EGCG納米硒的穩(wěn)定性及其對(duì)硒吸收利用的影響

王樂，李歡，李嘉豪，陳暄，黎星輝，孫康

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)茶葉科學(xué)研究所，江蘇 南京 210095

EGCG納米硒的穩(wěn)定性及其對(duì)硒吸收利用的影響

王樂，李歡，李嘉豪，陳暄，黎星輝，孫康*

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)茶葉科學(xué)研究所，江蘇 南京 210095

使用維生素C（Vitamin C，Vc）作為氧化還原劑和(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）作為分散劑，成功制備了納米硒（EGCG-SeNPs）。使用透射電子顯微鏡（TEM）和激光粒度分析儀電動(dòng)電勢(shì)儀（Zetasizer）測定的 EGCG-SeNPs是平均直徑為(35±0.12) nm、Zeta電位為－0.05 mV的球形顆粒。EGCG-SeNPs在 pH1.0的強(qiáng)酸或70℃高溫環(huán)境下發(fā)生聚集，其顆粒大小增加大約10倍。而且，EGCG-SeNPs中的EGCG作為分散劑具有良好的穩(wěn)定性。通過分別灌胃25、50、100 μg·kg-1（以含Se量計(jì)算）的亞硒酸鈉和EGCG-SeNPs發(fā)現(xiàn)，肝臟和腎臟中的硒含量在 50、100 μg·kg-1的硒處理后均顯著增加；在血清、肝臟和腎臟中，所有處理組的谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）活性均顯著增加，且具有劑量依賴效應(yīng)。然而，在相同劑量的亞硒酸鈉和EGCG-SeNPs處理組中，硒含量和 GPx活性之間沒有顯著差異。因此可以得出，Vc作為氧化還原劑制備的EGCG-SeNPs可能具有和亞硒酸鈉相似的生物利用度。

(-)-表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯；硒；納米顆粒；生物利用度；谷胱甘肽過氧化物酶活性

茶是由茶樹（Camellia sinensis (L.) O.Kuntze）的葉片制成的，并且在很久之前就被認(rèn)為是有益健康的飲料[1]。茶的健康作用主要來自于它的兒茶素，這是一組包含了(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、(-)-表沒食子兒茶素、(-)-表兒茶素沒食子酸酯、(-)-表兒茶酸、(+)-沒食子兒茶素和(+)-兒茶素的多酚物質(zhì)[2]。茶多酚對(duì)癌癥等多種病癥都有防治功能[3]。兒茶素在80℃和弱堿性條件下快速地差向異構(gòu)化[4]。其中，EGCG已經(jīng)廣泛應(yīng)用于納米顆粒領(lǐng)域，例如被包裹在脂質(zhì)納米顆粒[1]、共軛金納米顆粒[5]或者殼聚糖-聚天冬氨酸離子作用納米顆粒[6]中。

硒（Se）是一種微量元素，具有降低癌癥發(fā)病率[7]、預(yù)防心血管疾病[8]、治療肌肉紊亂[9]和其他功能[10]，已經(jīng)被認(rèn)為與人類的許多健康益處相關(guān)。硒在多種抗氧化酶的位點(diǎn)起催化作用，例如硫氧還蛋白還原酶和谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）[11]。硒元素存在于植物和動(dòng)物的組織中，主要有硒酸鹽、硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸的 3種形式[12]。無論是低劑量的硒還是高劑量的硒，硒主要在肝臟和腎臟中積累[13]。谷胱甘肽過氧化物酶家族包含：普遍存在于各種細(xì)胞質(zhì)中，尤其是紅細(xì)胞、肝臟、腎臟和肺中高表達(dá)的 GPx1，存在于胃腸的上皮細(xì)胞和肝臟中的 GPx2，存在于血漿中的GPx3，存在于睪丸細(xì)胞內(nèi)的GPx4和存在于嗅覺上皮細(xì)胞及胚胎中的GPx6。在谷胱甘肽過氧化物酶家族中，除GPx4和GPx6外，其余GPx蛋白活力對(duì)硒水平最為敏感，能夠作為機(jī)體內(nèi)硒水平的指標(biāo)[14]。

通常，零價(jià)態(tài)的硒是以黑色或灰色形式存在的，沒有生物活性。Zhang等[15]以亞硒酸鈉為原料，加入蛋白質(zhì)如牛血清白蛋白（BSA）為分散劑，谷胱甘肽（GSH）為還原劑，利用氧化還原體系在弱堿性條件下人工合成了零價(jià)的紅色元素硒納米顆粒（SeNPs）。SeNPs是一種紅色元素膠體，可以保護(hù)乙醇減少氧化應(yīng)激[16]、減少慢性炎癥性關(guān)節(jié)炎[17]、減輕高血糖和高脂血癥[18]等。此外，SeNPs能顯著降低順鉑對(duì)抗氧化活性的抑制作用[19]，并且對(duì)抗氧化性具有提高作用[20]。同時(shí)，已有研究報(bào)道，SeNPs和亞硒酸鹽或半乙基硒代半胱氨酸具有相同的生物利用度，但毒性相對(duì)更低[15,21]。納米硒不僅能夠被分散，也可以被聚乙二醇[22]、多聚糖[23]、褪黑素[24]和三磷酸腺苷[25]等物質(zhì)分散。盡管這些物質(zhì)能夠分散納米硒，除BSA納米硒外，其余均沒有比較硒的生物利用度。然而，最近有文獻(xiàn)報(bào)道聚乙酸/羥基乙酸共聚物包裹的納米顆粒的分散劑會(huì)在胃酸中降解，而導(dǎo)致納米顆粒的口服生物利用度降低[26]。因此，評(píng)價(jià)新制備納米硒顆粒的生物利用度很重要。

在調(diào)節(jié)涉及結(jié)腸癌發(fā)生的遺傳和表觀遺傳生物標(biāo)志物的方式中，硒和綠茶的組合在抑制結(jié)腸直腸腫瘤形成方面比單獨(dú)使用硒更有效[27]。兒茶素能夠作為分散劑制備納米銀[28]、納米金[29]和納米碳管[30]。本研究團(tuán)隊(duì)曾經(jīng)報(bào)道過 EGCG能夠分散的納米硒，由于該納米硒在擬胃酸環(huán)境中大量聚沉，形成微米級(jí)顆粒，導(dǎo)致其口服生物利用度下降。本研究改進(jìn)了 EGCG分散的 SeNPs的制備條件，并對(duì)EGCG納米硒的穩(wěn)定性及其對(duì)硒吸收利用的影響進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）（純度大于 99%）購買于杭州怡倍嘉茶葉發(fā)展公司。亞硒酸鈉、Vc、還原型輔酶Ⅱ（NADPH）、甲酸、純乙腈、谷胱甘肽還原酶購買于Sigma-Aldrich化學(xué)公司。還原型谷胱甘肽（GSH）購于背景索萊寶生物有限公司。所有試劑都為分析純?cè)噭?/p>

1.2 EGCG-SeNPs的制備和表征

將適量EGCG溶于純水中攪拌5 min。將適量Vc加入EGCG溶液中，同樣攪拌5 min。然后將亞硒酸鈉溶液（Se含量為10 mg·mL-1）加入到前溶液中并攪拌。Se、Vc和EGCG的終濃度分別為 5、25、20 mmol·L-1。將溶液立即調(diào)節(jié)至pH 2.5，幾分鐘后調(diào)節(jié)至pH 8.5。最終的亮紅色溶液就是EGCG-SeNPs溶膠，4℃保存待用。顆粒的形態(tài)和大小用透射電鏡（TEM，H-7650，日立，日本）依照 Sanna等[31]的方法進(jìn)行檢測，Zeta電位用激光粒度分析儀電動(dòng)電勢(shì)儀（Malvern Zetasizer Nano ZS，英國）在室溫25℃下測定。

1.3 EGCG-SeNPs中EGCG的穩(wěn)定性評(píng)估

用超高效液相儀（Waters，美國）分別測定剛制備的EGCG-SeNPs和放置于4℃冰箱中1個(gè)月的 EGCG-SeNPs（OM-EGCG-SeNPs）中的EGCG含量。標(biāo)樣的含量依次為2、10、20、100、200 mg·mL-1。將 EGCG 納米硒離心（20 000 g，4℃）30 min，將上清液稀釋1 000倍，然后通過 0.22 μm的膜。用 2%的甲酸和純乙腈進(jìn)行梯度洗脫：0～2 min，5%乙腈；3～5 min，5%乙腈；6～6.5 min，50%乙腈；6.6～8 min，5%乙腈；進(jìn)樣速度為0.350 mL·min-1，進(jìn)樣量為2 μL，檢測波長 280 nm。

1.4 EGCG-SeNPs的酸堿度和熱穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

在制備EGCG-SeNPs時(shí)，在將pH調(diào)節(jié)為2.5后，將部分EGCG納米硒倒出，分別調(diào)節(jié)至pH1.0和pH5.0，剩下的依然調(diào)節(jié)至pH8.5。將一部分 pH8.5的樣品留存待測，另一部分pH8.5的EGCG-SeNPs分別在70℃加熱0、3、12 h，所有樣品在4℃保存待用。用TEM表征不同樣品的形態(tài)和大小；用光學(xué)圖像識(shí)別EGCG-SeNPs的顏色變化；用多功能酶標(biāo)儀（Cytation 3，Bio-Tex，意大利）測定不同條件下制備的 EGCG-SeNPs在不同波長下的吸收值。

1.5 動(dòng)物處理

雄性的 ICR小鼠（18～22 g）購于常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。缺硒飼料購買于南通特洛菲飼料科技有限公司。小鼠飼養(yǎng)在塑料籠中，塑料籠置于濕度為(50±10)%、溫度(24±1)℃和 12 h光/暗循環(huán)的房間內(nèi)，小鼠可以自由獲得食物和水。喂食42只雄性ICR小鼠缺硒飼料5周，以建立缺硒小鼠模型。將缺硒小鼠隨機(jī)分為 7組：（1）對(duì)照組（CK）灌胃鹽水；（2）Se處理組灌胃含 25、50、100 μg·kg-1（以含 Se量計(jì)算）的亞硒酸鈉溶液；（3）EGCG-SeNPs處理組灌胃給予含25、50、100 μg·kg-1（以含 Se 量計(jì)算）的 EGCG-SeNPs膠體。所有小鼠連續(xù)灌胃 7 d，并在最后一天的24 h后眼眶靜脈取血、脫頸處死，備用。

1.6 硒含量和GPx活性分析

將從眼眶中取出的血液經(jīng)離心（10 000 g，4℃，10 min），取出上清血清，并將血清和血細(xì)胞分開單獨(dú)保存。解剖小鼠獲得肝臟和腎臟，并在冰的生理鹽水中洗凈。所有樣品保存在－20℃用作進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)分析。用冰冷的磷酸鹽緩沖液（PBS，0.15mol·L-1，pH7.2，1 mmol·L-1EDTA·Na2）將肝臟和腎臟的組織樣品進(jìn)行勻漿，然后將勻漿液離心（12 000 g，4℃）15 min，并取出干凈的上清液儲(chǔ)存在－20℃用作生化分析。采用 Bradford[32]的方法進(jìn)行蛋白含量的測定，采用Smith等[33]的方法進(jìn)行 GPx活性的測定。通過改進(jìn) Zinn等[34]的方法，使用微波消解系統(tǒng)（Ethos T，Milestone，意大利）和電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（Optima 2100DV，Perkin Elmer，美國）進(jìn)行硒含量的測定。

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用Graphpad Prism 5.0軟件分析數(shù)據(jù)，并以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用ANOVA進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 EGCG-SeNPs的特性表征

TEM 圖顯示，新制備的 EGCG-SeNPs，其平均直徑約(35±0.12) nm（圖 1-a）。EGCG-SeNPs溶液的 Zeta電位為－0.05 mV（圖 1-b），這表明分布在 EGCG溶液中的SeNPs傾向于相互排斥而不聚集。UPLC的結(jié)果顯示 OM-EGCG-SeNPs和 EGCG-SeNPs中的 EGCG含量變化很?。▓D 1-c和圖 1-d）。OM-EGCG-SeNP中的 EGCG的含量為(9.82±0.11) mg·mL-1，而 EGCG-SeNPs中的為(10.00±0.04) mg·mL-1。在 4℃冰箱中放置 1 個(gè)月后，EGCG-SeNPs中的 EGCG含量并沒有發(fā)生顯著降低。該結(jié)果表明，在先酸后堿的情況下，EGCG充當(dāng)穩(wěn)定劑而不是氧化劑，以維持SeNPs的穩(wěn)定性。

2.2 pH和溫度對(duì)EGCG-SeNPs的影響

TEM圖顯示，在不同 pH下制備的EGCG-SeNPs具有不同的形狀和大?。▓D2-a、圖2-b和圖2-c）。在pH1.0時(shí)，EGCG納米硒是絲狀的，直徑在300～400 nm；在pH5.0時(shí)，EGCG納米硒是長方形的，直徑在 200～250 nm；在 pH8.5時(shí)，EGCG納米硒是六邊形，近似于球形，直徑約 40 nm。此外，隨著 pH值的降低，紅色也逐漸變淺（圖 2-d）。EGCG-SeNPs的吸光值在不同pH條件下相差較大。EGCG-SeNPs在pH8.5條件下的吸光值遠(yuǎn)高于pH1.0和pH5.0兩種條件（圖2-e）。

圖1 EGCG-SeNPs的特征Fig. 1 Characteristics of EGCG-SeNPs

圖2 EGCG-SeNPs的pH特性Fig. 2 pH property of EGCG-SeNPs

在pH8.5條件下，用70℃分別加熱0、3、12 h后，EGCG-SeNPs也呈現(xiàn)了不同的形態(tài)和大小。（圖 3-a、圖 3-b和圖 3-c）。在 75℃加熱 0 h時(shí)（即不加熱），EGCG納米硒是六邊形的，近似于球形，直徑約在40 nm；在75℃加熱3 h時(shí)，EGCG納米硒富集成了模糊的球形，直徑約在200 nm；在75℃加熱12 h時(shí)，EGCG納米硒繼續(xù)富集成較為清晰的球形，直徑約在 400 nm。這表明，持續(xù)高溫加熱能夠使 EGCG納米硒顆粒變大，發(fā)生聚沉。聚沉的 EGCG-SeNPs使得原本的紅色膠體變得輕微渾濁（圖 3-d）。不同加熱時(shí)間處理的EGCG-SeNPs的吸光值變化不顯著（圖3-e）。

2.3 EGCG-SeNPs的口服利用度

灌胃硒可以增加組織中硒的水平[35]，而且 GPx活力對(duì)組織內(nèi)硒水平比較敏感[12]。因此，可通過測定組織硒水平和 GPx活力用于比較亞硒酸鈉與EGCG-SeNPs的硒利用水平，從而評(píng)價(jià) EGCG-SeNPs的硒吸收利用水平。如圖 4 所示，在肝臟中，Selenite-50、SeNPs-50、Selenite-100和 SeNPs-100組的硒含量顯著高于CK組（圖4-a）。在腎臟中，所有處理組的硒含量都顯著高于CK組（圖4-b）。但在肝臟和腎臟中，亞硒酸鈉處理組和 EGCG-SeNPs處理組的硒含量都不存在劑量依賴效應(yīng)。并且，在肝臟和腎臟中，每對(duì)相同的硒濃度的亞硒酸鈉和 EGCG-SeNPs組之間都沒有出現(xiàn)顯著差異，這表明亞硒酸鈉和 EGCG-SeNPs之間的硒積累沒有顯著差異。

圖3 EGCG-SeNPs的溫度特性Fig. 3 Temperature property of EGCG-SeNPs

GPx可以保護(hù)生物體免受自由基的氧化損傷，并且是身體氧化應(yīng)激的關(guān)鍵指示[36]。血清、肝臟和腎臟中的GPx活性如圖5所示。在血清中（圖5-a），與CK組相比，所有亞硒酸鈉或EGCG-SeNPs組的GPx活性均顯著增加，并且在每對(duì)亞硒酸鈉和 EGCG-SeNPs組之間，都存在劑量依賴效應(yīng)，即：隨著亞硒酸鈉和 EGCG-SeNPs給藥濃度的增加，GPx活性顯著增加。在腎臟中，在相同的硒濃度的亞硒酸鈉和EGCG-SeNPs組之間的GPx活性沒有表現(xiàn)出顯著差異（圖5-c）。GPx活性在腎臟和肝臟中的變化趨勢(shì)和血清中的非常相似這些結(jié)果表明，EGCG-SeNPs具有與亞硒酸鈉類似的生物利用度，并且給藥的硒濃度越高，EGCG-SeNPs的生物利用度越高。

3 小結(jié)與討論

本研究得出的結(jié)論是利用 Vc作為還原劑，EGCG作為分散劑，制備的EGCG-SeNPs對(duì)擬胃酸環(huán)境和高溫有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，而且小鼠口服該納米硒的硒吸收利用程度與口服亞硒酸鈉相似。

在本研究中，EGCG-SeNPs最初在pH2.5下制備，然后調(diào)節(jié)至pH1.0、pH5.0和pH8.5。TEM圖像顯示EGCG-SeNPs在不同的pH中會(huì)呈現(xiàn)不同形狀：絲狀、矩形和六邊形，且顆粒大小隨著 pH的降低而增加（圖 2）。研究表明，正電荷的鉻硒納米棒可以自組織成絲狀納米結(jié)構(gòu)[37]，這與EGCG-SeNPs在pH1.0時(shí)的形狀相同。Sau等[38]發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)節(jié)Vc的濃度可以產(chǎn)生不同結(jié)構(gòu)的納米晶體，如長方形，這和EGCG-SeNPs在pH5.0時(shí)的形狀相同。

圖4 肝臟和腎臟中的硒含量Fig. 4 Selenium content in liver and kidney

圖5 血清、肝臟和腎臟中的GPx活性Fig. 5 GPx activity in serum, liver and kidney

此外，還有報(bào)道表明，EGCG-SeNPs在pH1.0時(shí)會(huì)發(fā)生廣泛聚集并且失去納米特征[39]，這與本研究發(fā)現(xiàn) pH1.0條件下納米硒尺寸增加的結(jié)果相似。因此，EGCG-SeNPs在pH1.0的條件下，能夠發(fā)生激烈的聚集，其顆粒尺寸大約增加10倍。在pH8.5的條件下，以70℃加熱0、3、12 h后，EGCG-SeNPs分別呈現(xiàn)六邊形、球形和球形，且隨著加熱時(shí)間的增加，顆粒大小明顯增加。已有研究表明，納米顆粒的熱穩(wěn)定性取決于其顆粒大小，相比于小直徑的納米顆粒，大直徑的納米顆粒在加熱過程中更容易轉(zhuǎn)變成納米棒[40]。不難發(fā)現(xiàn)，在加熱 3 h和12 h后，EGCG-SeNPs的平均直徑分別從(35±0.12) nm增加到約200 nm和400 nm。這是因?yàn)槌掷m(xù)高溫破壞了 EGCG-SeNPs的穩(wěn)定性，使得納米顆粒從均勻的 EGCG分散體系中出來，相互聚集在一起。Su等[41]發(fā)現(xiàn)兒茶素在 70℃保存 3 h后其濃度會(huì)降低。在低溫（25～100℃）的等溫反應(yīng)中，發(fā)現(xiàn)了 EGCG的同時(shí)降解和差向異構(gòu)化[42]。EGCG-SeNPs在200～900 nm波長處的吸光度表明，隨著pH值的降低，吸光度下降（圖2-e）。其原因可能是解離 EGCG在酸性條件下能夠進(jìn)入 SeNPs系統(tǒng)。然而，EGCG-SeNP的吸光度在加熱或不加熱的那些之間沒有顯著的差異（圖3-e）。由于 EGCG-SeNPs在沒有足夠氧氣的密閉環(huán)境中加熱，EGCG氧化不明顯。因此，吸光度沒有發(fā)生顯著的變化。

之前的研究指出，EGCG在酸性條件下的質(zhì)子化導(dǎo)致 SeNPs的大量聚集，而在谷胱甘肽體系的堿性條件下，雖能成功制備成EGCG-SeNPs，由于在擬胃酸環(huán)境中該顆粒發(fā)生聚集，3 min內(nèi)形成微米級(jí)顆粒導(dǎo)致生物利用度顯著降低[36]。然而，在這項(xiàng)研究中，EGCG-SeNPs在擬胃酸環(huán)境中或高溫條件下盡管發(fā)生聚集，但是其納米硒顆粒大小能夠長時(shí)間保持在 300～400 nm，從而使得其硒的生物利用度與亞硒酸鈉相比沒有顯著下降。另外，EGCG的氧化還原電位為+420 mV，Se4+/Se為+320 mV，這意味著 EGCG無法還原亞硒酸鈉。因此，可以使用氧化還原電位為－166 mV的 Vc作為還原劑，將四價(jià)硒還原成零價(jià)硒。同時(shí)，作為含有四羥基的強(qiáng)酸性物質(zhì)，Vc可以更容易地提供酸性環(huán)境,避免EGCG降解和異構(gòu)化。Chen等[43]認(rèn)為，添加Vc可以提高EGCG的穩(wěn)定性，并且具有劑量效應(yīng)。同時(shí)，Vc還可以提高作為兒茶素主要結(jié)構(gòu)的二聚體的穩(wěn)定性[44]。因此，作為還原劑，Vc可以通過減少多酚自由基和可溶性氧的體積來保護(hù)EGCG。

小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，肝臟和腎臟中，亞硒酸鈉和 EGCG-SeNPs中的硒含量均明顯高于CK 組（圖 4-a和 4-b），這直接證明EGCG-SeNPs中的硒可以在體內(nèi)積累和吸收。相同濃度下的亞硒酸鈉和 EGCG-SeNPs處理后的硒含量沒有顯著差異，這說明二者有著相似的生物利用度。研究結(jié)果還顯示，無論在血清、肝臟還是腎臟中，與CK組相比，隨著硒含量的增加，所有亞硒酸鹽或 EGCG-SeNPs處理組中的 GPx活性均顯著升高。這一現(xiàn)象表明，SeNPs具有有效的生物利用度，且伴隨劑量依賴性作用?？梢酝茰y，在酸性條件下制備的而不是之前在堿性條件下制備 SeNPs通過胃內(nèi)給藥在胃液中可以保持生物利用度。其原因可能是，EGCG在制備過程中發(fā)生了質(zhì)子化，這使得其在 SeNPs的內(nèi)部或表面沒有發(fā)生去質(zhì)子化。由于 EGCG在通過胃液時(shí)沒有發(fā)生質(zhì)子化，所以 EGCG-SeNPs的聚集速度非常緩慢。

綜上所述，EGCG-SeNPs可以用Vc作氧化還原劑在先pH2.5后pH8.5的條件下成功制備。EGCG-SeNPs良好的理化性質(zhì)保證了其動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的良好用途，使得 EGCG-SeNPs的生物利用度不會(huì)降低。然而，關(guān)于EGCG-SeNPs的毒性需要進(jìn)一步的探究以期獲得更好的應(yīng)用。

[1] Radhakrishnan R, Kulhari H, Pooja D, et al. Encapsulation of biophenolic phytochemical EGCG within lipid nanoparticles enhances its stability and cytotoxicity against cancer [J]. Chemistry and Physics of Lipids, 2016, 198:51-60.

[2] Li J, Wang X. Binding of (-)-epigallocatechin-3-gallate with thermally-induced bovine serum albumin/ι-carrageenan particles [J]. Food Chemistry, 2015, 168: 566-571.

[3] 鄔新榮, 王岳飛, 張士康, 等. 茶多酚保健功能研究進(jìn)展與保健食品開發(fā)[J]. 茶葉科學(xué), 2010, 30(S1): 501-505.

[4] Ishino N, Yanase E, Nakatsuka S. Epimerization of tea catechins under weakly acidic and alkaline conditions [J].Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2010, 74(4):875-877.

[5] Mukherjee S, Ghosh S, Das D K, et al. Gold-conjugated green tea nanoparticles for enhanced anti-tumor activities and hepatoprotection—Synthesis, characterization and in vitro evaluation [J]. The Journal of Nutritional Biochemistry,2015, 26(11): 1283-1297.

[6] 洪志勇. EGCG-CS-PAA納米粒的制備及其生物活性研究[D]. 杭州: 浙江工商大學(xué), 2015.

[7] Lipinski B. Sodium selenite as an anti-cancer agent [J].Anti-Cancer Agents in Medicinal chemistry, 2017, 17(5):658-661.

[8] Alehagen U, Alexander J, Aaseth J. Supplementation with selenium and coenzyme Q10 reduces cardiovascular mortality in elderly with low selenium status. A secondary analysis of a randomised clinical trial [J]. PLoS One, 2016,11(7): e0157541. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0157541.

[9] Passerieux E, Hayot M, Jaussent A, et al. Effects of vitamin C, vitamin E, zinc gluconate, and selenomethionine supplementation on muscle function and oxidative stress biomarkers in patients with facioscapulohumeral dystrophy:a double-blind randomized controlled clinical trial [J]. Free Radical Biology and Medicine, 2015, 81: 158-169.

[10] Hatfield D L, Tsuji P A, Carlson B A, et al. Selenium and selenocysteine: roles in cancer, health, and development [J].Trends in biochemical sciences, 2014, 39(3): 112-120.

[11] Amin K A, Hashem K S, Alshehri F S, et al. Antioxidant and hepatoprotective efficiency of selenium nanoparticles against acetaminophen-induced hepatic damage [J].Biological Trace Element Research, 2017, 175(1): 136-145.

[12] Whanger P D. Selenocompounds in plants and animals and their biological significance [J]. Journal of the American College of Nutrition, 2002, 21(3): 223-232.

[13] Loeschner K, Hadrup N, Hansen M, et al. Absorption,distribution, metabolism and excretion of selenium following oral administration of elemental selenium nanoparticles or selenite in rats [J]. Metallomics, 2014, 6(2):330-337.

[14] Papp LV, Lu J, Holmgren A, et al. From selenium to selenoproteins: synthesis, identity, and their role in human health [J]. Antioxid Redox Signal, 2007, 9(7): 775-806.

[15] Zhang J S, Gao X Y, Zhang L D, et al. Biological effects of a nano red elemental selenium [J]. Biofactors, 2001, 15(1):27-38.

[16] Kalishwaralal K, Jeyabharathi S, Sundar K, et al. Sodium selenite/selenium nanoparticles (SeNPs) protect cardiomyoblasts and zebrafish embryos against ethanol induced oxidative stress [J]. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology, 2015, 32: 135-144.

[17] Malhotra S, Welling M N, Mantri S B, et al. In vitro and in vivo antioxidant, cytotoxic, and anti-chronic inflammatory arthritic effect of selenium nanoparticles [J]. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials,2016, 104(5): 993-1003. doi: 10.1002/jbm.b.33448. Epub 2015 May 20.

[18] Al-Quraishy S, Dkhil M A, Moneim A E A.Anti-hyperglycemic activity of selenium nanoparticles in streptozotocin-induced diabetic rats [J]. International Journal of Nanomedicine, 2015, 10: 6741.

[19] Jafari Dehkordi A, Mohebbi A N, Aslani M R, et al.Evaluation of nanoselenium (Nano-Se) effect on hematological and serum biochemical parameters of rat in experimentally lead poisoning [J]. Human & Experimental Toxicology, 2017, 36(4):421-427. doi: 10.1177/0960327116651124. Epub 2016 Jun 1.

[20] 劉紅芳, 鄧澤元, 徐靚, 等. 乳酸菌源納米硒對(duì)小鼠抗氧化性能的影響[J]. 食品工業(yè)科技, 2014, 23: 360-365.

[21] Zhang J, Wang X, Xu T. Elemental selenium at nano size(Nano-Se) as a potential chemopreventive agent with reduced risk of selenium toxicity: comparison with se-methylselenocysteine in mice [J]. Toxicological Sciences,2008, 101(1): 22-31.

[22] Zheng S, Li X, Zhang Y, et al. PEG-nanolized ultrasmall selenium nanoparticles overcome drug resistance in hepatocellular carcinoma HepG2 cells through induction of mitochondria dysfunction [J]. Int J Nanomedicine, 2012, 7:3939-3949. doi: 10.2147/IJN.S30940.

[23] Zhang Y, Wang J, Zhang L. Creation of highly stable selenium nanoparticles capped with hyperbranched polysaccharide in water [J]. Langmuir, 2010, 26(22):17617-17623.

[24] Wang H, Wei W, Zhang SY, et al. Melatonin-selenium nanoparticles inhibit oxidative stress and protect against hepatic injury induced by Bacillus Calmette-Gué rin/lipopolysaccharide in mice [J]. J Pineal Res, 2005, 39(2):156-163.

[25] Zhang Y, Li X, Huang Z, et al. Enhancement of cellpermeabilization apoptosis-inducing activity of selenium nanoparticles by ATP surface decoration [J]. Nanomedicine,2013, 9(1): 74-84.

[26] Jain AK, Goyal AK, Mishra N, et al. PEG-PLA-PEG block copolymeric nanoparticles for oral immunization against hepatitis B [J]. Int J Pharm, 2010, 387(1/2):253-262. doi:10.1016/j.ijpharm.2009.12.013.

[27] Hu Y, McIntosh G H, Le Leu R K, et al. Combination of selenium and green tea improves the efficacy of chemoprevention in a rat colorectal cancer model by modulating genetic and epigenetic biomarkers [J]. PLoS One,2013, 8(5): e64362.

[28] Loo YY, Chieng BW, Nishibuchi M, et al. Synthesis of silver nanoparticles by using tea leaf extract from Camellia sinensis [J]. Int J Nanomedicine, 2012, 7: 4263-4267.

[29] Nune SK, Chanda N, Shukla R, et al. Green nanotechnology from tea: phytochemicals in tea as building blocks for production of biocompatible gold nanoparticles [J]. J Mater Chem, 2009, 19(19): 2912-2920.

[30] Chen Y, Lee YD, Vedala H, et al. Exploring the chemical sensitivity of a carbon nanotube/green tea composite [J].ACS Nano, 2010, 4(11): 6854-62.

[31] Sanna V, Pala N, Dessì G, et al. Single-step green synthesis and characterization of gold-conjugated polyphenol nanoparticles with antioxidant and biological activities [J].International Journal of Nanomedicine, 2014, 9: 4935.

[32] Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding [J]. Analytical biochemistry,1976, 72(1/2): 248-254.

[33] Smith A D, Levander O A. High-throughput 96-well microplate assays for determining specific activities of glutathione peroxidase and thioredoxin reductase [J].Methods in Enzymology, 2002, 347: 113-121.https://doi.org/10.1016/S0076-6879(02)47012-7.

[34] Zinn G M, Rahman G M M, Faber S, et al. Evaluation of dietary supplement contamination by xenobiotic and essential elements using microwave-enhanced sample digestion and inductively coupled plasma-mass spectrometry[J]. Journal of Dietary Supplements, 2016, 13(2): 185-208.

[35] Raspopov R V, Arianova E A, Trushina E N, et al. Zero valent seleniume nanoparticles bioavailability estimation in rats [J]. Voprosy Pitaniia, 2010, 80(4): 36-41.

[36] Kabel A M. Free radicals and antioxidants: role of enzymes and nutrition [J]. World Journal of Nutrition and Health,2014, 2(3): 35-38.

[37] Artemyev M, Kisiel D, Abmiotko S, et al. Self-Organized,Highly Luminescent CdSe Nanorod- DNA Complexes [J].Journal of the American Chemical Society, 2004, 126(34):10594-10597.

[38] Sau T K, Murphy C J. Room temperature, high-yield synthesis of multiple shapes of gold nanoparticles in aqueous solution [J]. Journal of the American Chemical Society, 2004, 126(28): 8648-8649.

[39] Wu S, Sun K, Wang X, et al. Protonation of epigallocatechin-3-gallate (EGCG) results in massive aggregation and reduced oral bioavailability of EGCG-dispersed selenium nanoparticles [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2013, 61(30): 7268-7275.

[40] Zhang J, Taylor E W, Wan X, et al. Impact of heat treatment on size, structure, and bioactivity of elemental selenium nanoparticles [J]. International Journal of Nanomedicine,2012, 7: 815-825. doi: 10.2147/IJN.S28538.

[41] Su Y L, Leung L K, Huang Y, et al. Stability of tea theaflavins and catechins [J]. Food Chemistry, 2003, 83(2):189-195.

[42] Wang R, Zhou W, Jiang X. Reaction kinetics of degradation and epimerization of epigallocatechin gallate (EGCG) in aqueous system over a wide temperature range [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2008, 56(8):2694-2701.

[43] Chen Z Y, Zhu Q Y, Wong Y F, et al. Stabilizing effect of ascorbic acid on green tea catechins [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1998, 46(7): 2512-2516.

[44] Zhu Q Y, Hammerstone J F, Lazarus S A, et al. Stabilizing effect of ascorbic acid on flavan-3-ols and dimeric procyanidins from cocoa [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51(3): 828-833.

The Evaluation of the Stability of EGCG-Selenium Nanoparticles and Its Effect on Selenium Absorption and Utilization

WANG Le, LI Huan, LI Jiahao, CHEN Xuan, LI Xinghui, SUN Kang*
Tea Research Institute, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China

(-)-epigallocatechin-3-gallate (EGCG) dispersed Selenium nanoparticles (EGCG-SeNPs) were prepared using vitamin C (Vc) and EGCG as the redox agent and dispersant. Characteristics of EGCG-SeNPs, which were determined using transmission electron microscope (TEM) and zetasizer, were spherical in shape with a mean diameter of (35±0.12) nm and -0.05 mV zeta potential. The particles were aggregated in strong acid and high temperature conditions (pH1.0 and 70℃), with the particle size increased by about 10 times. And, EGCG in EGCG-SeNPs had good stability as a dispersant. With the administration of 25, 50 and 100 μg·kg-1(Calculated with selenium content), selenium content in liver and kidney of 50 and 100 μg·kg-1sodium selenite and EGCG-SeNPs treated mice were significantly increased. Glutathione peroxidase (GPx) activity in serum, liver and kidney of all the treatment groups were significantly increased in a dose-dependent manner. However, there was no significant difference between sodium selenite and EGCG-SeNPs at the same dose on selenium content and GPx activity. Hence, it can be concluded that EGCG-SeNPs synthesized using Vc as the redox agent might have the similar bioavailability to sodium selenite.

(-)-epigallocatechin-3-gallate, selenium, nanoparticle, bioavailability, glutathione peroxidase activity

TS272；Q946.84+1

A

1000-369X（2017）04-373-10

2017-05-05

2017-05-26

江蘇省自然科學(xué)基金（BK20160735）、江蘇省博士后科學(xué)基金（1601078C）、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（CARS-23）、江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目

王樂，女，碩士研究生，主要從事茶葉生物化學(xué)與綜合利用研究。*通訊作者：sunkang@njau.edu.cn