P16蛋白、HPV L-1殼蛋白在CIN和早期宮頸癌組織中的表達(dá)及其篩查價值

項媛媛,王苗苗,謝 艷,袁智民

(揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬淮安市婦幼保健院婦產(chǎn)科，江蘇 淮安226600)

P16蛋白、HPV L-1殼蛋白在CIN和早期宮頸癌組織中的表達(dá)及其篩查價值

項媛媛,王苗苗,謝 艷,袁智民

(揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬淮安市婦幼保健院婦產(chǎn)科，江蘇 淮安226600)

目的 分析P16蛋白、人乳頭瘤病毒(HPV)L-1殼蛋白在宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)和宮頸癌中的表達(dá)及篩查價值。方法 選取2014年1月至2016年6月淮安市婦幼保健院婦產(chǎn)科CIN和早期宮頸癌共50例患者，通過第二代雜交捕獲法與免疫組化法分析P16蛋白、HPV L-1殼蛋白在其組織中的表達(dá)。結(jié)果 P16蛋白在慢性宮頸炎(9.09%)、低度鱗狀上皮內(nèi)病變(52.94%)、高度鱗狀上皮內(nèi)病變(84.21%)及早期宮頸癌(100.00%)中的陽性表達(dá)率逐漸升高(χ2=45.38，P=0.00)，人乳頭瘤病毒 L-1殼蛋白陽性表達(dá)率亦存在明顯差異，分別是18.18%、35.29%、15.79%及0(χ2=12.59，P=0.00)；隨著病毒載量提高，P16蛋白與人乳頭瘤病毒L-1殼蛋白陽性表達(dá)率均有所改變(χ2值分別為41.37、32.95，均P<0.01)。在慢性宮頸炎中，P16蛋白表達(dá)陽性率與高危型人乳頭瘤病毒呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.52，P=0.01)；在低度鱗狀上皮內(nèi)病變中，P16蛋白、人乳頭瘤病毒L-1殼蛋白陽性表達(dá)率與高危型人乳頭瘤病毒均呈正相關(guān)關(guān)系(r值分別為0.58、0.33，均P<0.05)；在高度鱗狀上皮內(nèi)病變及早期宮頸癌中，P16蛋白、人乳頭瘤病毒L-1殼蛋白陽性表達(dá)率與高危型人乳頭瘤病毒均未存在顯著相關(guān)性(r值分別為0.12、0.26、0.62，均P>0.05)。結(jié)論 P16蛋白、人乳頭瘤病毒L-1殼蛋白表達(dá)陽性可作為宮頸癌前病變出現(xiàn)的分子事件，在篩查CIN和早期宮頸癌中的價值較高，臨床上值得應(yīng)用和推廣。

高危型人乳頭瘤病毒；P16蛋白；人乳頭瘤病毒 L-1殼蛋白；宮頸上皮內(nèi)瘤變；宮頸癌

宮頸癌是繼乳腺癌之后的一種發(fā)病率較高的惡性腫瘤，臨床研究報道，近幾年宮頸癌多發(fā)于年輕女性且發(fā)病率逐年上升，給女性群體的健康及生活水平帶來極大的影響[1]。人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是乳多空病毒科的乳頭瘤空泡病毒A屬之一。已有學(xué)者表示，宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)及宮頸癌的出現(xiàn)及發(fā)展與感染高危型人乳頭瘤病毒(high-risk human papillomavirus，HR-HPV)有著一定的聯(lián)系[2]。P16蛋白與HPV L-1殼蛋白在宮頸病變中的診斷價值較高，然而有關(guān)其與HPV載量問題的研究相對較為少見。因此，現(xiàn)就揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬淮安市婦幼保健院CIN及早期宮頸癌患者進(jìn)行探討，分析P16蛋白、HPV L-1殼蛋白在其組織中的表達(dá)與篩查價值。

1資料與方法

1.1一般資料

隨機(jī)選取淮安市婦幼保健院婦產(chǎn)科2014年1月至2016年6月50例非典型鱗狀上皮細(xì)胞(atypical squamous cells of undetermined significance，ASCUS)以上病變程度的患者，年齡為31.54±7.66歲，所有患者既往均有性生活史，排除外陰道假絲酵母菌、妊娠和陰道毛滴蟲等病原體感染，同時排除宮頸環(huán)切術(shù)史或全子宮切除術(shù)史。宮頸組織病理學(xué)檢查結(jié)果有CIN、良性細(xì)胞變化及鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)，其中，CINⅠ對應(yīng)液基細(xì)胞學(xué)檢查(thin-prep cytologic test，TCT)中的低度鱗狀上皮內(nèi)病變(low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL)，CINⅡ、CIN Ⅲ對應(yīng)TCT檢查中的高度鱗狀上皮內(nèi)病變(higher-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL)。病理組織學(xué)呈陽性主要有SCC、CINⅠ、CINⅡ以及CIN Ⅲ。本次研究50例患者中有11例慢性宮頸炎、36例CIN以及3例早期宮頸癌。

1.2檢測方法

1.2.1試劑選用

P16多克隆抗體與SP試劑盒均來自武漢默沙克生物科技有限公司；第二代雜交捕獲試劑盒來自北京洛奇臨床檢驗所有限公司；CytoReact HPV L1檢測試劑盒來自美國Advanced Medical Science公司。

1.2.2 P16蛋白檢測

通過免疫組化SP法，染色方法均根據(jù)試劑盒指示完成操作。若胞漿與細(xì)胞核產(chǎn)生棕褐色亦或棕黃色顆粒則提示陽性。于病變細(xì)胞密集處，在40×10倍光鏡下觀察5個視野，全部視野均計數(shù)50個細(xì)胞，根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)與分布進(jìn)行判斷：陽性細(xì)胞比例低于5%是(-)；5%～25%之間是(+)；26%～50%之間是(++)；高于50%是(+++)[3]。

1.2.3 HPV L-1殼蛋白

分別通過免疫組化與原位雜交法進(jìn)行檢測操作，檢測方法均根據(jù)試劑盒指示完成；若超過1個被紅染的細(xì)胞核則提示HPV L1表達(dá)陽性。

1.2.4 HPV病毒載量檢測

通過第二代雜交捕獲法，將所選樣本中的相對發(fā)光單位與標(biāo)準(zhǔn)陽性參照臨界值的比值作為反映該檢測樣本中HPV-DNA的含量情況，能夠檢出HPV31、35、51、59等13種HR-HPV DNA病毒載量；若二者比值在1及以上則提示表達(dá)陽性，可將其載量分成<1、>1～100、>100～1 000及>1 000共4個不同等級[4]。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

2結(jié)果

2.1 P16蛋白、HPV L-1殼蛋白在不同病變程度宮頸組織中的表達(dá)

在慢性宮頸炎組織中，P16蛋白陽性細(xì)胞較為少見，以底層細(xì)胞分布為主，且主要為淺染色；P16蛋白陽性細(xì)胞在CIN組織中主要見于病變細(xì)胞層，染色相對較深，同時隨著CIN病變程度的加重，P16蛋白陽性細(xì)胞分布范圍有所擴(kuò)大，染色越深，顆粒越大，以灶狀或彌漫分布為主；P16蛋白陽性細(xì)胞在不同病變程度宮頸組織中的表達(dá)存在明顯差異(P=0.00)。HPV L-1殼蛋白主要見于細(xì)胞核，陽性細(xì)胞中胞核以紅褐色顆粒為主，且集中于表層細(xì)胞；HPV L-1殼蛋白在不同病變程度宮頸組織中的表達(dá)亦存在明顯差異，其中在LSIL中的表達(dá)陽性率最高(P=0.00)，見表1。

表1 P16蛋白、HPV L-1殼蛋白在不同病變程度宮頸組織中的表達(dá)[n(%)]

Table 1 Expressions of P16 and HPV L-1 caspid in various cervical lesions[n(%)]

2.2 HR-HPV在不同病變程度宮頸組織中的載量分布及P16蛋白、HPV L-1殼蛋白表達(dá)

在慢性宮頸炎、LSIL、HSIL中，HR-HPV陽性表達(dá)率逐漸上升，分別是36.36%、88.24%、94.74%(χ2=69.14，P=0.00)，在早期宮頸癌中的表達(dá)陽性率為66.67%；隨著HPV載量提高，P16蛋白與HPV L-1殼蛋白陽性表達(dá)率均有所改變(χ2值分別為41.37、32.95，均P<0.01)，見表2。

表2 HR-HPV在不同病變宮頸組織中的載量分布及P16蛋白、HPV L-1殼蛋白表達(dá)[n(%)]

Table 2 HR-HPV load and expressions of P16 and HPV L-1 caspid in various cervical lesions [n(%)]

2.3 P16蛋白、HPV L-1殼蛋白在各宮頸病變組織中的表達(dá)與HR-HPV載量相關(guān)性分析

在慢性宮頸炎中，P16蛋白表達(dá)陽性率與HR-HPV呈正相關(guān)關(guān)系(P=0.01)；在LSIL中，P16蛋白、HPV L-1殼蛋白陽性表達(dá)率與HR-HPV均呈正相關(guān)關(guān)系(均P<0.05)；在HSIL及早期宮頸癌中，P16蛋白、HPV L-1殼蛋白陽性表達(dá)率與HR-HPV均未存在顯著相關(guān)性(均P>0.05)，見表3。

表3 P16蛋白、HPV L-1殼蛋白在各宮頸病變組織中的表達(dá)與HR-HPV載量相關(guān)性

Table 3 Correlation between expressions of P16 and HPV L-1 caspid and HR-HPV load in various cervical lesions

3討論

3.1 CIN及預(yù)防宮頸癌的一般手段

HR-HPV反復(fù)感染是導(dǎo)致CIN及宮頸癌出現(xiàn)和發(fā)展的主要原因[5]，故其能夠在臨床上對CIN以及宮頸癌患者做出及時診治提供關(guān)鍵性依據(jù)。由于我國作為宮頸癌多發(fā)的國家之一，目前對其診治方法采用盡早診斷并治療其癌前病變的做法。TCT技術(shù)與電子陰道鏡的檢查手段因其有著顯著的無創(chuàng)性及檢測敏感性，均已日漸作為臨床宮頸癌檢查的常規(guī)手段之一。另一方面，CIN的生物學(xué)行為并不是呈現(xiàn)單純的發(fā)展趨勢，較多的CIN可能會呈現(xiàn)長時間停滯或消退的狀態(tài)，然而由于未能夠找出其轉(zhuǎn)歸預(yù)測的形態(tài)學(xué)依據(jù)，造成臨床中出現(xiàn)部分CIN患者治療不當(dāng)?shù)那闆r。故此，積極研究可以科學(xué)預(yù)測CIN轉(zhuǎn)歸的形態(tài)學(xué)指標(biāo)逐漸成為臨床探索的重要課題。

3.2HR-HPV感染與CIN和宮頸癌出現(xiàn)、發(fā)展的聯(lián)系

研究報道指出，HR-HPV感染與CIN及宮頸癌的出現(xiàn)和發(fā)展有著極大的關(guān)系，生殖道HPV反復(fù)感染會直接引起CIN等不同程度病變的出現(xiàn)；若病毒不斷感染則很大有可能引起宮頸癌[6]。本實驗50例患者中有11例慢性宮頸炎患者、17例LSIL患者、19例HSIL患者以及3例早期宮頸癌患者。在慢性宮頸炎、LSIL、HSIL中，HR-HPV陽性表達(dá)率逐漸上升，分別是36.36%、88.24%、94.74%，在早期宮頸癌中的表達(dá)陽性率為66.67%。研究結(jié)果表明，CIN及宮頸癌的出現(xiàn)與HR-HPV感染有著密切的聯(lián)系；同時隨著病情程度的惡化，其陽性率呈現(xiàn)顯著上升的趨勢。其中，早期宮頸癌患者中HR-HPV表達(dá)陽性率較HSIL低，可能是因本次研究早期宮頸癌患者的病例數(shù)較少。另一方面，由于少數(shù)患者其HR-HPV整合至宿主DNA后，可能會出現(xiàn)其宮頸病變程度的加重而其HR-HPV載量減少的情況；此外，病毒型別的差異可能會引起其病變程度的差異性，盡管其HR-HPV載量較高亦會引起其致癌性的不同，所以，純粹通過HR-HPV載量的分析方式仍需進(jìn)一步探索和總結(jié)。

3.3P16蛋白、HPV L-1殼蛋白與宮頸癌病變的關(guān)系分析

P16基因作為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的抑制因子之一，發(fā)揮著負(fù)調(diào)控細(xì)胞周期的作用，其高表達(dá)與CIN病變程度存在一定的關(guān)聯(lián)性。HPV L-1殼蛋白作為HR-HPV的結(jié)構(gòu)蛋白之一，同時是誘導(dǎo)宿主免疫能力的重要抗原，亦是HPV疫苗形成的重要前提。已有部分研究指出，P16蛋白引起的宮頸癌存在一定的聯(lián)系。原因可能是宿主細(xì)胞P53與Rb基因失活后，使得P16與CDK4/CDK6結(jié)合的途徑受限，從而減輕pRb磷酸化作用，使得轉(zhuǎn)錄因子E2F得以激活，進(jìn)而解除P16蛋白的負(fù)反饋抑制作用，最終使得其蛋白呈現(xiàn)過高表達(dá)[7-8]。當(dāng)HPV進(jìn)展到轉(zhuǎn)化階段時，在HPV L-1殼蛋白表達(dá)缺失的情況下，會使得患者宮頸部分免疫反應(yīng)逐漸降低而引起疾病進(jìn)一步發(fā)展。故此，研究P16蛋白、HPV L-1殼蛋白可利于評估HR-HPV感染的情況。本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在慢性宮頸炎中，P16蛋白表達(dá)陽性率與HR-HPV呈正相關(guān)關(guān)系；在LSIL中，P16蛋白、HPV L-1殼蛋白陽性表達(dá)率與HR-HPV均呈正相關(guān)關(guān)系；在HSIL及早期宮頸癌中，P16蛋白、HPV L-1殼蛋白陽性表達(dá)率與HR-HPV均未存在顯著相關(guān)性?？梢?，HR-HPV較高載量的情況下，能夠在患者疾病早期迅速刺激其宮頸部分的免疫效應(yīng)，而可能會引起P16高表達(dá)；隨著宮頸癌病變程度的提升，P16蛋白、HPV L-1殼蛋白的相關(guān)性并不明顯；如果各種因素引起機(jī)體的免疫效應(yīng)降低，很有可能會導(dǎo)致疾病發(fā)展至早期癌病或癌前病變。

綜上所述，各種指標(biāo)聯(lián)合后對HPV感染宿主的狀態(tài)進(jìn)行綜合分析，更有助于評估患者疾病的預(yù)后情況。P16蛋白、HPV L-1殼蛋白表達(dá)陽性可作為宮頸癌前病變出現(xiàn)的分子事件，兩種蛋白在CINⅠ中與病毒載量存在一定的關(guān)聯(lián)性，但在CINⅡ、CINⅢ與宮頸癌組織中往往以低病毒載量為主，所以相比單一選擇病毒載量進(jìn)行檢測，P16蛋白、HPV L-1殼蛋白在CINⅠ患者疾病預(yù)后的評估作用可能更高。

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[專業(yè)責(zé)任編輯：安瑞芳]

Expressions of P16 and HPV L-1 capsid protein in CIN and early cervical carcinoma and their screening value for cervical precancerous lesions

XIANG Yuan-yuan, WANG Miao-miao, XIE Yan,YUANG Zhi-min

(Department of Obstetrics and Gynecology, Maternal and Child Health-Care Center Affiliated to Medical College of Yangzhou University, Jiangsu Huaian 226600, China)

Objective To analyze the expression and screening value of P16 protein and human papillomavirus L-1 capsid protein in cervical intraepithelial neoplasia (CIN) and cervical carcinoma. Methods Totally 50 patients with CIN and early cervical carcinoma were selected in department of obstetrics and gynecology from Maternal and Child Health-Care Center in Huaian City, and the expressions of P16 and HPV L-1 protein were detected by using hybrid captureⅡand immunohistochemical staining methods. Results The positive rate of P16 in chronic cervicitis (9.09%), low-grade squamous intraepithelial lesion (LSIL) (52.94%), high-grade squamous intraepithelial lesion (HSIL) (84.21%) and early cervical carcinoma (100.00%) were gradually increased (χ2=45.38,P=0.00), and the positive rate of human papillomavirus L-1 capsid protein was 18.18%, 35.29%, 15.79% and 0.00%, respectively, which also had significant differences (χ2=12.59,P=0.00). With the virus load increasing, the positive rates of P16 and human papillomavirus L-1 protein showed significant differences (χ2value was 41.37 and 32.95, respectively, bothP<0.01). In the cases of chronic cervicitis, the positive rate of P16 was positively correlated with the high-risk human papillomavirus (HR-HPV) (r=0.52,P=0.01). In the cases of LSIL, the positive rates of P16 and human papillomavirus L-1 protein were positively correlated with HR-HPV (rvalue was 0.58 and 0.33, respectively, bothP<0.05). In the cases of HSIL and early cervical carcinoma, the positive rates of P16 and human papillomavirus L-1 protein had no significant correlation with high-risk human papillomavirus (rvalue was 0.12, 0.26 and 0.62, respectively, allP>0.05). Conclusion The positive expressions of P16 and human papillomavirus L-1 caspid protein are molecular events of cervical precancerous lesions, which has high value in the screening of CIN and early cervical carcinoma, so it is worthy of clinical application and promotion.

high-risk human papillomavirus (HR-HPV); P16 protein; human papillomavirus L-1 capsid protein; cervical intraepithelial neoplasia (CIN); cervical carcinoma

2017-03-01

項媛媛(1982-)，女，主治醫(yī)師，主要從事宮頸疾病臨床診斷與治療工作。

袁智民，主任醫(yī)師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.07.009

R711.7

A

1673-5293(2017)07-0778-03