基因檢測(cè)對(duì)G6PD酶活性臨界女性臨床診斷價(jià)值的探討

甘翠紅

（天河?jì)D幼保健院檢驗(yàn)科，廣東 廣州 510630）

基因檢測(cè)對(duì)G6PD酶活性臨界女性臨床診斷價(jià)值的探討

甘翠紅

（天河?jì)D幼保健院檢驗(yàn)科，廣東 廣州 510630）

目的 探討分子診斷在G6PD酶活性臨界的女性中的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法 采用PCR和導(dǎo)流雜交技術(shù)，檢測(cè)酶活異常以及酶活處于臨界狀態(tài)臨床樣本的14種常見突變。結(jié)果 100%（60/60）酶活陽性組樣本G6PD基因檢測(cè)均異常，純合和雜合突變比例分別13.3%和86.7%。96.4%（53/55）酶活臨界組的基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)異常，除1例為純合變異外，其余均為雜合子變異。共檢測(cè)出7個(gè)位點(diǎn)的變異，分別為95A＞G、392G＞A、871G＞A、1024C＞T、1311C＞T、1376G＞T及1388G＞A，其中最常見的3種基因型分別為1376雜合（30.4%）、1388雜合（24.4%）、95雜合（10.4%）。結(jié)論 相比于傳統(tǒng)的酶活檢測(cè)方法，分子診斷對(duì)于需進(jìn)一步鑒別診斷的G6PD缺乏女性靈敏度更高。

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶；女性雜合子；分子診斷

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenas，G6PD）缺乏癥是最常見的遺傳性酶缺陷疾病，可導(dǎo)致急性溶血性疾病、新生兒高膽紅素血癥和慢性非球形紅細(xì)胞溶血貧血等疾病。全球約有4億多人受其影響，在地中海沿岸、亞洲、非洲等區(qū)域具較高的發(fā)病率。在我國主要分布在長江流域以南，廣東省是G6PD缺乏癥高發(fā)區(qū)[1]。

目前診斷G6PD缺乏癥普遍采用酶活測(cè)定手段，該方法對(duì)G6PD正常、女性純合子及男性半合子檢測(cè)的靈敏度和特異度均很高，但由于女性雜合子患者的G6PD活性往往正?；蚺R界值，現(xiàn)有的臨床檢測(cè)方法對(duì)女性雜合子的檢測(cè)存在漏診現(xiàn)象[2]。而女性雜合子應(yīng)該盡早發(fā)現(xiàn)并被視為完全缺乏G6PD[3]，所以建立一種高效準(zhǔn)確的G6PD缺陷篩查方法，對(duì)于指導(dǎo)優(yōu)生優(yōu)育、預(yù)防出生缺陷顯得極為重要。本研究旨在探討分子診斷在G6PD酶活性臨界女性中的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院2015年10月～2016年10月進(jìn)行婚檢的女性G6PD直接測(cè)定法確診為G6PD缺乏癥的樣本60例，及G6PD酶活處于臨界值的樣本55例。G6PD缺乏癥陽性組G6PD酶活＜1300 U/L；臨界組G6PD酶活介于1300～2000 U/L。

1.2 方法

1.2.1 樣本處理

采用廣東凱普生物科技股份有限公司生產(chǎn)的血液基因組提取試劑盒，按照說明書對(duì)采集的樣本進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 導(dǎo)流雜交檢測(cè)

采用廣東凱普生物科技股份有限公司生產(chǎn)的G6PD缺乏癥基因突變檢測(cè)試劑盒，按照說明書檢測(cè)樣本6個(gè)外顯子上常見的14種突變： 95A＞G、392G＞A、 487G＞A、493A＞G、592C＞T、871G＞A、1004C＞T、1024C＞T、1311C＞T、1360C＞T、1376G＞T、1381G＞A、1387C＞T和和1388G＞A。

2 結(jié) 果

2.1 導(dǎo)流雜交檢測(cè)結(jié)果

對(duì)115例臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，芯片膜條探針位置。見圖1。

圖1 芯片膜條探針示意圖

女性樣本G6PD酶活陽性組（G6PD酶活＜1300U/L）：N=60，臨界組（G6PD酶活1300～2000U/L）：N=55。100%酶活陽性組樣本基因檢測(cè)均異常，其中純合和雜合突變分別比例分別13.3%和86.7%。96.4%（53/55）臨界組樣本的基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)G6PD異常，除1例為純合變異外，其余均為雜合子變異。共檢測(cè)出7個(gè)位點(diǎn)的變異，分別為95A＞G、392G＞A、871G＞A、1024C＞T、1311C＞T、1376G＞T及1388G＞A，其中最常見的3種基因型分別為1376雜合（30.4%）、1388雜合（24.4%）、95雜合（10.4%）。見表1。

2.2 特殊樣本測(cè)序結(jié)果

71號(hào)樣本95N及95M探針均未顯色，推測(cè)該樣本95A＞ G位點(diǎn)或附近序列發(fā)生其他變異。擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序發(fā)現(xiàn)，該樣本發(fā)生89A＞G純合突變，氨基酸變化為GAT（Asp）-GGT（Gly），其酶活檢測(cè)結(jié)果1341 U/L。見圖2。

3 討 論

國內(nèi)外研究早就證實(shí)G6PD基因突變雜合子是可以發(fā)病的[4]。G6PD雜合子女性平時(shí)無癥狀，因食用蠶豆、服用或解除某些藥物、感染等因素，誘發(fā)急性溶血反應(yīng)。如在孕期可能會(huì)因?yàn)橐陨弦蛩卣T發(fā)急性溶血性貧血，造成胎兒流產(chǎn)或死胎。對(duì)孕前、孕婦夫婦進(jìn)行G6PD缺乏癥產(chǎn)前篩查，可及早發(fā)現(xiàn)雜合子型女性，有利于指導(dǎo)臨床醫(yī)生對(duì)該類孕婦正確用藥，避免醫(yī)源性損傷，有利于醫(yī)生對(duì)該類孕婦提供必要的飲食指導(dǎo)，有助于安全度過妊娠期。因此G6PD缺乏癥女性雜合子的檢測(cè)具有重要意義。

表1 女性115例臨床標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)（n，%）

圖2 71號(hào)樣本檢測(cè)結(jié)果圖A 71號(hào)樣本導(dǎo)流雜交結(jié)果；圖B 71號(hào)樣本95A＞G位點(diǎn)測(cè)序圖

常用的G6PD活性篩查的方法有高鐵血紅蛋白還原實(shí)驗(yàn)、硝基四唑氮藍(lán)紙片法、熒光斑點(diǎn)法以及G6PD/6PGD比值法等。這些方法易受到操作人員、實(shí)驗(yàn)條件，儀器設(shè)備等因素的影響，且不同實(shí)驗(yàn)室間的結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)不一致，對(duì)于臨界值較難判斷。并且，由于女性雜合子的酶活性變化范圍大，加大了檢出的難度[5]。全世界超過180多種G6PD基因突變與G6PD缺乏癥有關(guān)，中國已發(fā)現(xiàn)35種點(diǎn)突[6]。本實(shí)驗(yàn)采用導(dǎo)流雜交技術(shù)檢測(cè)樣本G6PD基因6個(gè)外顯子上14個(gè)常見突變位點(diǎn)。G6PD酶活陽性組全部樣本基因檢測(cè)均異常，其中純合子和雜合子突變比例分別為13.3%和86.7%。96.4%（53/55）臨界組樣本的G6PD基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)異常，除1例為純合變異外，其余均為雜合子變異結(jié)果，提示應(yīng)用傳統(tǒng)酶活檢測(cè)女性雜合子漏檢嚴(yán)重。共檢測(cè)出7個(gè)位點(diǎn)的變異，其中最常見的3種基因型分別為1376雜合、1388雜合、95雜合，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[7]。本研究結(jié)果提示，基因檢測(cè)可以顯著提高女性雜合子G6PD缺陷癥的檢出率。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)一例突變89A＞G，國內(nèi)外未見報(bào)道。

低密度芯片導(dǎo)流雜交技術(shù)是較為成熟的基因檢測(cè)技術(shù)，尤其在檢測(cè)同一基因存在多個(gè)位點(diǎn)突變方面具有較大優(yōu)勢(shì)，廣泛應(yīng)用于耳聾、地貧及復(fù)雜病原微生物或者病原微生物分型檢測(cè)。本研究提示分子診斷方法可以有效的檢出女性雜合子，具重要臨床應(yīng)用價(jià)值。

[1] 張 玲,潘建華,曾征宇.廣東省4個(gè)地區(qū)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥篩查結(jié)果分析.國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2017,38(3)∶378-380.

[2] 朱冬林,朱遠(yuǎn)航,陳亞瓊.2種檢測(cè)女性雜合子G6PD活性的方法比較和探討中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2016,26(3)∶386-388.

[3] Peters AL,Van Noorden CJ.Glucose-6-phosphate dehydrogenase defciency and malaria∶cytochemical detection of heterozygous G6PD defciency in women.J Histochem Cytochem 2009,57∶1003-11.

[4] Kaplan M,Hammerman C,Vreman HJ,et al.Acute hemolysis and severe neontatal hyperbilirubinemia in glucose-6-phosphate dehydrognenase heterozygotes.J Pediatr,2001,139(1)∶137-140.

[5] 何天文,鐘志成,黃濱梅.廣東地區(qū)育齡人群葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥篩查結(jié)果分析.國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2016,37(1)∶103-104.

[6] 林 芬,楊 輝,楊立業(yè).我國葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥的分布特征和基因突變.分子診斷與治療雜志,2016,8(2)∶73-77.

[7] 趙學(xué)峰,李毅堅(jiān),蔡 甜.佛山地區(qū)孕產(chǎn)婦G6PD基因缺陷調(diào)查及干預(yù)模式研究.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床,2016,13(9)∶1172-1176.

本文編輯：趙小龍

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ISSN.2095-8242.2017.35.6872.02