液相色譜測(cè)定單糖與二糖和低聚半乳糖的方法研究

車永進(jìn)+岳子賀+戚克進(jìn)

摘 要：目前有多種方法可以測(cè)定低聚糖中各種組分的含量，包括毛細(xì)管電泳定量分析、氣相色譜法、薄層層析法]和高壓液相色譜法，其中高壓液相色譜法因操作方便、分析速度快而被廣泛應(yīng)用。高壓液相色譜法又根據(jù)檢測(cè)器的不同分為：紫外可見光二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)（UV-DAD）、脈沖安培檢測(cè)器定量分析、和示差折光檢測(cè)器檢測(cè)[等。該研究采用高壓液相色譜分析，示差折光檢測(cè)器檢測(cè)，嘗試采用Zorbax Carbohydrate柱、Aichrom-NH2和Sugar Pak Ι三種色譜柱同時(shí)檢測(cè)樣品中的葡萄糖、乳糖和低聚半乳糖中三糖、四糖和五糖，確定最佳的色譜分析柱和色譜操作條件。

關(guān)鍵詞：液相色譜 測(cè)定 單糖 二糖 低聚半乳糖

中圖分類號(hào)：TH86 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-3791（2017）07（b）-0108-02

由于人體腸道內(nèi)不具備分解消化低聚半乳糖的酶系統(tǒng)， 因而低聚半乳糖在體內(nèi)不能被胃酸和胃酶降解， 故不能被消化吸收， 而是直接進(jìn)入小腸內(nèi)被有益菌尤其是雙歧桿菌利用， 對(duì)人體發(fā)揮獨(dú)特的生理功能，因此被定義為“益生元”，它能有效促進(jìn)體內(nèi)雙歧桿菌的生長繁殖，改善脂質(zhì)代謝，促進(jìn)鈣的吸收和維生素的合成，具有分解致癌物質(zhì)、提高人體免疫力等功能。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

儀器：高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；電子天平AR3130（奧豪斯儀器（上海）有限公司）；液相色譜柱分別為Zorbax Carbohydrate（4.6×150 mm，美國安捷倫科技有限公司）、氨基柱Aichrom-NH2（4.6×250 mm，美國Abel工業(yè)有限公司）和Sugar Pak Ι（4×300 mm，美國Waters公司）。

材料：葡萄糖、乳糖由美國sigam公司提供，低聚半乳糖（其中含半乳三糖、四糖和五塘）由煙臺(tái)華海生物制品有限提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜柱的選擇

各種糖組分的含量分析采用高效液相色譜法。色譜系統(tǒng)為美國安捷倫公司提供的Agilent 1200，色譜柱分別為Zorbax Carbohydrate（4.6×150 mm，美國安捷倫公司）、氨基柱Aichrom-NH2（4.6×250 mm，美國Abel工業(yè)有限公司）和Sugar Pak Ι（4×300 mm，美國Waters公司）。如果沒有特別說明，則色譜條件為：G1362A 示差折光檢測(cè)器，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，柱溫25 ℃，前面兩種柱子采用乙腈與水的混合液為流動(dòng)相，調(diào)整流動(dòng)相組成使其達(dá)到最佳分離效果；Sugar PakⅠ的流動(dòng)相為雙蒸蒸餾水。

1.2.2 流動(dòng)相組成的選擇

流動(dòng)相為乙腈與水的混合物，體積比分別為65∶35、70∶30和75：25，比較不同流動(dòng)相組成對(duì)分離效果的影響。

1.2.3 洗脫流速的選擇

洗脫流速分別為0.5、1和1.5 mL/min，比較不同的洗脫流速對(duì)分離效果的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

Zorbax Carbohydrate、Aichrom-NgH2、Sugar Pak Ι中的三種色譜柱都能夠有效地分離低聚半乳糖中的各種組分，進(jìn)行定性或定量測(cè)定。但Sugar Pak Ι柱在使用一段時(shí)間后，柱效很快降低，可能是因?yàn)镾ugar Pak Ι中的固定相為鈣型陽離子交換樹脂，低聚半乳糖樣品中存在的少量陽離子（原料生產(chǎn)時(shí)緩沖溶液中的少量離子，或用少量NaOH調(diào)整 pH值時(shí)帶入的鈉離子）很容易將固定相樹脂中的鈣離子置換下來，不但嚴(yán)重影響測(cè)定結(jié)果的重現(xiàn)性，而且大大降低色譜柱的使用壽命，并且Sugar Pak Ι的價(jià)格約是另外兩種柱子的3倍，因此，該研究中糖溶液不適宜用Sugar Pak Ι進(jìn)行分析。

氨基柱Zorbax Carbohydrate 和Aichrom-NgH2價(jià)格相當(dāng)，實(shí)驗(yàn)條件下分析低聚半乳糖混合物，Zorbax Carbohydrate柱比Aichrom-NH2出峰快，分析時(shí)間短，色譜柱的理論塔板數(shù)高。雖然兩種柱子對(duì)各種糖組分的選擇性相差不大，但前者分離各種糖組分的分離度明顯高于后者；采用Aichrom-NH2柱分析，只對(duì)葡萄糖和乳糖的分離度超過了1.5，其他各種糖組分之間的分離度都小于1.5。因此氨基柱Zorbax Carbohydrate的分離效果更好，故該研究后面的實(shí)驗(yàn)都采用Zorbax Carbohydrate柱對(duì)低聚半乳糖進(jìn)行定性和定量分析測(cè)定。

2.2 流動(dòng)相組成的確定

色譜條件：Zorbax-Carbohydrate色譜柱（4.6×150 mm），柱溫25 ℃，G1362A示差檢測(cè)器，流動(dòng)相流速1 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，流動(dòng)相為乙腈與水的混合物，體積比分別為65∶35、70∶30和 75∶25，得到不同流動(dòng)相組成對(duì)低聚半乳糖的分離效果。

隨著流動(dòng)相中乙腈含量的增加，流動(dòng)相的非極性增強(qiáng)，各種糖組分在柱中的保留時(shí)間增加，分離度增大。乙腈與水的比例為65∶35時(shí)，分析一個(gè)樣品只需要7 min，流動(dòng)相比例為75∶25時(shí)，分析一個(gè)樣品需17 min。但從上述結(jié)果可以看出，流動(dòng)相比例為65∶35的選擇性和分離度也最小，只有葡萄糖和乳糖之間的分離度大于1.5，其他各種糖組分之間的分離度都小于1.5，而流動(dòng)相比例為70∶30和75∶25的分離度都遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于1.5，并且分離度和選擇性相差不大，而前者比后者出峰時(shí)間早，分析一個(gè)樣品可以節(jié)約5 min，故確定最佳的流動(dòng)相比例為70∶30。

2.3 流動(dòng)相流速的確定

流動(dòng)相的流速影響塔板高度，從而影響分離效果。流動(dòng)相流速太快，柱效降低，但流速太慢，又會(huì)因增加擴(kuò)散而降低分離度。該研究分別考察了流動(dòng)相流速分別為0.5、1.0和1.5 mL / min的分離效果。

可以看出：流動(dòng)相的流速越大，出峰越快，色譜峰越窄，分離的理論塔板數(shù)越多，同時(shí)選擇性越小，分離度也越小。但3個(gè)流速下的分離度均大于1.5，這表明各種糖組分都已完全分離。相比之下，流速為1.0和0.5 mL/min時(shí)，其分離度和選擇性均優(yōu)于1.5 mL/min，而且柱壓較低。1.0和0.5 mL/min的分離度和選擇性相差不大，而1.0 mL/min的出峰速度快，分析一個(gè)樣品比后者要節(jié)約10 min，故取1.0 mL/min為最佳洗脫流速。

3 結(jié)語

根據(jù)色譜柱同時(shí)分離單糖、二糖和低聚半乳糖組分的分離度和選擇性，以及色譜柱的價(jià)格和使用壽命，確定安捷倫公司的Zorbax Carbohydrate 柱可以很好地定性分析和定量測(cè)定單糖、二糖和低聚半乳糖混合物中各種組分的含量。最佳的色譜分離條件為：采用示差折光檢測(cè)器檢測(cè)，流動(dòng)相為乙腈與水的混合物，體積比70∶30；洗脫流速1.0 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

參考文獻(xiàn)

[1] Osborn H，Khan TH.Oligosaccharides：Their synthesis and biological roles[M].New York：Oxford University Press，2000：7.

[2] Roberfroid M，Slavin J.Nondigestible oligosaccharides[J].Crit. Rev. Food Sci. Nutr.，2000，40（6）：461-480.

[3] 張劍波，田庚元.寡糖分離和結(jié)構(gòu)分析進(jìn)展[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，1998，25（2）：325-330.

[4] 李健.氣相色譜法測(cè)定大豆制品中的低聚糖[J].黑龍江商學(xué)院學(xué)報(bào)，1990，6（4）：66-72.