• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    DNA疫苗浸泡免疫預(yù)防鱖魚傳染性脾腎壞死病毒

    2017-08-22 02:39:59周偉東周勇劉奕張立強(qiáng)鄧平艾桃山
    湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年14期
    關(guān)鍵詞:鱖魚

    周偉東+周勇+劉奕+張立強(qiáng)+鄧平+艾桃山+曾令兵+喻運(yùn)珍+喻婷

    摘要:以ISKNV MCP基因?yàn)槟康幕?,克隆到真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)中,構(gòu)建成DNA疫苗pcMCP,對(duì)鱖魚(Siniperca chuatsi)pcMCP DNA疫苗進(jìn)行浸泡免疫效果研究。結(jié)果表明,pcMCP DNA疫苗能夠刺激免疫系統(tǒng),對(duì)非特異性免疫和IgM的表達(dá)都具有激活作用。免疫后血液中白細(xì)胞含量、白細(xì)胞吞噬能力和SOD活力都顯著提高,14 d時(shí)均達(dá)到最大。IgM和Mx基因的mRNA表達(dá)研究顯示,72 h大量表達(dá),96 h達(dá)到最大,分別是對(duì)照組的3.05倍和2.02倍。攻毒試驗(yàn)顯示,浸泡免疫能夠有效保護(hù)ISKNV感染的鱖魚,在第11天,浸泡免疫組的累計(jì)死亡率僅為40%,而對(duì)照組死亡率都達(dá)到了100%,pcMCP浸泡免疫降低了ISKNV感染的鱖魚死亡率。

    關(guān)鍵詞:鱖魚(Siniperca chuatsi);DNA疫苗;浸泡免疫;傳染性脾腎壞死病毒

    中圖分類號(hào):S942.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):0439-8114(2017)14-2731-05

    DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.14.034

    Abstract:In this study, ISKNV MCP gene was cloned into eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1(+) to construct DNA vaccine,pcMCP,to study the immune effect of DNA vaccine. The results showed that immersion immunity by pcMCP DNA vaccine could stimulate the immune system. After immunization,White blood cell content,leukocyte phagocytosis and SOD were significantly improved,and they reached the maximum at 14th day. The mRNA level of IgM and Mx gene was expressed at 72 h,and reached the maximum at 96 h, and they were upto 3.05 fold and 2.02 fold respectively,compared with control group. Challenge test, immersion immunization could effectively protect the ISKNV infected mandarin fish. at the eleventh day,the total death rate of immersion immunization groupwas only 40%, the control groups were mortality rate reached 100%. So these results showed that immersion immunity of DNA vaccine reduced death of ISKNV infected Mandarin fish.

    Key words:mandarin fish(Siniperca chuatsi); DNA vaccine; immersion immunization; infectious spleen and kidney necrosis virus

    病毒性疾病對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成的損失呈上升趨勢(shì),且大多缺乏針對(duì)性的治療藥物和手段,疫苗防控作為疾病控制方法越來越受到水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的重視[1,2]。目前,大量使用的注射免疫方式使得水產(chǎn)疫苗在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的應(yīng)用和推廣受到了很大的限制。因此,開發(fā)使用簡(jiǎn)單、成本低廉的DNA疫苗和免疫方式對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)尤為重要。研究表明,基于黏膜系統(tǒng)的疫苗能夠提高病原體感染后試驗(yàn)動(dòng)物的生存能力[3,4]。DNA疫苗不僅能夠通過黏膜系統(tǒng)使魚體產(chǎn)生足夠的免疫保護(hù)力,同時(shí)還能夠刺激機(jī)體非特異性免疫產(chǎn)生額外的免疫保護(hù)力[5-8]。

    鱖魚病毒病對(duì)中國(guó)的鱖魚養(yǎng)殖業(yè)造成很大危害,其主要病原是傳染性脾腎壞死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)。目前,鱖魚病毒病還沒有特效藥物,仍以預(yù)防為主,通過水質(zhì)調(diào)節(jié),免疫增強(qiáng)為主,疫苗防治為鱖魚養(yǎng)殖業(yè)急需。由于鱖魚是肉食性魚類,性格暴躁,只吃活魚,口服或注射的免疫方式很難在鱖魚養(yǎng)殖中使用,疫苗浸泡免疫是鱖魚免疫的惟一選擇。Fernandez-Alonso等[9]在鱒魚上利用DNA疫苗浸泡免疫預(yù)防出血性敗血癥病毒的研究中,浸泡組在第35天的死亡率比對(duì)照組降低了36%。ISKNV主要衣殼蛋白(Major capside protein,MCP)是病毒粒子的主要抗原蛋白,本研究克隆了ISKNV MCP基因,構(gòu)建了重組MCP基因的DNA疫苗(pcMCP),并對(duì)鱖魚苗進(jìn)行浸泡免疫,免疫后血液中白細(xì)胞含量、白細(xì)胞吞噬能力和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)都顯著提高,IgM和Mx基因的mRNA在72 h大量表達(dá),pcMCP浸泡免疫降低了ISKNV感染的鱖魚死亡率。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

    鱖魚購(gòu)自武漢佳恒水產(chǎn)鱖魚繁殖廠,體重40~50 g,試驗(yàn)水池內(nèi)暫養(yǎng),水溫25 ℃,連續(xù)通氣。

    1.2 DNA疫苗的構(gòu)建

    以ISKNV核酸為模板,利用表1中的引物P1和P2擴(kuò)增MCP基因全長(zhǎng)序列,表中下劃線表示限制性內(nèi)切酶Kpn I和 EcoR I的酶切位點(diǎn)。將PCR產(chǎn)物MCP基因克隆到真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)中,構(gòu)建DNA疫苗真核表達(dá)質(zhì)粒pcMCP。

    1.3 MCP基因在鯉魚上皮瘤細(xì)胞中的表達(dá)

    將鯉魚上皮瘤細(xì)胞(Epithelioma papulosum cyprini,EPC)接種在6孔板中,用含10%牛血清的M199培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)成單層后,通過脂質(zhì)體Lipofectamine 2000,將重組質(zhì)粒pcMCP轉(zhuǎn)染到EPC細(xì)胞中。在轉(zhuǎn)染后72 h將細(xì)胞用4%多聚甲醛于4 ℃固定,以兔抗MCP多克隆抗體為一抗,紅色熒光探針標(biāo)記的羊抗兔IgG(H+L)抗體為二抗,DAPE為細(xì)胞核染色劑,參照免疫熒光染色試劑盒(Beyotime,免疫熒光染色試劑盒—抗兔Cy3)對(duì)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的EPC細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)用轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1(+)的EPC細(xì)胞作為對(duì)照進(jìn)行相同操作。

    1.4 血細(xì)胞計(jì)數(shù)和白細(xì)胞吞噬活性

    取樣采血后,立即用事先配制的Dacie液稀釋血液,血球計(jì)數(shù)板計(jì)血細(xì)胞數(shù)[紅細(xì)胞(Blood cell,RBC)與白細(xì)胞(White blood cell,WBC)],重復(fù)計(jì)數(shù)3次。將金黃色葡萄球菌菌液(Staphylococcus aureus)加入終濃度為0.3%的福爾馬林溶液,恒溫水浴鍋28 ℃滅活48 h,即濃度為1×108 CFU/mL的金黃色葡萄球菌,作為吞噬原,置于4 ℃冰箱備用。0.2 mL抗凝血中加入0.05 mL經(jīng)福爾馬林滅活的金黃色葡萄球菌,充分混勻后置25 ℃恒溫水浴鍋中孵育60 min,每10 min搖勻1次,1 000 r/min離心10 min,吸取白細(xì)胞層制涂片3張。Wright-Giemsa染液混合染色,油鏡下觀察。吞噬活性以吞噬百分比(Phagocytic percentage,PP),計(jì)算公式為:PP=N100/100×100%;N100指100個(gè)吞噬細(xì)胞中參與吞噬的細(xì)胞數(shù)。

    1.5 SOD活力測(cè)定

    使用超氧化物歧化酶試劑盒(購(gòu)于南京建城生物工程研究所)進(jìn)行測(cè)定,采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活力。

    1.6 RT-PCR檢測(cè)樣品中IgM和Mx基因表達(dá)量

    利用熒光定量PCR分析免疫鱖魚魚體免疫相關(guān)基因(Mx、IgM)的表達(dá)差異。分別在浸泡免疫后12、24、48、72、96 h采樣,每組隨機(jī)取3尾魚,解剖取其脾臟組織,用Trizol(Invitrogen)提取樣品中的總RNA,經(jīng)DNase Ⅰ消化后,反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈。按照Realtime PCR Master Mix(SYBR Green)試劑盒中的操作說明,在AB Plus one熒光定量PCR儀上對(duì)所取的試驗(yàn)樣品進(jìn)行RT-PCR。

    1.7 免疫保護(hù)試驗(yàn)

    將健康鱖魚(40~50 g)隨機(jī)分為2組,每組30尾,即對(duì)照組和免疫組。免疫組浸泡于濃度為100 ng/mL pcMCP質(zhì)粒的免疫浸泡液中30 min,對(duì)照組浸泡于PBS溶液中,浸泡免疫后25 ℃恒溫養(yǎng)殖,投喂鯪魚。免疫后第28天進(jìn)行攻毒試驗(yàn),各組每尾魚通過腹腔注射10×TCID50 ISKNV,連續(xù)觀察15 d,記錄感染發(fā)病和死亡情況,計(jì)算相對(duì)免疫保護(hù)率(Relative percent survival,RPS)。RPS=[1-(免疫組死亡率/對(duì)照組死亡率)]×100%

    2 結(jié)果與分析

    2.1 pcMCP的重組質(zhì)粒構(gòu)建及真核表達(dá)

    以鱖傳染性脾腎壞死病毒主衣殼蛋白MCP基因?yàn)槟康幕颍肕CP特異性引物PCR擴(kuò)展MCP基因,插入到真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)中,構(gòu)建成DNA疫苗pcMCP。PCR鑒定結(jié)果顯示,大小約為1 300 bp的ISKNV MCP基因成功克隆到真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)上(圖1A)。

    脂質(zhì)體Lipofectamine 2000介導(dǎo)真核重組質(zhì)粒pcMCP轉(zhuǎn)染EPC細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后72 h間接熒光免疫試驗(yàn)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的EPC細(xì)胞胞質(zhì)中可觀察到紅色熒光見圖1B。同時(shí)用pcDNA3.1(+)空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染EPC細(xì)胞作為對(duì)照進(jìn)行間接熒光免疫試驗(yàn),未發(fā)現(xiàn)任何熒光。這表明成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒pcMCP能夠在EPC細(xì)胞中表達(dá)。

    2.2 鱖魚血液中白細(xì)胞數(shù)目和吞噬活性分析

    經(jīng)DNA疫苗浸泡免疫后,免疫組鱖魚白細(xì)胞變化趨勢(shì)計(jì)數(shù)結(jié)果如圖2A所示。DNA浸泡免疫后,鱖魚外周血白細(xì)胞數(shù)目都有不同程度的增加,其中14 d和21 d浸泡組白細(xì)胞顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。白細(xì)胞吞噬試驗(yàn)結(jié)果(圖2B)顯示,在7~21 d浸泡免疫組中白細(xì)胞吞噬滅活的金黃色葡萄球菌的吞噬百分比顯著高于對(duì)照組(P<0.05),第28天的浸泡免疫組的吞噬百分比高于對(duì)照組,但差異不顯著。同時(shí)還發(fā)現(xiàn),鱖魚白細(xì)胞中的中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞存在吞噬多個(gè)滅活的金黃色葡萄球菌的現(xiàn)象。

    2.3 對(duì)血清超氧化物歧化酶活性的影響

    SOD活力檢測(cè)結(jié)果如圖3所示,免疫后鱖魚血清中SOD活力與對(duì)照相比有所提高,其中7 d和14 d浸泡免疫組SOD活力顯著高于對(duì)照組(P<0.05),21 d和28 d浸泡免疫組SOD酶活比對(duì)照組有所提高,但差異不顯著。

    2.4 浸泡免疫對(duì)IgM和Mx基因表達(dá)的影響

    實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)DNA疫苗浸泡免疫對(duì)鱖魚脾臟中IgM mRNA表達(dá)變化如圖4,在浸泡免疫后48 h內(nèi),IgM mRNA表達(dá)量與對(duì)照組幾乎沒有變化,72 h后IgM mRNA表達(dá)量逐步升高,72 h IgM mRNA表達(dá)量是PBS組的2.04倍,96 h達(dá)到3.05倍。DNA疫苗浸泡免疫能夠有效激活鱖魚體液免疫。

    RT-PCR檢測(cè)DNA疫苗浸泡免疫對(duì)鱖魚脾臟中Mx mRNA表達(dá)變化如圖5,浸泡免疫后12 h和24 h,脾臟中Mx mRNA的表達(dá)量略低于PBS組, 72 h和96 h的Mx mRNA表達(dá)量分別是PBS組的1.45倍和2.02倍。隨時(shí)間的增加,浸泡免疫組Mx基因表達(dá)量逐步增加。

    2.5 ISKNV DNA疫苗浸泡免疫的保護(hù)效果

    用10×TCID50 ISKNV攻毒后,免疫組與對(duì)照組在11 d內(nèi)均出現(xiàn)了不同程度的死亡,死亡時(shí)間集中在攻毒的第5天后,如圖6所示。DNA疫苗浸泡免疫鱖魚后產(chǎn)生了較高的免疫力,PCR檢測(cè)死亡鱖魚為ISKNV陽性,同時(shí)觀察其發(fā)病癥狀,與自然環(huán)境下感染ISKNV發(fā)病癥狀相同,表明其死亡原因是由于人工感染ISKNV所致。免疫后第11天,ISKNV DNA疫苗浸泡免疫組累計(jì)死亡率40%,空質(zhì)粒pcDNA3.1(+)和PBS對(duì)照組累計(jì)死亡率為100%。

    3 討論

    魚類的嗜中性白細(xì)胞和單核細(xì)胞已被證實(shí)有很強(qiáng)的吞噬能力,白細(xì)胞的吞噬作用是魚類非特異免疫的重要組成部分[10]。通過對(duì)鱖魚進(jìn)行DNA疫苗浸泡免疫,鱖魚白細(xì)胞數(shù)和白細(xì)胞吞噬百分比與對(duì)照組相比都有所增加,而且白細(xì)胞中大量存在一個(gè)白細(xì)胞吞噬多個(gè)金黃色葡萄球菌的現(xiàn)象。pcMCPE DNA疫苗浸泡免疫后,鱖魚吞噬細(xì)胞的吞噬活性被提高。除此之外,魚類的紅細(xì)胞也有一定的吞噬活性,本研究在鏡檢中也觀察到了許多紅細(xì)胞的吞噬現(xiàn)象,由此可見鱖魚的紅細(xì)胞在免疫反應(yīng)中也發(fā)揮了一定的免疫調(diào)節(jié)作用。

    SOD常作為動(dòng)物體極為重要的一類非特性免疫因子,在各種需氧生物體內(nèi)廣泛存在,它可以抑制和清除超氧陰離子自由基,保護(hù)細(xì)胞免受損傷,屬于機(jī)體內(nèi)的防御系統(tǒng)酶類。SOD活力與機(jī)體的免疫水平密切相關(guān),對(duì)增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的防御功能和整個(gè)機(jī)體的免疫機(jī)能發(fā)揮著十分重要的作用[11]。本研究顯示,浸泡免疫可以提高血清SOD活力,免疫后7~14 d的血清SOD活力顯著高于對(duì)照組。

    Mx蛋白是一類由I型干擾素(IFN)誘導(dǎo)表達(dá)的抗病毒蛋白,當(dāng)機(jī)體或細(xì)胞受到病毒感染時(shí),能與其他干擾素誘導(dǎo)的蛋白一起形成體內(nèi)抗病毒感染的防線,以達(dá)到抗病毒的目的。本研究結(jié)果表明,浸泡免疫后鱖魚脾臟中Mx mRNA相對(duì)表達(dá)量隨時(shí)間呈上升趨勢(shì),72 h和96 h的Mx mRNA含量分別是對(duì)照組的1.45倍和2.02倍。DNA疫苗浸泡免疫后,IgM mRNA表達(dá)含量隨時(shí)間呈上升趨勢(shì),與對(duì)照組比 72 h達(dá)到2.04倍,96 h達(dá)到3.05倍。pcMCP DNA疫苗浸泡免疫能夠激活天然免疫和特異性免疫。在本研究中Mx和IgM mRNA大量表達(dá)出現(xiàn)在72 h,疫苗刺激的效應(yīng)基因表達(dá)較晚,可能是因?yàn)镈NA疫苗浸泡后的細(xì)胞攝入、抗原表達(dá)、加工、識(shí)別,以及免疫效應(yīng)分子的表達(dá)都需要一定的時(shí)間。本研究結(jié)果與斜帶石斑魚、牙鲆免疫浸泡后IgM基因的表達(dá)相一致[12,13],結(jié)合之前的相關(guān)報(bào)道,IgM表達(dá)高峰出現(xiàn)時(shí)間可能與魚的種類、疫苗、免疫方式等有關(guān),DNA疫苗浸泡免疫的產(chǎn)生要晚于蛋白疫苗免疫。

    通過對(duì)免疫后的鱖魚攻毒試驗(yàn)顯示,DNA疫苗浸泡組在免疫后第11天的累計(jì)死亡率為40%,而未免疫組在第11天已經(jīng)全部死亡,對(duì)照組死亡時(shí)間主要集中在5~9 d,這與Mx基因和IgM基因在第3天后大量表達(dá)相一致。

    參考文獻(xiàn):

    [1] EVENSEN O,LEONG J A. DNA vaccines against viral diseases of farmed fish[J].Fish & Shellfish Immunology,2013,35(6):1751-1758.

    [2] KURATH G. Biotechnology and DNA vaccines for aquatic animals[J].Revue Scientifique Et Technique,2008,27(1):175-196.

    [3] RAJESHK S,AHMEDVPIS,PARAMESWARAN V,et al. Potential use of chitosan nanoparticles fororal delivery of DNA vaccine in Asian sea bass(Lates calcarifer) to protect from Vibrio (Listonella) anguillarum[J].Fish & Shellfish Immunology,2008, 25(2):47-56.

    [4] VIMAL S,MAJEED S A,NAMBI K S N,et al. Delivery of DNA vaccine using chitosan-tripolyphosphate(CS/TPP)nanoparticles in Asian sea bass,Lates calcarifer(Bloch,1790) for protectionagainst nodavirus infection[J].Aquaculture,2014,420-421:240-246.

    [5] ABU-ELALA N M,MOHAMED S H,ZAKI M M,et al. Assessment of theimmune-modulatory and antimicrobial effects of dietary chitosan on Niletilapia(Oreochromis niloticus) with special emphasis to its bio-remediatingimpacts[J].Fish & Shellfish Immunology,2015,46(2):678-685.

    [6] CHENG W,YU J S. Effects of the dietary administration of sodium alginate onthe immune responses and disease resistance of Taiwan abalone,Haliotisdiversicolor supertexta[J].Fish & Shellfish Immunology,2013,34(3):902-908.

    [7] FUJIKI K,MATSUYAMA H,YANO T. Protective effect of sodium alginates againstbacterial infection in common carp,Cyprinus carpio L.[J].Journal of Fish Diseases,2010,17(4):349-355.

    [8] LIN S,PAN Y,LUO L,et al. Effects of dietary beta-1,3-glucan,chitosan or raffinoseon the growth,innate immunity and resistance of koi(Cyprinus carpio koi)[J].Fish & Shellfish Immunology,2011,31(6):788-794.

    [9] FERNANDEZ-ALONSO M,ROCHA A,COLL J M. DNA vaccination by immersion and ultrasound to trout viral haemorrhagic septicaemia virus[J].Vaccine,200,19(23-24):3067-3075.

    [10] IAKHNENKO V M,KLIMENKOV I V. Specific features of blood cell composition and structure in fishes from the pelagial and coastal zones of Lake Baikal[J].Biology Bulletin,2009, 36(1):37-44.

    [11] 李 赫,宋文華,于 翔,等.幾種免疫增強(qiáng)劑對(duì)草魚SOD、CAT及AKP活性的影響[J].水產(chǎn)學(xué)雜志,2010,23(4):7-8.

    [12] CUI M,ZHANG Q Z,YAO Z J,et al. Immunoglobulin M gene expression analysis of orange-spotted grouper, Epinephelus coioides,following heat shock and Vibrio alginolyticus challenge[J].Fish Shellfish Immunol,2010,29(6):1060-1065.

    [13] 宋曉青,邢 婧,戰(zhàn)文斌.牙鲆經(jīng)注射和浸泡免疫鰻弧菌滅活疫苗后7種免疫相關(guān)基因表達(dá)的變化[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué),2014, 21(4):747-758.

    猜你喜歡
    鱖魚
    徽州臭鱖魚
    臭鱖魚——時(shí)間轉(zhuǎn)化的美味
    鱖魚行情又遭暴擊!4天內(nèi)至少下跌2元/斤,新魚上市幾經(jīng)波折
    持續(xù)陰雨期間鱖魚養(yǎng)殖池常見問題及管理措施
    鱖魚26元/斤,中大難求!是繼續(xù)等還是賣?就地過年,鱖魚能否“貴”起來?
    鱖魚蛙虹彩病毒病的臨床癥狀和流行特點(diǎn)
    飼料鱖魚是大勢(shì)所趨!鱖魚馴化魚苗技術(shù)尚未普及,是制約行業(yè)發(fā)展的瓶頸
    春令時(shí)鮮說鱖魚
    特別文摘(2019年6期)2019-03-16 05:45:16
    Chinese Perch:Dream Beauty Portrayedin Art, Poetry
    文化交流(2019年1期)2019-01-11 01:34:26
    今年“老鱖魚”庫(kù)存萎縮近3成,現(xiàn)廣東存塘量不足5%,行業(yè)內(nèi)漲聲一片
    久久久久久人人人人人| 男人添女人高潮全过程视频| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 国产成人啪精品午夜网站| 黄色a级毛片大全视频| 亚洲五月色婷婷综合| 日本91视频免费播放| 久久av网站| 天天操日日干夜夜撸| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 午夜免费鲁丝| 在线观看www视频免费| 亚洲精品乱久久久久久| 久久99热这里只频精品6学生| 欧美日韩av久久| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 久久狼人影院| 久久久久精品人妻al黑| 亚洲黑人精品在线| 国产欧美日韩一区二区精品| 欧美精品一区二区免费开放| 香蕉国产在线看| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 成人国产av品久久久| xxxhd国产人妻xxx| 9色porny在线观看| 久久久久视频综合| 丰满迷人的少妇在线观看| a 毛片基地| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 99国产综合亚洲精品| 三级毛片av免费| 久久影院123| 水蜜桃什么品种好| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 99精品久久久久人妻精品| 淫妇啪啪啪对白视频 | 成年美女黄网站色视频大全免费| 午夜激情久久久久久久| 97精品久久久久久久久久精品| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 午夜福利在线免费观看网站| 亚洲久久久国产精品| 亚洲人成电影观看| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 欧美午夜高清在线| 日本vs欧美在线观看视频| 国产色视频综合| 99香蕉大伊视频| 亚洲精品国产一区二区精华液| √禁漫天堂资源中文www| 久久午夜综合久久蜜桃| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 精品人妻在线不人妻| 真人做人爱边吃奶动态| 交换朋友夫妻互换小说| 亚洲精品美女久久av网站| 久久av网站| 国产三级黄色录像| 午夜福利免费观看在线| 满18在线观看网站| 男女国产视频网站| 亚洲精品中文字幕在线视频| 久久精品人人爽人人爽视色| av又黄又爽大尺度在线免费看| 中文字幕精品免费在线观看视频| 在线永久观看黄色视频| a在线观看视频网站| 久久国产精品人妻蜜桃| 久久久久久久国产电影| 亚洲欧美精品自产自拍| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 国产成人精品久久二区二区免费| 精品视频人人做人人爽| 超色免费av| 久久精品人人爽人人爽视色| 日本av免费视频播放| 国产精品一区二区免费欧美 | 99精品欧美一区二区三区四区| 高清黄色对白视频在线免费看| 亚洲综合色网址| 国产1区2区3区精品| 老司机影院成人| 国产淫语在线视频| 欧美日韩视频精品一区| 精品久久久精品久久久| 国产免费av片在线观看野外av| 中亚洲国语对白在线视频| 国产精品一区二区在线不卡| 18禁观看日本| 久久女婷五月综合色啪小说| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 久久久久久免费高清国产稀缺| 欧美黑人欧美精品刺激| 日本vs欧美在线观看视频| 欧美人与性动交α欧美软件| 国产欧美日韩一区二区三 | 九色亚洲精品在线播放| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 热99re8久久精品国产| 欧美乱码精品一区二区三区| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 日韩大码丰满熟妇| 亚洲中文日韩欧美视频| 午夜福利视频在线观看免费| 久久免费观看电影| 午夜免费鲁丝| 国产精品久久久av美女十八| 亚洲av国产av综合av卡| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 午夜精品国产一区二区电影| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 法律面前人人平等表现在哪些方面 | 黄片小视频在线播放| 免费人妻精品一区二区三区视频| 91精品国产国语对白视频| 亚洲全国av大片| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 18禁国产床啪视频网站| 多毛熟女@视频| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 韩国精品一区二区三区| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 中文字幕色久视频| 欧美成人午夜精品| 亚洲中文av在线| 少妇人妻久久综合中文| 大片免费播放器 马上看| 精品亚洲成国产av| 欧美精品一区二区大全| 青青草视频在线视频观看| 黄色 视频免费看| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 亚洲av国产av综合av卡| 美女福利国产在线| 欧美97在线视频| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲成人国产一区在线观看| 国产成人av教育| 一区二区三区乱码不卡18| 国产在线观看jvid| 91国产中文字幕| 窝窝影院91人妻| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 久久午夜综合久久蜜桃| 97在线人人人人妻| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 午夜日韩欧美国产| 两个人免费观看高清视频| 大香蕉久久成人网| 一区二区三区乱码不卡18| 成年动漫av网址| 免费人妻精品一区二区三区视频| 精品久久久精品久久久| 黄片小视频在线播放| 日本一区二区免费在线视频| 欧美性长视频在线观看| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 亚洲国产精品成人久久小说| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 色婷婷av一区二区三区视频| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 黄色视频不卡| 国产激情久久老熟女| 国产精品一二三区在线看| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国产区一区二久久| 日韩中文字幕欧美一区二区| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 国产激情久久老熟女| 不卡一级毛片| 日本a在线网址| 亚洲精品国产色婷婷电影| 久久久久久久大尺度免费视频| 国产欧美日韩一区二区三 | 亚洲熟女毛片儿| 国产精品.久久久| 一本色道久久久久久精品综合| 久久久久网色| 女性生殖器流出的白浆| 多毛熟女@视频| 亚洲国产成人一精品久久久| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 天堂8中文在线网| 午夜免费成人在线视频| 大香蕉久久成人网| 老司机影院成人| 高清视频免费观看一区二区| 一级片'在线观看视频| 一边摸一边做爽爽视频免费| 国产精品av久久久久免费| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 欧美+亚洲+日韩+国产| 满18在线观看网站| 午夜福利视频精品| 久久久欧美国产精品| 日本一区二区免费在线视频| 国产日韩欧美视频二区| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 色视频在线一区二区三区| 亚洲少妇的诱惑av| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 一区二区三区乱码不卡18| 欧美午夜高清在线| 亚洲精品乱久久久久久| 18禁观看日本| 大香蕉久久成人网| 国产精品久久久久久精品电影小说| 99精品欧美一区二区三区四区| 国产成人免费观看mmmm| 美女视频免费永久观看网站| 一级,二级,三级黄色视频| 亚洲成人免费电影在线观看| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 爱豆传媒免费全集在线观看| 欧美日韩亚洲高清精品| 丝袜人妻中文字幕| 欧美人与性动交α欧美软件| 成人免费观看视频高清| 国产高清国产精品国产三级| 午夜影院在线不卡| 国产成人av教育| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 亚洲国产日韩一区二区| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 青草久久国产| 九色亚洲精品在线播放| 黄频高清免费视频| 国产成人免费无遮挡视频| 国产真人三级小视频在线观看| 午夜精品久久久久久毛片777| 国产老妇伦熟女老妇高清| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 亚洲综合色网址| 中文字幕制服av| 永久免费av网站大全| 日日爽夜夜爽网站| 亚洲国产精品999| 少妇的丰满在线观看| 一区二区三区激情视频| 人成视频在线观看免费观看| 国产亚洲精品一区二区www | 一本一本久久a久久精品综合妖精| 国产精品亚洲av一区麻豆| 性色av一级| 成年美女黄网站色视频大全免费| 国产成人精品久久二区二区免费| 1024香蕉在线观看| 午夜激情久久久久久久| 精品亚洲成国产av| 日本wwww免费看| 在线 av 中文字幕| 日韩欧美免费精品| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 久久久水蜜桃国产精品网| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 老司机午夜十八禁免费视频| 老汉色∧v一级毛片| 人成视频在线观看免费观看| 高清欧美精品videossex| 久久久久精品人妻al黑| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 日本91视频免费播放| 美女主播在线视频| 黄色 视频免费看| 久久精品成人免费网站| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产免费福利视频在线观看| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 岛国毛片在线播放| av天堂久久9| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 女警被强在线播放| 国产高清视频在线播放一区 | 午夜精品国产一区二区电影| 久久香蕉激情| 国产一级毛片在线| 成年美女黄网站色视频大全免费| 亚洲精品国产av成人精品| 岛国毛片在线播放| 中文字幕av电影在线播放| a级片在线免费高清观看视频| 婷婷丁香在线五月| 午夜影院在线不卡| av又黄又爽大尺度在线免费看| 老熟女久久久| 亚洲国产av影院在线观看| 激情视频va一区二区三区| 黄频高清免费视频| 国产在视频线精品| 免费观看人在逋| 国产成人a∨麻豆精品| 国产伦理片在线播放av一区| 久久久久精品国产欧美久久久 | 99热网站在线观看| 新久久久久国产一级毛片| 精品熟女少妇八av免费久了| 国产一级毛片在线| 一区在线观看完整版| 国产日韩欧美视频二区| 超色免费av| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 免费观看人在逋| 国产免费一区二区三区四区乱码| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 黄片小视频在线播放| 免费av中文字幕在线| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 日韩中文字幕视频在线看片| 国产又爽黄色视频| 高清av免费在线| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 不卡一级毛片| 69精品国产乱码久久久| 亚洲精品中文字幕在线视频| 久久久国产成人免费| 日韩中文字幕欧美一区二区| 视频在线观看一区二区三区| 一级黄色大片毛片| 国产成人精品无人区| 欧美人与性动交α欧美软件| 狠狠狠狠99中文字幕| 一本综合久久免费| 国产伦人伦偷精品视频| 色婷婷久久久亚洲欧美| 国产免费福利视频在线观看| 美女国产高潮福利片在线看| 亚洲国产欧美一区二区综合| av免费在线观看网站| 亚洲一码二码三码区别大吗| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 久久狼人影院| 多毛熟女@视频| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 婷婷丁香在线五月| 午夜免费观看性视频| 国产亚洲欧美精品永久| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 国产成人欧美在线观看 | 好男人电影高清在线观看| 麻豆国产av国片精品| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 美女大奶头黄色视频| 欧美日韩精品网址| 91字幕亚洲| 亚洲人成电影免费在线| 黄色视频,在线免费观看| 国产99久久九九免费精品| 国产精品二区激情视频| 91大片在线观看| 国产主播在线观看一区二区| www.熟女人妻精品国产| 欧美激情 高清一区二区三区| 欧美另类一区| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 老熟妇仑乱视频hdxx| 男人操女人黄网站| 12—13女人毛片做爰片一| 美女主播在线视频| 国产深夜福利视频在线观看| 性少妇av在线| 涩涩av久久男人的天堂| av网站在线播放免费| 美女中出高潮动态图| 高清av免费在线| 成年动漫av网址| 多毛熟女@视频| 久久毛片免费看一区二区三区| 成人影院久久| www.999成人在线观看| 精品一区二区三区av网在线观看 | 国产有黄有色有爽视频| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 黄色视频在线播放观看不卡| 日韩大码丰满熟妇| 欧美 日韩 精品 国产| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 俄罗斯特黄特色一大片| 国产成+人综合+亚洲专区| 99re6热这里在线精品视频| av网站在线播放免费| 人妻 亚洲 视频| 搡老乐熟女国产| 午夜福利,免费看| 一级毛片女人18水好多| 久久精品人人爽人人爽视色| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 12—13女人毛片做爰片一| 欧美日韩视频精品一区| 99久久人妻综合| 日本vs欧美在线观看视频| 丝袜喷水一区| 2018国产大陆天天弄谢| 久久久欧美国产精品| 制服人妻中文乱码| 欧美黑人精品巨大| 91大片在线观看| 免费少妇av软件| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 久久这里只有精品19| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 极品人妻少妇av视频| 国产日韩欧美亚洲二区| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 青春草视频在线免费观看| 一级片'在线观看视频| 日本五十路高清| 免费不卡黄色视频| 在线观看一区二区三区激情| 久久久久精品国产欧美久久久 | 亚洲综合色网址| 国产免费av片在线观看野外av| 国产高清videossex| 99re6热这里在线精品视频| 久久 成人 亚洲| 大陆偷拍与自拍| 一二三四在线观看免费中文在| 99精品欧美一区二区三区四区| 精品第一国产精品| 国产一区二区三区综合在线观看| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 亚洲国产av影院在线观看| 日本91视频免费播放| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 欧美成狂野欧美在线观看| 悠悠久久av| 精品一区二区三区四区五区乱码| 国产xxxxx性猛交| 夫妻午夜视频| 国产精品二区激情视频| 精品国产国语对白av| 欧美激情高清一区二区三区| 欧美日韩精品网址| 后天国语完整版免费观看| 男人舔女人的私密视频| 爱豆传媒免费全集在线观看| 一区福利在线观看| 天堂8中文在线网| 国产免费现黄频在线看| 老司机亚洲免费影院| 日韩人妻精品一区2区三区| 另类精品久久| 国产麻豆69| av线在线观看网站| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲精品一二三| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产亚洲一区二区精品| 三级毛片av免费| 国产在线观看jvid| 久久国产精品人妻蜜桃| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 免费日韩欧美在线观看| 欧美日韩成人在线一区二区| 欧美+亚洲+日韩+国产| 精品欧美一区二区三区在线| 久久av网站| 国产成人精品久久二区二区免费| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 婷婷色av中文字幕| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 久久亚洲精品不卡| 国产av国产精品国产| 叶爱在线成人免费视频播放| 97人妻天天添夜夜摸| 一区在线观看完整版| 精品亚洲成a人片在线观看| 国产成人啪精品午夜网站| 日本精品一区二区三区蜜桃| 咕卡用的链子| 亚洲精华国产精华精| 免费在线观看影片大全网站| 成人国语在线视频| 另类亚洲欧美激情| 国产99久久九九免费精品| 91av网站免费观看| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 天天影视国产精品| 9色porny在线观看| 国产男女超爽视频在线观看| 国产精品免费视频内射| 操出白浆在线播放| 精品一品国产午夜福利视频| 精品国内亚洲2022精品成人 | 日韩电影二区| 国产99久久九九免费精品| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 亚洲欧美激情在线| 国产麻豆69| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 一级毛片女人18水好多| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 国产一区二区三区综合在线观看| 久久免费观看电影| 免费人妻精品一区二区三区视频| 亚洲全国av大片| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 国产在视频线精品| 国产精品成人在线| 极品少妇高潮喷水抽搐| 久久久久精品国产欧美久久久 | 欧美黄色淫秽网站| 亚洲精品一二三| 午夜91福利影院| 国产精品 国内视频| 亚洲全国av大片| 国产精品免费大片| av有码第一页| 日韩 亚洲 欧美在线| 黄色片一级片一级黄色片| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 免费在线观看日本一区| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 老熟妇仑乱视频hdxx| 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产在线视频一区二区| av不卡在线播放| 国产福利在线免费观看视频| 欧美日韩亚洲高清精品| 午夜久久久在线观看| 美女高潮到喷水免费观看| 在线 av 中文字幕| 两性夫妻黄色片| 天天影视国产精品| av在线播放精品| av网站免费在线观看视频| 好男人电影高清在线观看| 一级毛片电影观看| 最近中文字幕2019免费版| 一区二区三区激情视频| 精品久久蜜臀av无| www.av在线官网国产| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 热99re8久久精品国产| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 在线av久久热| 亚洲男人天堂网一区| 国产亚洲精品一区二区www | 最新的欧美精品一区二区| 新久久久久国产一级毛片| 亚洲情色 制服丝袜| 免费观看人在逋| 老汉色∧v一级毛片| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| www.av在线官网国产| 日韩 亚洲 欧美在线| 少妇人妻久久综合中文| 1024香蕉在线观看| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | www日本在线高清视频| 国产熟女午夜一区二区三区| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 真人做人爱边吃奶动态| 日韩大码丰满熟妇| 搡老岳熟女国产| 中文字幕av电影在线播放| 一级,二级,三级黄色视频| 涩涩av久久男人的天堂| 日本av手机在线免费观看| 久久99一区二区三区| 18禁观看日本| 精品一区在线观看国产| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 亚洲精品中文字幕在线视频| 欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲人成77777在线视频| 亚洲熟女毛片儿| 国产男人的电影天堂91| 色94色欧美一区二区| 亚洲精品成人av观看孕妇| 爱豆传媒免费全集在线观看| www.av在线官网国产| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 日韩大片免费观看网站| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 色播在线永久视频| 久久性视频一级片| 日韩精品免费视频一区二区三区| 亚洲国产欧美网| 青草久久国产| 午夜福利乱码中文字幕| 久久精品国产综合久久久| 成人手机av| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 99九九在线精品视频| 欧美精品一区二区免费开放| 国产xxxxx性猛交| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 成人手机av| 日韩欧美一区视频在线观看| 国精品久久久久久国模美| a在线观看视频网站| 精品国产一区二区三区四区第35| 在线观看免费高清a一片| 丝袜人妻中文字幕| 美女午夜性视频免费|