula and common peaks with Xiaochaihu granules

(1)20號(hào)共有峰；(2)24號(hào)共有峰；(3)25號(hào)共有峰；(4)27號(hào)共有峰；(5)30號(hào)共有峰；(6)33號(hào)共有峰；(7)35號(hào)共有峰；A.黨參；B.小柴胡顆粒(1)No.20 common peak；(2)No.24 common peak；(3)No.25 common peak；(4)No.27 common peak；(5)No.30 common peak；(6)No.33 common peak；(7)No.35 common peak；A.C. pilosula；B.Xiaochaihu granules圖8 黨參藥材與小柴胡顆粒的7個(gè)共有峰的紫外吸收光譜圖Fig 8 The ultraviolet absorption spectrogram of 7 common peaks of C. pilosula and Xiaochaihu granules

圖9 甘草藥材的高效液相指紋圖譜及與小柴胡顆粒的共有峰Fig 9 HPLC fingerprint chromatogram of liquorice and common peaks with Xiaochaihu granules

圖11 大棗藥材的高效液相指紋圖譜及與小柴胡顆粒的1個(gè)共有峰Fig 11 HPLC fingerprint chromatogram of jujube and 1 common peak with Xiaochaihu granules

(1)6號(hào)共有峰；(2)8號(hào)共有峰；(3)9號(hào)共有峰；(4)12號(hào)共有峰；(5)21號(hào)共有峰；(6)24號(hào)共有峰；(7)28號(hào)共有峰；(8)30號(hào)共有峰；A.甘草；B.小柴胡顆粒(1)No.6 common peak；(2)No.8 common peak；(3)No.9 common peak；(4)No.12 common peak；(5)No.21 common peak；(6)No.24 common peak；(7)No.28 common peak；(8)No.30 common peak；A.liquorice；B.Xiaochaihu granules圖10 甘草藥材與小柴胡顆粒的8個(gè)共有峰的紫外吸收光譜圖Fig 10 The ultraviolet absorption spectrogram of 7 common peaks of liquorice and Xiaochaihu granules

A.大棗；B.小柴胡顆粒A.jujube；B.Xiaochaihu granules圖12 大棗藥材與小柴胡顆粒的1個(gè)共有峰(3號(hào)峰)的紫外吸收光譜圖Fig 12 The ultraviolet absorption spectrogram of 1 commonpeak (No.3 peak) of jujube and Xiaochaihu granules

綜上所述，小柴胡顆粒的高效液相指紋圖譜既能整體監(jiān)控小柴胡顆粒的質(zhì)量，又能通過其中單味藥材所對(duì)應(yīng)的特征峰來觀察小柴胡顆粒生產(chǎn)過程中的用藥情況。

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Study on HPLC Fingerprint for Xiaochaihu Granules

ZHENG Ruwen1,JIANG Zhiqiang1,CHENG Guohua2,HU Weilin1,ZHANG Junhua1

(1.Dept.of Technical Development Guangzhou Baiyunshan Guanghua Pharmaceutical Co. Ltd,Guangdong Guangzhou 510285,China; 2.College of Pharmacy,Jinan University,Guangdong Guangzhou 510632,China)

OBJECTIVE: To conduct the quality evaluation on 9 batches of Xiaochaihu granules by HPLC fingerprint method. METHODS: The column was Phecda ODS(150 mm×4.6 mm，4 μm) with a mobile phase of acetonitrile -0.1% formic acid by gradient elution,the column temperature was kept at 30 ℃,the flow rate was 1.0 ml/min,the detection wavelength was set at 276 nm. HPLC fingerprint of 9 batches of Xiaochaihu granules and common peaks were recorded,the common peaks were matched by comparing HPLC ofR.bupleuri,P.ternata,S.baicalensis,C.pilosula,liquorice,jujube,andfreshginger. RESULTS: The HPLC fingerprints of 9 batches of Xiaochaihu granules was similar well,26 common peaks were matched among 35 common peaks. CONCLUSIONS: This method can control quality of Xiaochaihu granules through HPLC fingerprint.

Xiaochaihu granules; HPLC; Fingerprint

R927

A

1672-2124(2017)08-1089-05

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2017.08.031

2017-04-13)

*制藥工程師。研究方向：藥品研發(fā)與質(zhì)量管理。E-mail：js@bysgh.com

#通信作者：主管中藥師，博士。研究方向：中藥藥劑。E-mail：1400415519@qq.com