過敏性紫癜患兒腸道菌群結(jié)構(gòu)及多樣性研究

陳鵬德，林 燕，楊 潔，郝麗軍，雷 達(dá)，蘭 莉，江 遜，王寶西

(第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院兒科，陜西 西安 710038)

[專題研究]

過敏性紫癜患兒腸道菌群結(jié)構(gòu)及多樣性研究

陳鵬德，林 燕，楊 潔，郝麗軍，雷 達(dá)，蘭 莉，江 遜，王寶西

(第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院兒科，陜西 西安 710038)

目的 探討過敏性紫癜(HSP)患兒的腸道菌群結(jié)構(gòu)及多樣性變化和糞便菌群與黏膜菌群結(jié)構(gòu)及多樣性的差異。方法 收集47例過敏性紫癜患兒糞便樣本和其中7例腹型患兒的結(jié)腸黏膜樣本，以11例健康兒童糞便樣本為對照，采用試劑盒提取法提取樣本DNA并進(jìn)行高通量測序，對測序結(jié)果進(jìn)行生物學(xué)信息分析。結(jié)果 HSP患兒與健康兒童糞便菌群存在結(jié)構(gòu)差異，在門水平兩組均以厚壁菌門(47.10%、57.75%)，變形菌門(23.04%、10.13%)，擬桿菌門(22.81%、21.74%)為主要優(yōu)勢菌群，在科水平，均以腸桿菌科(17.60%、8.72%)、擬桿菌科(18.90%、21.65%)、瘤胃菌科(16.44%、28.93%)、毛螺菌科(11.55%、10.74%)有較高的豐度。HSP患兒糞便菌群中變形菌門、歐文氏菌屬(從目到屬)、擬桿菌屬-uniformis種、巨單胞菌屬、腸球菌屬(從科到屬)豐度高于對照組健康兒童，而雙歧桿菌屬(從目到屬)、鏈球菌屬(從目到屬)、普拉梭菌種(從科到種)豐度低于對照組健康兒童。腹型患兒糞便菌群多樣性高于黏膜菌群；在門水平，糞便菌群以厚壁菌門(53.64%)、變形菌門(33.65%)、擬桿菌門(9.24%)豐度較高，黏膜菌群以變形菌門(88.13%)豐度最高，在科水平，糞便菌群以腸桿菌科(27.18%)、瘤胃菌科(15.58%)、毛螺菌科(12.31%)為優(yōu)勢菌科，黏膜菌群以腸桿菌科(87.19%)為優(yōu)勢菌科；糞便菌群以雙歧桿菌屬(從門到屬)、鏈球菌屬(從門到屬)、動(dòng)性球菌科(從門到科)、丹毒絲菌科(從門到科)、梭菌科(從門到科)、瘤胃菌科(從門到科)、毛螺菌科(從門到科)為主要特征差異細(xì)菌種類，結(jié)腸黏膜菌群以歐文氏菌屬(從門到屬)為主要特征差異細(xì)菌種類。結(jié)論 HSP患兒糞便菌群病原菌或機(jī)會(huì)致病菌增多而有益菌減少，腹型HSP患兒黏膜菌群與糞便菌群存在結(jié)構(gòu)和多樣性差異。

過敏性紫癜；腸道菌群；菌群結(jié)構(gòu)；菌群多樣性；高通量測序

過敏性紫癜(anaphylactoid purpura, AP)又被稱為亨-舒綜合征(henoch-sch?nlein purpura, HSP 或sch?nlein-henoch purpura, SHP)，是兒童期常見的血管炎，是主要影響小血管(毛細(xì)血管及小靜脈或小動(dòng)脈)的全身綜合征，以非血小板減少性紫癜、關(guān)節(jié)炎或關(guān)節(jié)痛、腹痛、胃腸道出血及腎炎為主要臨床表現(xiàn)[1]，小血管壁異常IgA沉積是其病理生理特征，因此2012年Chapel Hill 會(huì)議 (CHCC 2012)的血管炎分類標(biāo)準(zhǔn)基于疾病特點(diǎn)及病因?qū)SP直接命名為IgA血管炎(IgA vasculitis，IgAV)[2]。HSP病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前認(rèn)為與免疫異常有關(guān)，近年來在HSP免疫機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群變化可能影響HSP的發(fā)展及轉(zhuǎn)歸。人體腸道菌群的結(jié)構(gòu)多樣性及功能穩(wěn)定，對于人體健康具有重要意義。本研究應(yīng)用高通量測序技術(shù)檢測HSP患兒與健康兒童腸道菌群，分析比較HSP患兒和健康兒童腸道菌群結(jié)構(gòu)及多樣性差異，以及腹型HSP患兒糞便菌群與結(jié)腸黏膜菌群結(jié)構(gòu)與多樣性差異，為臨床醫(yī)生認(rèn)識(shí)腸道菌群多樣性在HSP發(fā)病中的作用，探索微生態(tài)制劑及其他藥物調(diào)節(jié)腸道菌群以治療HSP、改善HSP預(yù)后提供理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1研究對象1.1.1過敏性紫癜患兒

選取2016年6至12月在唐都醫(yī)院兒科住院的HSP患兒，在發(fā)病一周內(nèi)收集糞便及結(jié)腸黏膜樣本。同期張貼告示招募同齡健康志愿者及附近幼兒園同齡健康兒童作為對照組。

HSP患兒納入標(biāo)準(zhǔn)：①新發(fā)病例；②2～14歲；③符合HSP診斷標(biāo)準(zhǔn)[3](2010 EULAR/PRINTO/PRES共同制定 )。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并有其他系統(tǒng)基礎(chǔ)疾病；②原發(fā)性免疫缺陷病和精神病患者；③標(biāo)本采集前2周內(nèi)使用抗生素、激素、免疫抑制劑、微生態(tài)制劑；

1.1.2 對照組

對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：①2～14歲；②大便常規(guī)檢查無異常；③無哮喘、過敏性咳嗽等過敏性疾病史；④標(biāo)本采集前2周內(nèi)未使用抗生素、激素、微生態(tài)制劑。

HSP患兒及對照組兒童均收集糞便樣本，對其中部分有腹痛癥狀的HSP患兒行電子結(jié)腸鏡及活檢明確腸道黏膜情況，收集結(jié)腸黏膜樣本。

本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，研究對象及家長或監(jiān)護(hù)人均知情同意。

1.2方法

1.2.1樣本收集

1.2.1.1糞便樣本 用無菌棉簽剝?nèi)バ迈r糞便表層，避免混入尿液或其他雜物，更換棉簽，挑取內(nèi)層糞便約1g，裝入無菌凍存管，入液氮罐內(nèi)保存。

1.2.1.2結(jié)腸黏膜樣本 結(jié)腸鏡檢查若有潰瘍，則在潰瘍邊緣活檢鉗夾取表層粘膜；若無潰瘍，則在升、橫、降、乙狀結(jié)腸及直腸部位各取一份，總量約0.05g，裝入無菌凍存管，入液氮罐內(nèi)保存。

1.2.2樣本總DNA提取

試劑盒提取法：采用QIAGEN公司QIAamp?DNA Stool試劑盒提取糞便樣本和結(jié)腸粘膜樣本總細(xì)菌DNA，具體步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.2.3 高通量測序

對提取DNA進(jìn)行16S rDNA高通量測序，測序文庫構(gòu)建及高通量測序由安諾優(yōu)達(dá)基因科技(北京)有限公司進(jìn)行。

1.2.4數(shù)據(jù)處理及生物信息學(xué)分析

1.2.4.1數(shù)據(jù)處理 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0，HSP患兒和對照組健康兒童年齡差異運(yùn)用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)驗(yàn)證，性別差異運(yùn)用卡方檢驗(yàn)，當(dāng)P>0.05時(shí)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.4.2生物信息學(xué)分析OTU分析

分類操作單元(operational taxonomic unit，OTU)，它代表的是一類相似序列的集合，挑選策略是以獲得的序列與參考數(shù)據(jù)庫中的OTUs序列進(jìn)行比對，挑選相似度大于97%的序列歸為一類OTUs。

根據(jù)每個(gè)組間的OTUs交疊情況做出以下Venn圖，Venn圖統(tǒng)計(jì)出每個(gè)組共有與特有的OTUs數(shù)目情況，可以比較直觀的顯示組間的OTUs組成的重疊情況。

Alpha多樣性展示的是樣品內(nèi)的菌群的多樣性情況，包括菌種的類別豐富度及菌種數(shù)目的均勻度。Alpha多樣性越高即細(xì)菌種類越豐富，細(xì)菌數(shù)目越均勻則表示此群落愈加穩(wěn)定。Alpha多樣性指數(shù)包括Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)、Observed_species指數(shù)和Simpson指數(shù)。①Shannon指數(shù)：是根據(jù)樣品中的物種種類以及每個(gè)物種的比例來計(jì)算的多樣性指標(biāo),菌種分布越均勻，其Shannon值越大； ②Chao1指數(shù)：是一個(gè)可以不基于進(jìn)化樹來進(jìn)行評價(jià)物種豐度的一個(gè)指數(shù)，在低豐度樣品特別多的時(shí)候更能體現(xiàn)真實(shí)的多樣性情況； ③Observed_species指數(shù)：是一個(gè)不基于進(jìn)化樹來對物種豐富度進(jìn)行檢測的指數(shù)，就是某次實(shí)驗(yàn)中觀測到的種類數(shù)； ④Simpson指數(shù)：是一種基于分布格局的多樣性的測度方法，是測量一個(gè)種群的集中程度或優(yōu)勢程度的。稀有種對Simpson值的影響較小，而常見種對其的影響較大。

在了解每個(gè)OTUs對應(yīng)的物種后，由于存在同一個(gè)物種具有多個(gè)不同的OTUs的情況。把具有相同物種分類的OTUs合并到一起，統(tǒng)計(jì)不同樣品間的物種成分變化，可以了解不同樣品之間的菌群多樣性。

LefSe(linear discriminant analysis coupled with effect size measurements)分析將線性判別分析和KW rank sum test、Wilcox test相結(jié)合，確定不同的物種對組間差異影響的效應(yīng)大小，從而找出組間特異的一些物種或者對群落結(jié)構(gòu)影響較大的物種。通過LefSe分析可以找出組間在豐度上有顯著差異的物種，具有顯著性差異的物種標(biāo)注在進(jìn)化分支圖的不同分支上，組間的顯著性差異以LDA(線性回歸分析)獲得的LDA分值表示并繪制LDA柱狀圖。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較

2016年6至12月唐都醫(yī)院兒科住院HSP患兒，共入選HSP患兒47例，男34例，女13例，平均年齡(6.51±2.48)歲，其中17例患兒發(fā)病前1～3天內(nèi)曾有上呼吸道感染或過敏等明確的誘因。對有腹痛癥狀的7例患兒行電子結(jié)腸鏡，鏡檢示結(jié)腸不同腸段輕重不等的黏膜充血、水腫、黏膜下點(diǎn)狀、片狀出血，部分可見糜爛、潰瘍，但結(jié)腸黏膜表現(xiàn)與臨床癥狀無明顯相關(guān)；黏膜活檢病理示黏膜組織慢性炎伴炎性滲出，纖維肉芽組織增生及散在嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，部分腺上皮增生活躍，呈輕度不典型增生。HSP患兒予對癥支持治療、部分患兒加用抗生素控制感染、激素抑制炎癥反應(yīng)后，均癥狀好轉(zhuǎn)出院。

對照組兒童11例，平均年齡(5.21±2.68)歲，男6例，女5例。HSP患兒與對照組健康兒童年齡、性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.546、χ2=1.319，均P>0.05),見表1。

Table 1 Comparison of basic information between HSP children and healthy children[±S，n(%)]

2.2 測序與質(zhì)量控制

經(jīng)測序獲得RawReads共6 956 988條，優(yōu)化后獲得CleanReads共6 424 362條，平均每個(gè)樣本98 836條，最多為112 856條/樣本，最少為55 006條/樣本，測序覆蓋度較好，CleanReads經(jīng)PEAR方法拼接后獲得序列3 211 766條，總序列平均讀長454.26bp，共注釋獲得OTU總數(shù)264。Shannon指數(shù)曲線隨測序深度的增加趨向于平坦，表明測序數(shù)據(jù)足夠大，足以反映各組微生物信息，見圖1。

圖1Shannon指數(shù)值與樣品深度的關(guān)系

Fig.1RelationshipbetweenShannonindexandsampledepth

2.3 過敏性紫癜患兒與對照組兒童糞便菌群比較

2.3.1多樣性分析

2.3.1.1OTU交疊Venn圖 兩組OTU總數(shù)為263,有179個(gè)OTU為兩組所共有，有83個(gè)OTU為HSP患兒所獨(dú)有，僅有1個(gè)OTU為對照組健康兒童所獨(dú)有，提示兩組間樣本物種分布具有差異性，見如圖2。

圖2HSP患兒與對照組糞便菌群OTU交疊Venn圖

Fig.2VenndiagramcomparingOTUbetweenHSPchildrenandhealthychildren

2.3.1.2比較兩組樣本OTU及Alpha多樣性指數(shù) 經(jīng)兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P>0.05，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

Table 2 Comparison of diversity of fecal flora between HSPchildren and healthy children(±S)

2.3.2 結(jié)構(gòu)差異分析

2.3.2.1菌群結(jié)構(gòu) 在門水平，兩組均以厚壁菌門，變形菌門，擬桿菌門為主要優(yōu)勢菌群，見圖3；在科水平，均以擬桿菌科、腸桿菌科、瘤胃菌科、毛螺菌科有較高的豐度，見圖4。

圖3 HSP與對照組糞便樣本物種門水平分布柱狀圖

Fig.3 Species distribution histogram at phylum of stool samples of HSP children and healthy children

圖4 HSP與對照組糞便樣本物種科水平分布柱狀圖

Fig.4 Species distribution histogram at family of stool samples of HSP children and healthy children

2.3.2.2差異細(xì)菌種類 通過LefSe分析確定HSP患兒和對照組兒童糞便菌群在豐度上有顯著差異的物種，見圖5、圖6。結(jié)果表明： HSP患兒糞便菌群中變形菌門、歐文氏菌屬(從目到屬)、擬桿菌屬-uniformis種、巨單胞菌屬、腸球菌屬(從科到屬)為主要特征差異細(xì)菌種類，而在對照組健康兒童糞便菌群中雙歧桿菌屬(從目到屬)、鏈球菌屬(從目到屬)、普拉梭菌種(從科到種)為主要特征差異細(xì)菌種類。

注：由內(nèi)至外輻射的圓圈代表了不同的分類級(jí)別。在不同分類級(jí)別上的每一個(gè)小圓圈代表該水平下的一個(gè)分類，小圓圈直徑大小與相對豐度大小呈正比。著色原則：無顯著差異的物種統(tǒng)一著色為黃色，差異物種隨組進(jìn)行著色，分別代表在該組中起到重要作用的微生物類群。圖中英文字母表示的物種名稱在右側(cè)圖例中進(jìn)行展示。

圖5 HSP與對照組糞便菌群LefSe進(jìn)化分支圖

Fig.5 LefSe evolutionary branch map in stool samples of HSP children and healthy children

注：橫坐標(biāo)表示物種的LDA得分，其中顯著差異的LDA值設(shè)置為4，每個(gè)柱子表示一個(gè)物種。

圖6 HSP與對照組糞便菌群LDA值分布柱狀圖

Fig.6 LDA value distribution histogram in stool samples of HSP children and healthy children

2.4腹型HSP患兒糞便與黏膜菌群差異

2.4.1 多樣性分析

2.4.1.1OTU交疊Venn圖 兩組OTU總數(shù)為207,有92個(gè)OTU在兩組所共有，有109個(gè)OTU為糞便菌群所獨(dú)有，僅有6個(gè)OTU為黏膜菌群所獨(dú)有，見圖7，提示結(jié)腸黏膜菌群和糞便菌群分布具有差異性。

圖7 腹型HSP患兒糞便菌群與結(jié)腸黏膜菌群OTU交疊Venn圖

Fig.7 Venn diagram comparing OTU between fecal flora and mucosal flora in HSP children with abdominal symptoms

2.4.1.2腹型HSP患兒糞便菌群與結(jié)腸黏膜菌群OTU、Alpha多樣性分析 比較OTU、chao1指數(shù)、observed_species指數(shù)、shannon指數(shù)、simpson指數(shù)差異經(jīng)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)，糞便菌群多樣性高于黏膜菌群。

Table 3 Comparison of diversity between fecal flora and mucosal flora in HSP children with abdominal symptoms(±S)

2.4.2 結(jié)構(gòu)差異分析

2.4.2.1菌群結(jié)構(gòu) 在門水平，黏膜樣本中變形菌門為優(yōu)勢菌群，而糞便樣本中以厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門為主要優(yōu)勢菌群，見圖8。在科水平，HSP患兒黏膜樣本中腸桿菌科為優(yōu)勢菌群，而糞便中以腸桿菌科、瘤胃菌科、毛螺菌科、芽孢桿菌科、擬桿菌科有較高的豐度，見圖9。

圖8 腹型HSP患兒黏膜和糞便樣本菌群門水平分布柱狀圖

Fig.8SpeciesdistributionhistogramatphylumoffecalfloraandmucosalflorainHSPchildrenwithabdominalsymptoms

圖9 腹型HSP患兒糞便和黏膜菌群科水平分布柱狀圖

Fig.9SpeciesdistributionhistogramatfamilyoffecalfloraandmucosalflorainHSPchildrenwithabdominalsymptoms

2.4.2.2差異細(xì)菌種類 通過LefSe分析確定HSP患兒糞便和黏膜菌群在豐度上有顯著差異的物種，見圖10、圖11。結(jié)果顯示：HSP患兒結(jié)腸黏膜菌群中歐文氏菌屬(從門到屬)為主要特征差異細(xì)菌種類，而HSP患兒糞便菌群中雙歧桿菌屬(從門到屬)、鏈球菌屬(從門到屬)、動(dòng)性球菌科(從門到科)、丹毒絲菌科(從門到科)、梭菌科(從門到科)、瘤胃菌科(從門到科)、厚毛螺菌科(從門到科)為主要特征差異細(xì)菌種類。

注：紅色表示HSP患兒糞便樣本，綠色表示HSP患兒結(jié)腸黏膜樣本，由內(nèi)至外輻射的圓圈代表了不同的分類級(jí)別。在不同分類級(jí)別上的每一個(gè)小圓圈代表該水平下的一個(gè)分類，小圓圈直徑大小與相對豐度大小呈正比。著色原則：無顯著差異的物種統(tǒng)一著色為黃色，差異物種隨組進(jìn)行著色，分別代表在該組中起到重要作用的微生物類群。圖中英文字母表示的物種名稱在右側(cè)圖例中進(jìn)行展示。

圖10HSP患兒結(jié)腸黏膜菌群和糞便菌群LefSe進(jìn)化分支圖

Fig.10LefSeevolutionarybranchmapoffecalfloraandmucosalflorainHSPchildrenwithabdominalsymptoms

注：橫坐標(biāo)表示物種的LDA得分，其中顯著差異的LDA值設(shè)置為4，每個(gè)柱子表示1個(gè)物種。

圖11HSP患兒糞便和黏膜菌群LDA值分布柱狀圖

Fig.11LDAvaluedistributionhistogramoffecalfloraandmucosalflorainHSPchildrenwithabdominalsymptoms

3 討論

隨著人類微生物組計(jì)劃的不斷進(jìn)展，目前越來越多的研究證明人類多種疾病與腸道菌群密切相關(guān)[4]，腸道菌群的作用也有了新的詮釋，微生物-腸-腦軸的提出，對部分神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制提出了新的見解，并且指出了其新的治療方向：益生菌。腸道菌群在免疫性疾病包括過敏性疾病如濕疹、哮喘[5]等及自身免疫性疾病如強(qiáng)直性脊柱炎[6]等疾病的發(fā)病中均發(fā)揮重要作用。HSP是一種具有遺傳易感性人群在感染等因素誘發(fā)下，機(jī)體免疫功能出現(xiàn)異常，以致IgA免疫復(fù)合物在全身小血管壁沉積，促發(fā)炎癥反應(yīng)，而致系統(tǒng)性白細(xì)胞碎裂性小血管炎，其本質(zhì)上也是一種免疫性疾病，腸道菌群紊亂可能發(fā)揮了極其重要的作用。

以往研究HSP腸道菌群[7-8]多應(yīng)用變性梯度凝膠電泳、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等傳統(tǒng)分子生物學(xué)技術(shù)，這些技術(shù)具有其局限性，不能完整地反映整個(gè)群落的結(jié)構(gòu)信息，且耗時(shí)長、工作量大。并且多對糞便標(biāo)本中雙歧桿菌、乳酸桿菌和大腸埃希菌等部分腸道細(xì)菌進(jìn)行分析比較，不能完全表示腸道菌群結(jié)構(gòu)變化。16SrDNA基因是編碼原核生物核糖體16S亞基的基因，其可變區(qū)的V3～4區(qū)常作為人類腸道菌群分類的標(biāo)志[9]。16SrDNA高通量測序技術(shù)可對數(shù)百萬DNA分子同時(shí)測序，由于其測序深度大和準(zhǔn)確性高等特點(diǎn)，目前被廣泛用于微生物研究領(lǐng)域。

3.1 過敏性紫癜患兒與健康兒童糞便菌群種類分析

從OTU交疊Venn圖看出HSP患兒糞便OTU(262)數(shù)值大于健康兒童(180)，提示HSP患兒糞便菌群種類更加豐富，而統(tǒng)計(jì)學(xué)分析HSP患兒與對照組健康兒童糞便菌群OTU均值及Alpha多樣性指數(shù)無差異，原因可能是，HSP患兒總體糞便菌群出現(xiàn)菌群種類較對照組健康兒童增多，但對于每個(gè)HSP患兒糞便菌群出現(xiàn)種類與對照組健康兒童無差異，提示HSP患兒糞便菌群在不同個(gè)體可能是成叢出現(xiàn)，即不同患兒之間菌群種類數(shù)目相似，但菌群種類不一致。

HSP患兒和對照組健康兒童糞便菌群在門水平上，均以厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門為主要優(yōu)勢菌群；在科水平上，均以腸桿菌科、擬桿菌科、瘤胃菌科、毛螺菌科有較高的豐度。對HSP患兒和對照組健康兒童糞便菌群分類學(xué)物種豐度差異進(jìn)行比較，在門、目、科、屬、種水平均發(fā)現(xiàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異細(xì)菌。HSP患兒以變形菌門、歐文氏菌屬(從目到屬)、擬桿菌屬-uniformis種、巨單胞菌屬、腸球菌屬(從科到屬)為主要特征差異細(xì)菌種類，而對照組健康兒則以雙歧桿菌屬(從目到屬)、鏈球菌屬(從目到屬)、普拉梭菌種(從科到種)為主要特征差異細(xì)菌種類。

本研究發(fā)現(xiàn)HSP患兒糞便菌群中變形菌門、歐文氏菌屬(從目到屬)、擬桿菌屬-uniformis種、巨單胞菌屬、腸球菌屬(從科到屬)豐度高于對照組健康兒童。變形菌門屬革蘭陰性桿菌，是兼性厭氧菌，包括多種病原微生物。變形桿菌在健康人體內(nèi)較厚壁菌門和擬桿菌門豐度要少，但在人體口腔、皮膚、胃腸道、陰道等部位均可發(fā)現(xiàn)，其在口腔中豐度要高于其他部位，腸道內(nèi)豐度較少，研究發(fā)現(xiàn)變形菌門豐度增高可作為腸道菌群紊亂的標(biāo)志[10]。本研究也發(fā)現(xiàn)HSP患兒糞便菌群變形菌門豐度高于對照組健康兒童，再次說明HSP患兒存在腸道菌群紊亂。歐文氏菌屬是變形菌門一個(gè)菌屬，通常寄生于植物并可以引起植物腐敗病，研究發(fā)現(xiàn)正常人及干眼癥患者眼球表面[11]、牙齦炎患者齦下菌群中[12]存在歐文氏菌屬的菌種，并可引起疾病如頸淋巴結(jié)炎[13]；擬桿菌屬-uniformis種是擬桿菌門一個(gè)菌種，被認(rèn)為在腸道中可能與異黃酮的降解有關(guān)[14]，部分菌株因含有β內(nèi)酰胺酶或抗氯霉素質(zhì)粒而對青霉素類和頭孢類[15]、氯霉素[16]耐藥，歐文氏菌屬和擬桿菌屬-uniformis種在腸道中的作用還需要進(jìn)一步研究。巨單胞菌屬是厚壁菌門的一個(gè)菌屬，可存在于正常人體腸道菌群中，但在腸道中發(fā)揮的作用還不明確。研究發(fā)現(xiàn)，在濕疹患兒糞便中巨單胞菌屬減少[17]，在Behcet病糞便菌群中巨單胞菌屬減少而雙歧桿菌屬增加[18]。腸球菌屬是厚壁菌門的一個(gè)菌屬，兼性厭氧菌，屬機(jī)會(huì)致病菌，常存在于正常人體腸道中，腸球菌是目前醫(yī)院內(nèi)感染的最重要病原菌之一。

本研究還發(fā)現(xiàn)HSP患兒糞便菌群中雙歧桿菌屬(從目到屬)、鏈球菌屬(從目到屬)、普拉梭菌種(從科到種)豐度低于對照組健康兒童，與以往研究HSP腸道菌群雙歧桿菌及乳桿菌減少[7-8]一致。雙歧桿菌是粘附于腸黏膜上皮的有益菌，粘附于結(jié)腸道黏膜上皮的雙歧桿菌[19]，可以消耗人乳中復(fù)雜寡糖，而使其成為母乳喂養(yǎng)嬰兒腸道中最豐富的定植者；雙歧桿菌能夠抵抗腸道病原菌的定植和入侵、增強(qiáng)腸道上皮的屏障作用,其代謝產(chǎn)物還能夠增強(qiáng)腸道的防御作用，研究發(fā)現(xiàn)，IBD腸道菌群中雙歧桿菌較健康者降低，含有雙歧桿菌的益生菌在誘導(dǎo)和維持潰瘍性結(jié)腸炎緩解以及預(yù)防貯袋炎方面效果明顯[20]。鏈球菌屬是厚壁菌門的一個(gè)菌屬，部分菌種可以引起人體疾病，如腦膜炎、肺炎、心內(nèi)膜炎、結(jié)膜炎等，但大多數(shù)鏈球菌在體內(nèi)并不致病，在人體皮膚、口腔、上呼吸道、胃腸道等部位構(gòu)成與人體共生的正常菌群，并且在人乳中也含有鏈球菌[21]。普拉梭菌是厚壁菌門的一個(gè)菌種，是腸道中發(fā)現(xiàn)的最豐富的菌種之一，在維持腸道健康方面具有重要作用，是腸道主要的產(chǎn)丁酸菌，產(chǎn)生丁酸為腸細(xì)胞提供能量[22]；在多種疾病狀態(tài)下其豐度是降低的，并且認(rèn)為普拉梭菌可以作為生物標(biāo)志物來協(xié)助診斷腸道疾病[23]。瘤胃菌科是厚壁菌門的一個(gè)菌科，研究發(fā)現(xiàn)，在IBD和肝硬化腸道菌群中，瘤胃菌科也有較明顯降低，且瘤胃菌科水平與肝硬化毒素血癥及肝硬化患者嚴(yán)重評分呈負(fù)相關(guān)，顯示瘤胃菌科具有保護(hù)作用[24]。

綜上所述，HSP患兒糞便菌群中病原菌或條件致病菌增多，而有益菌減少，這種糞便菌群的變化可能在HSP的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。在HSP患兒腸道，有益菌可能由于系統(tǒng)性血管炎致腸黏膜水腫出血、腸黏膜遭受損壞而失去黏附位置，有益菌的數(shù)量減少，以致病原菌或條件致病菌由于有益菌的競爭抑制作用減弱而增加，因此，是否能以增加外源性有益菌來調(diào)節(jié)腸道糞便菌群的結(jié)構(gòu)，維持腸道菌群的穩(wěn)定，以恢復(fù)HSP患兒免疫失衡狀態(tài)，改善HSP患兒癥狀還需要進(jìn)一步研究。

3.2腹型患兒糞便與黏膜菌群的差異性分析

腹型HSP患兒糞便和黏膜菌群分布具有差異：在總數(shù)207個(gè)OTU中僅92個(gè)OTU在黏膜菌群和糞便菌群中共同出現(xiàn)，糞便菌群OTU、Alpha多樣性指數(shù)高于黏膜菌群；黏膜菌群中變形菌門(88.13%)豐度最高，而糞便菌群中厚壁菌門(53.64%)豐度最高，變形菌門豐度僅為33.65%；在科水平黏膜菌群腸桿菌科豐度為87.19%，而糞便菌群中腸桿菌科豐度僅為27.18%；對HSP患兒黏膜菌群和糞便菌群分類學(xué)物種豐度差異進(jìn)行比較，在門、綱、目、科、屬水平均發(fā)現(xiàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異細(xì)菌。腹型患兒糞便菌群與結(jié)腸黏膜菌群結(jié)構(gòu)及多樣性存在較大差異。

腸道中的菌群在同段腸管中是分層分布的，內(nèi)層靠近腸粘膜，包括雙歧桿菌和乳酸桿菌等腸道共生菌，對正常生理功能的維持具有重要作用；中間層包括糞桿菌、消化鏈球菌等細(xì)菌；外層包括大腸桿菌、腸球菌等細(xì)菌。黏膜菌群由于直接和腸上皮黏膜接觸，參與腸腔與黏膜代謝交換，維持腸道正常免疫耐受，充當(dāng)腸道黏膜生物屏障，對于機(jī)體具有重要作用，黏膜菌群的變化對于機(jī)體整體正常功能的發(fā)揮以及疾病的發(fā)生發(fā)展均有重要影響。糞便是流體性混合物，與腸腔黏附性較低、變化快，一定程度上會(huì)影響微生物群落的構(gòu)成變化，糞便樣本只能部分反映腸道菌群變化情況。因此在研究中應(yīng)綜合考慮糞便和黏膜菌群結(jié)構(gòu)變化，但在實(shí)際研究中，由于受到醫(yī)學(xué)倫理學(xué)限制，并且部分家長也不愿意進(jìn)行相應(yīng)檢查，因此只能以糞便菌群來表示腸道菌群。

本研究首次通過高通量測序技術(shù)對HSP患兒腸道糞便和黏膜菌群結(jié)構(gòu)及多樣性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)HSP患兒糞便菌群病原菌或機(jī)會(huì)致病菌增多而有益菌較少，腹型HSP患兒糞便菌群和結(jié)腸黏膜菌群結(jié)構(gòu)和多樣性存在差異，糞便菌群不能完全代表腸道菌群，為認(rèn)識(shí)腸道菌群多樣性在HSP發(fā)病中的作用，探索微生態(tài)制劑及其他藥物調(diào)節(jié)腸道菌群以治療HSP、改善HSP預(yù)后提供理論依據(jù)。

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[專業(yè)責(zé)任編輯：劉黎明]

Structure and diversity of intestinal flora in children with Henoch-Sch?nlein purpura

CHEN Peng-de, LIN Yan, YANG Jie, HAO Li-jun, LEI Da, LAN Li, JIANG Xun, WANG Bao-xi

(Department of Pediatrics, Tangdu Hospital of Fourth Military Medical University, Shaanxi Xi’an 710038, China)

Objective To study the structure and diversity of intestinal flora and structure and diversity difference of fecal flora and mucosal flora in children with Henoch-Sch?nlein purpura (HSP). Methods Stool samples from 47 children with HSP were collected, including colon mucosa samples from 7 HSP children with abdominal symptoms, and stool samples from 11 healthy children were used as controls. DNA of samples was extracted using extraction kit method and subjected to high throughput sequencing, and biological information analysis was conducted on results.Results Structure of fecal flora was different between HSP children and healthy children. Predominant bacteria in two groups were Firmicutes (47.10%, 57.75%), Proteobacteria (23.04%, 10.13%) and Bacteroidetes (22.81%, 21.74%) at phylum, and Enterobacteriaceae (17.60%, 8.72%), Bacteroidaceae (18.90%, 21.65%), Ruminococcaceae (16.44%, 28.93%), Lachnospiraceae (11.55%, 10.74%) were more abundant at family. Abundances of Proteobacteria, Erwinia (from order to family), B-uniformis, Megamonas and Enterococcus (from family to genus) in fecal flora of HSP children were higher than those of children in the control group, while abundances of Streptococcus (from order to family), Bifidobacterium (from order to family) and F.prausnitzii (from family to species) in HSP children were lower than those in children in the control group. Diversity of fecal flora was higher than that of mucosal flora in HSP children with abdominal symptoms. Abundances of Firmicutes (53.64%), Proteobacteria (33.65%) and Bacteroidetes (9.24%) were higher in fecal flora at phylum, while abundance of Proteobacteria (88.13%) was higher in mucosal flora. Predominant bacteria in fecal flora were Enterobacteriales (27.18%), Ruminococcaceae (15.58%) and Lachnospiraceae (12.31%) at family, while predominant bacteria in mucosal flora was Enterobacteriaceae (87.19%). Bifidobacterium (from phylum to genus), Streptococcus (from phylum to genus), Planococcaceae (from phylum to family), Erysipelotrichaceae (from phylum to family), Clostridiaceae (from phylum to family), Ruminococcaceae (from phylum to family) and Lachnospiraceae (from phylum to family) were major in fecal flora, while Erwinia (from phylum to genus) was the major bacteria in mucosal flora. Conclusion Pathogenic bacteria or opportunistic pathogen are increased and beneficial bacteria are reduced in feces of children with HSP. Structure and diversity of fecal flora and mucosal flora are different in HSP children with abdominal symptoms.

Henoch-Sch?nlein purpura (HSP); intestinal flora; flora structure; flora diversity; high-throughput sequencing

2017-06-20

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：81370490)

陳鵬德(1986-)，醫(yī)師，在讀碩士研究生，主要從事小兒消化系統(tǒng)疾病及腸道微生態(tài)的研究。

王寶西，教授/主任醫(yī)師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.07.001

R725

A

1673-5293(2017)07-0747-06