肝細(xì)胞癌患者外周血Th22細(xì)胞檢測(cè)及臨床意義

郝猛，施珍，劉曉峰，孫午

(九江市第一人民醫(yī)院/南昌大學(xué)附屬九江醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西九江332000)

肝細(xì)胞癌患者外周血Th22細(xì)胞檢測(cè)及臨床意義

郝猛，施珍，劉曉峰，孫午

(九江市第一人民醫(yī)院/南昌大學(xué)附屬九江醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西九江332000)

目的探討肝細(xì)胞癌患者外周血Th22細(xì)胞表達(dá)水平及其臨床意義。方法抽取52例肝細(xì)胞癌患者、38例慢性乙型肝炎患者、32例健康對(duì)照者外周血標(biāo)本，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th22細(xì)胞水平，ELISA法檢測(cè)IL-22水平，分析肝細(xì)胞癌組Th22細(xì)胞、IL-22與腫瘤標(biāo)志物AFP、CEA、CA199的相關(guān)性。結(jié)果外周血Th22細(xì)胞和IL-22水平在肝細(xì)胞癌組、慢性乙型肝炎組顯著高于健康對(duì)照組（P＜0.05），肝細(xì)胞癌組略高于慢性乙型肝炎組（P＞0.05）；肝細(xì)胞癌患者外周血Th22細(xì)胞和IL-22水平存在正相關(guān)（r=0.342，P＜0.05），而外周血Th22細(xì)胞、血漿IL-22水平與腫瘤標(biāo)志物AFP、CEA、CA199均無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）。肝細(xì)胞癌組HBV陰、陽(yáng)性患者間Th22細(xì)胞和IL-22水平比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。結(jié)論Th22細(xì)胞在肝細(xì)胞癌外周血中呈高水平表達(dá)，且與乙型肝炎病毒攜帶可能相關(guān)，但與血清腫瘤標(biāo)志物無(wú)相關(guān)性，提示該細(xì)胞可能參與了肝細(xì)胞癌的發(fā)生和進(jìn)展。

肝細(xì)胞癌；Th22細(xì)胞；IL-22；相關(guān)性

肝癌是人類常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是癌癥患者死亡的主要病因之一。流行病學(xué)研究證實(shí)肝癌發(fā)生率持續(xù)上升，我國(guó)原發(fā)性肝癌在腫瘤相關(guān)死亡中僅次于肺癌，位居第二位；原發(fā)性肝癌90%以上為肝細(xì)胞癌(HCC），而乙型肝炎病毒(HBV)長(zhǎng)期慢性感染是肝細(xì)胞癌的主要致病因素。原發(fā)性肝癌發(fā)生是一個(gè)多因素多階段的復(fù)雜過(guò)程，大部分CD4+T細(xì)胞參與原發(fā)性肝癌的發(fā)病和進(jìn)展過(guò)程，其發(fā)病與進(jìn)展的免疫機(jī)制尚不明確，但已有國(guó)內(nèi)外學(xué)者開(kāi)始研究炎癥因子在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用。Th22細(xì)胞亞群是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一類CD4+T細(xì)胞亞群，以高水平分泌IL-22，不產(chǎn)生IL-17或IFN-γ為特點(diǎn)，在許多感染及自身免疫性疾病表達(dá)上調(diào)；在炎癥反應(yīng)、自身免疫性疾病、腫瘤及移植排斥反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用[1，2]。IL-22是由Th22等免疫細(xì)胞產(chǎn)生并以皮膚、肝臟、胰腺等組織細(xì)胞為靶細(xì)胞的細(xì)胞因子，IL-22在肝炎產(chǎn)生和肝癌形成以及組織修復(fù)過(guò)程中起重要的免疫病理作用[3-5]。因此我們采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HCC患者外周血中Th22的表達(dá)并分析其與肝腫瘤標(biāo)志物的相關(guān)性，以進(jìn)一步探討其在乙型肝炎病毒型HCC發(fā)病中的作用，為臨床診療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2014年6月-2015年12月九江市第一人民醫(yī)院52例臨床診斷肝細(xì)胞癌患者和38例慢性乙型病毒肝炎患者的外周血標(biāo)本。肝細(xì)胞癌患者中男29例，女13例，平均年齡51.82±10.51歲，其中乙型肝炎病毒陽(yáng)性患者41例；慢性乙型肝炎患者中男21例，女17例，平均年齡48.82±13.51歲。另收集32名健康對(duì)照人的外周血，其中男19例，女13例，平均年齡53.16±12.84歲。上述診斷均符合2009年制訂的原發(fā)性肝癌診斷標(biāo)準(zhǔn)和2010年修訂的肝硬化和病毒性肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[6，7]。

1.2 儀器與試劑羅氏Cobas e601化學(xué)發(fā)光儀及配套檢測(cè)試劑；BD FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司及由BD公司提供的抗人CD4、IL-22配套檢測(cè)試劑；完全培養(yǎng)基RPMI 1640為Hyelone公司產(chǎn)品；淋巴細(xì)胞刺激混合液（佛波醇酯、離子霉素、莫能霉素）均購(gòu)自Sigma公司；淋巴細(xì)胞分離液為杭州四季青生物工程公司產(chǎn)品；IL-22 ELISA試劑盒購(gòu)自R&D公司。

1.3 Th22細(xì)胞檢測(cè)方法入選病例于診斷成立后第2d從肘靜脈抽取血液1ml置入肝素抗凝管中，加PBS液稀釋1倍混勻后加入分離液Ficoll-Hypaque，以1500r/min離心10min，收集單個(gè)核細(xì)胞層于離心管中，取100μl單個(gè)核細(xì)胞與RPMI 1640培養(yǎng)液等體積稀釋，加入淋巴細(xì)胞刺激劑混合液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h，取各組標(biāo)本單個(gè)核細(xì)胞用FACS緩沖液(含2%FCS和0．1%疊氮鈉的PBS)洗滌2次，加入抗人PE-CY7-CD4抗體，室溫避光孵育30min；固定破膜后，加入抗人PE-IL-22抗體，加入同型對(duì)照抗體，室溫避光孵育30min，重懸后采用BD CantoⅡ流式細(xì)胞儀檢測(cè)，F(xiàn)ACS Diva7.0軟件分析流式檢測(cè)結(jié)果，用Th22細(xì)胞占外周血CD4+細(xì)胞的比例來(lái)評(píng)價(jià)Th22細(xì)胞的水平。AFP、CEA、CA199、IL-22檢測(cè)項(xiàng)目按照標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)流程(SOP)文件操作進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間兩兩比較采用單因素方差分析。各組間的差異采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，Th22與常見(jiàn)臨床指標(biāo)的相互關(guān)系采用Spearman檢驗(yàn)分析；所有假設(shè)檢驗(yàn)均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血Th22細(xì)胞水平比較流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示肝細(xì)胞癌組Th22細(xì)胞占外周血CD4+細(xì)胞比例為（7.18±2.09）%，明顯高于健康對(duì)照組的（2.32±1.12）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；慢性乙型肝炎組Th22細(xì)胞占外周血CD4+細(xì)胞比例為（5.92±1.76）%，也明顯高于健康對(duì)照組的（2.32± 1.12）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；肝細(xì)胞癌組與慢性乙型肝炎組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 外周血IL-22水平比較ELISA結(jié)果檢測(cè)顯示肝細(xì)胞癌組外周血IL-22為（808.68±171.64）pg/ ml，明顯高于健康對(duì)照組的（235.45±81.52）pg/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；慢性乙型肝炎組外周血IL-22為（671.54±153.66）pg/ml，也明顯高于健康對(duì)照組的（235.45±81.52）pg/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；肝細(xì)胞癌組與慢性乙型肝炎組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見(jiàn)表1。進(jìn)一步與Th22細(xì)胞比例進(jìn)行相關(guān)性分析，顯示肝細(xì)胞癌組和慢性乙型肝炎組患者外周血Th22細(xì)胞比例與IL-22水平均呈正相關(guān)（r=0.342，P＜0.05；r=0.318，P＜0.05）。

表1 各組間外周血Th22細(xì)胞和IL-22水平比較（x±s）

2.3 肝細(xì)胞癌組Th22細(xì)胞和IL-22水平與腫瘤標(biāo)志物相關(guān)分析結(jié)果顯示肝細(xì)胞癌患者外周血Th22和IL-22水平存在相關(guān)性（r=0.342，P＜0.05），而血漿Th22和IL-22水平與腫瘤標(biāo)志物AFP、CEA、CA199均無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）。見(jiàn)表2，表3。

表2 Th22細(xì)胞與腫瘤標(biāo)志物相關(guān)分析（n=52）

表3 IL-22與腫瘤標(biāo)志物相關(guān)分析（n=52）

2.4 肝細(xì)胞癌組HBV陰、陽(yáng)性患者Th22細(xì)胞和IL-22水平比較乙型肝炎病毒陽(yáng)性肝細(xì)胞癌組與乙型肝炎病毒陰性肝細(xì)胞癌組外周血Th22細(xì)胞水平比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；乙型肝炎病毒陽(yáng)性肝細(xì)胞癌組與乙型肝炎病毒陰性肝細(xì)胞癌組IL-22水平比較也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 肝細(xì)胞癌組HBV陰陽(yáng)性患者Th22和IL-22水平

3 討論

Th22細(xì)胞是最早于2009年由Duhen T等[8]和Trifari S等[9]發(fā)現(xiàn)的一類與皮膚免疫功能相關(guān)的CD4+T細(xì)胞功能亞群，其免疫表型CCR6+、CCR4+和CCRl0+，它獨(dú)立于Thl、Th2和Thl7，不分泌IFN-γ、IL-17、IL-4，主要分泌IL-22、IL-26、IL-13等細(xì)胞因子，其功能主要通過(guò)IL-22來(lái)實(shí)現(xiàn)[3]。IL-22主要由Th22和Thl7細(xì)胞亞群產(chǎn)生，其中Th22細(xì)胞分泌量可達(dá)總IL-22水平的65%；IL-22不直接作用于免疫細(xì)胞，其受體分布于皮膚、腎臟、肝臟、呼吸道及消化道等組織細(xì)胞，參與這些系統(tǒng)疾病的病理過(guò)程[10]。IL-22與其受體復(fù)合物結(jié)合后引起信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘發(fā)J激酶1(JAKl)、酪氨酸激酶2(Tyk2)及細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)活化，進(jìn)而激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子3(STAT3)及少量STATl、STAT5等。IL-22激活JAK-STAT3信號(hào)通路后，可誘導(dǎo)組織細(xì)胞多種基因表達(dá)上調(diào)，這些基因涉及組織重塑、血管生成、纖維化形成等。在肝臟，STAT3被激活后會(huì)誘導(dǎo)急性時(shí)相基因、抗菌蛋白基因、凋亡抑制基因和增值相關(guān)基因表達(dá)，故IL-22表現(xiàn)為肝臟保護(hù)、促有絲分裂、甚至腫瘤形成等作用[11-13]。

Jiang R等[5]的研究表明，IL-22在人類肝細(xì)胞癌(HCC)中高表達(dá)，血清中IL-22表達(dá)水平在慢性肝病和HCC中顯著增高，提示Th22細(xì)胞可能在肝細(xì)胞癌和慢性肝病的T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫相關(guān)。本研究結(jié)果顯示肝細(xì)胞癌組、慢性乙型肝炎組中外周血Th22和IL-22水平均明顯高于健康對(duì)照組，肝細(xì)胞癌組高于慢性乙型肝炎組，提示Th22細(xì)胞可能參與肝細(xì)胞癌的發(fā)病及進(jìn)展過(guò)程[14]。有研究顯示猿人類免疫缺陷病毒（SHIV）感染獼猴后，發(fā)現(xiàn)Th22表達(dá)水平在SHIV慢性感染后再次感染瘧疾時(shí)較SHIV與瘧疾共同感染時(shí)高出200倍，并與其預(yù)后明顯相關(guān)[15]，提示Th22表達(dá)水平與病毒感染有一定的關(guān)系。但在HBV感染后如何變化，目前還無(wú)相關(guān)研究。Park O等[4]發(fā)現(xiàn)IL-22在乙肝和丙肝患者中高表達(dá)，可提高肝細(xì)胞的存活率，也可加速慢性病毒性肝炎患者肝細(xì)胞癌變。這說(shuō)明HCC患者微環(huán)境中IL-22高表達(dá)，IL-22通過(guò)活化STAT3信號(hào)通路，提高Bcl-xl基因、B淋巴細(xì)胞瘤2基因、細(xì)胞周期蛋白D1和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)，而這些蛋白的表達(dá)最終可促進(jìn)血管生長(zhǎng)和細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)惡性腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，但分析肝細(xì)胞癌組Th22細(xì)胞和IL-22水平與肝腫瘤標(biāo)志物均無(wú)相關(guān)性[16]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，乙型肝炎病毒陽(yáng)性肝細(xì)胞癌組與乙型肝炎病毒陰性肝細(xì)胞癌組外周血Th22、IL-22水平比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，結(jié)果表明Th22細(xì)胞在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)水平可能與乙肝病毒攜帶有關(guān)，Jiang R等[5]通過(guò)長(zhǎng)期反復(fù)DEN誘導(dǎo)小鼠模擬了肝炎發(fā)展到肝癌的反復(fù)損傷修復(fù)過(guò)程，發(fā)現(xiàn)IL-22水平的隨腫瘤的形成逐漸升高；提示慢性HBV感染時(shí)，IL-22的升高可能既提高了肝細(xì)胞的存活率，又加速肝炎向肝癌的轉(zhuǎn)化[17]。但考慮到本實(shí)驗(yàn)組的病例數(shù)較少，還需臨床大量樣本研究證實(shí)。

綜上所述，Th22細(xì)胞作為新近發(fā)現(xiàn)的效應(yīng)CD4+T細(xì)胞亞群，在慢性乙型肝炎和肝細(xì)胞癌中的作用還不太明確[18]。雖然有文獻(xiàn)報(bào)道IL-22在刀豆蛋白、四氯化碳等介導(dǎo)的T細(xì)胞肝炎中起減輕細(xì)胞損傷、促進(jìn)細(xì)胞增殖和加速組織修復(fù)等保護(hù)作用，但也有證據(jù)表明IL-22在慢性乙型肝炎中促進(jìn)炎癥的發(fā)生和誘導(dǎo)肝癌的形成。目前Th22細(xì)胞在肝細(xì)胞癌的相關(guān)性研究很少，深入研究探討Th22細(xì)胞在乙型肝炎型肝細(xì)胞癌的發(fā)生機(jī)制，可能為乙型肝炎相關(guān)性肝細(xì)胞癌的預(yù)防、早期診斷和靶向免疫治療提供更有效的臨床診斷價(jià)值。

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The Detection and Significance of Th22 Cells in Peripheral Blood of Hepatocellular Carcinoma Patients

HAO Meng，SHI Zheng，LIU Xiaofeng，SUN Wu.Depratment of Clinical Laboratory，F(xiàn)irst People's Hospital of Jiujiang City/Jiujiang Affiliated Hospital of Nanchang University，Jiujiang Jiangxi 332000，China.

Objective To investigate the expression of Th22 cells in peripheral blood of hepatocellular carcinoma patients and its clinical significance.Methods The peripheral blood were collected from 38 cases with chronic hepatitis B and 32 healthy controls.The expression level of Th22 cells in blood samples was detected by flow cytometry(FCM)；the IL-22 was detected by an enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).The potential interrelationship of Th22 cells，IL-22 in peripheral blood and tumor markers including AFP，CEA and CA199 was performed.Results The expression level of Th22 cells and IL-22 in peripheral blood of hepatocellular carcinoma group and chronic hepatitis B group were significantly higher than those of healthy control group (P＜0.05)，which of the hepatocellular carcinoma group were slightly higher than those of the chronic hepatitis B group(P＞0.05).The percentage of Th22 cells in hepatocellular carcinoma group had the positive correlation with the level of IL-22(r=0.342，P＜0.05)，while the expression level of Th22 cells and IL-22 had no correlation with tumor markers including AFP，CEA and CA199(P＞0. 05).Additionally，the expression level of Th22 cells and IL-22 bore significant difference in the HBV-negative and-positive hepatocellular carcinoma patients(P＜0.05).ConclusionTh22 cells in the peripheral blood of hepatocellular carcinoma patients showed high expression level，with which hepatitis B virus carrying might be related，but not serum tumor markers.The results suggested that the Th22 cells might participate in pathogenesis and progression of hepatocellular carcinoma.

∶Hepatocellular carcinoma；Th22 cells；IL-22；Correlation analysis

R446.62，R735.7

A

1674-1129(2017)04-0499-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.04.014

2016-12-12；

2017-04-30)

郝猛，男，1983年生，醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)，大學(xué)本科，學(xué)士學(xué)位，主管檢驗(yàn)技師。