湖北地區(qū)豬鏈球菌2型的鑒定及生物學特性研究

譚仕旦+劉國平

摘要：以湖北荊州地區(qū)疑似豬鏈球菌病的病豬為研究對象，經(jīng)病料采集、細菌分離培養(yǎng)、純化、染色、鏡檢、生化鑒定、血清學試驗和PCR檢測，確定該病豬為豬鏈球菌2型病例。經(jīng)藥敏試驗篩選出了環(huán)丙沙星、阿莫西林和頭孢唑肟鈉為其敏感藥物；經(jīng)動物攻毒試驗復制出同樣疾病，表明豬鏈球菌2型對湖北地區(qū)豬具有很強的致病性。

關鍵詞：豬鏈球菌；鑒定；生物學特性

中圖分類號：S828 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）14-2722-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.14.031

Abstract： In this study， the suspected swine of Streptococcus suis disease in a certain pig farm in Jingzhou， Hubei Province was used as the research object. The results were as follows： disease collection， bacterial culture， purification， dyeing， microscopic examination， biochemical identification， serological test and PCR. The swine were determined as Streptococcus suis type 2 cases. Ciprofloxacin， amoxcillin and ceftizoxime sodium were screened by drug sensitivity test，and the same disease was reproduced by animal challenge test， indicating that Streptococcus suis type 2 had a strong pathogenicity to pigs in Hubei area. This experiment is very important for the prevention and control of Streptococcus suis disease in Hubei pig industry.

Key words： Streptococcus suis； identification； biological characteristic

豬鏈球菌病是由豬鏈球菌引起的一種人畜共患傳染病，可感染人致死。而豬鏈球菌2型是豬鏈球菌中致病性最強的一種，其毒力可能與溶菌酶釋放蛋白（MRP）、細胞外蛋白因子（EF）和溶血素（SLY）等毒力因子有關。該病多在4～12周齡豬群中暴發(fā)，無明顯的季節(jié)性，全年均有發(fā)生，發(fā)病率和死亡率都很高[1]。病豬表現(xiàn)為腦膜炎、關節(jié)炎、肺炎、心內(nèi)膜炎、漿膜炎等，并可導致母豬流產(chǎn)和局部膿腫。目前，已發(fā)現(xiàn)豬鏈球菌共有35個血清型，毒力最強的依次為2型、1型、9型和7型，目前感染人的主要是2型。

豬鏈球菌2型與豬的臨床疾病有一定的相關性，不是所有的2型菌株均能致病，也并非引起同一種疾病。各齡的豬均能感染豬鏈球菌，但大多在3～12周齡的仔豬先發(fā)流行，尤其在斷奶及混群時出現(xiàn)發(fā)病高峰[2]。口、鼻腔是主要的入侵組織，然后在扁桃體定居繁殖。在關節(jié)炎的病例中，最早見到的變化是滑膜血管的擴張和充血，關節(jié)表面可能出現(xiàn)纖維蛋白性多發(fā)漿膜炎，受影響的關節(jié)囊壁可能增厚，滑膜形成紅斑，滑液量增加，并含有炎性細胞。豬鏈球菌2型引起病豬患支氣管肺炎、腦膜炎、心內(nèi)膜炎、關節(jié)炎、動脈炎、膿腫。MRP和EF被認為是豬鏈球菌的兩種重要毒力因子，從病豬體內(nèi)分離的菌株含兩種分子，而從大多健康豬體內(nèi)分離的菌株沒有這兩種大分子。根據(jù)MRP及其相關蛋白存在與否，豬鏈球菌2型存在以下幾種表現(xiàn)型：MRP+EF+、MRP-EF-、MRP+EF*（EF類似物）、MRP+EF-、MRP+EF-、MRP-EF+、MRP-EF+等[3，4]。

診斷豬鏈球菌感染是根據(jù)臨床癥狀和病理變化，證實感染需通過病原分離和組織檢查才能確定。目前，檢測方法主要有分離培養(yǎng)及生化鑒定、血清學鑒定、分子水平鑒定、隨機擴增多態(tài)性DNA分析（RAPD）方法[5]。根據(jù)細菌形態(tài)可初步鑒定豬鏈球菌，但要確定其血清型比較困難，可用分型診斷血清進行乳膠或玻片凝集試驗PCR檢測[6，7]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 標準血清 豬鏈球菌2型標準血清，由長江大學動物科學學院實驗室制備。

1.1.2 試驗試劑 生化發(fā)酵管、藥敏試紙：購自杭州天和微生物試劑有限公司；染色液：長江大學動物科學學院實驗室配制；TSA、TSB：購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.3 試驗動物 試驗病豬：來源于湖北枝江某豬場。復制試驗昆明鼠：購自長江大學醫(yī)學院實驗動物中心，體重20～25 g。復制試驗仔豬：湖北恩施某豬場，50日齡豬健康仔豬，豬鏈球菌2型抗體檢測為陰性。

1.2 試驗方法

1.2.1 細菌分離、純化 用小負壓穿刺術采集疑似豬鏈球菌病豬的關節(jié)液，接種TSA培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h；挑取平板培養(yǎng)基上生長的單個可疑菌落進行革蘭氏染色鏡檢，選擇鏡檢為G+雙球菌或短鏈狀球菌的菌落再次培養(yǎng)以純化。挑選純化培養(yǎng)的單個可疑菌落先作標記，然后挑取少許菌落按常規(guī)革蘭氏染色法進行染色，油鏡下觀察染色結果。

1.2.2 形態(tài)觀察 將純化培養(yǎng)的細菌接種于綿羊血瓊脂平板和TSA培養(yǎng)基，恒溫37 ℃培養(yǎng)18～24 h，進行細菌涂片、革蘭氏染色、鏡檢，觀察其在綿羊血瓊脂平板和液體培養(yǎng)基中的生長特性和細菌形態(tài)。

1.2.3 生化鑒定 取純化培養(yǎng)后的典型菌落分別接種葡萄糖、乳糖、棉子糖、山梨醇、蔗糖、蕈糖、6.5%NaCl、水楊苷、馬尿酸鹽、七葉苷、V-P等，37 ℃培養(yǎng)24 h，并記錄試驗結果。

1.2.4 血清定型 病原菌抗原的制備：取純化后的凍干菌種，接種于TSA培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12 h，純度檢驗合格后，作為一級菌種，2～8 ℃保存，不超過7 d。挑取一級菌種中的單菌落，接種于TSA培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12 h，用PBS溶液（pH 7.4）收獲菌液。按菌液總量的0.8%加入甲醛溶液，37 ℃滅活24 h，每隔4 h搖動1次。該菌液作為被檢抗原。

血清凝集試驗：在潔凈的玻片上滴上制備好的被檢抗原1～2滴，然后分別滴加A～G的2型標準血清1～2滴，充分混勻，涂成大小為1.5 cm的圓圈，輕輕搖動玻片，2 min內(nèi)觀察結果有無凝集，有明顯凝集物呈“++”以上者判為陽性。

1.2.5 毒力因子的檢測 根據(jù)GenBank發(fā)表的序列，分別設計了豬鏈球菌2型3個毒力因子溶菌酶釋放蛋白MRP、細胞外蛋白因子EF和溶血素的特異性引物見表1，進行主要毒力檢測。

1.2.6 耐藥性檢測 挑取TSA培養(yǎng)基上生長的純培養(yǎng)菌落和標準質(zhì)控菌株，接種于2 mL營養(yǎng)肉湯，培養(yǎng)16～18 h（濃度達到1.5×108 CFU/mL），觀察細菌生長情況。用無菌鑷子夾取藥敏試驗試紙貼于TSA培養(yǎng)基上。37 ℃培養(yǎng)24 h，用最小刻度為mm的直尺測量各抗菌藥物對每株細菌抑菌圈的大小，計算平均直徑，根據(jù)表2判斷結果。

1.2.7 動物試驗 菌液制備：將純種菌株接種于普通營養(yǎng)肉湯里，37 ℃培養(yǎng)18 h，菌液先用比濁法粗略記數(shù)，然后倍比稀釋，以平板表面涂布法記數(shù) （CFU/mL），然后將菌液稀釋至1.8×109 CFU/mL，在4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

菌液感染小白鼠試驗：健康的小鼠腹腔注射菌液，每組注射4只，0.5 mL/只，對照組4只小鼠腹腔注射滅菌普通肉湯，0.5 mL/只，對注射后的小鼠隔離飼養(yǎng)，觀察其發(fā)病及死亡情況，對死亡的小鼠立即解剖，觀察病理變化。同時對主要組織器官及血液進行病菌分離。

菌液感染仔豬試驗：健康仔豬靜脈注射菌液，5 mL/只，對注射后的豬隔離飼養(yǎng)，觀察體溫及其他臨床表現(xiàn)。對死亡的仔豬立即進行解剖，觀察病理變化，并對主要組織器官及血液進行分離病菌。

2 結果與分析

2.1 病菌的形態(tài)及培養(yǎng)特性

試驗分離的菌株為革蘭氏陽性球菌。固體培養(yǎng)物以雙球菌為主，少數(shù)為3～5個排列的短鏈，綿羊血瓊脂平板培養(yǎng)物可見α溶血。在TSA培養(yǎng)基上分離菌株的菌落均為圓形微凸，表面光滑，濕潤，邊緣整齊，半透明樣。

2.2 生化試驗結果

試驗分離到的菌株接種于葡萄糖、乳糖、棉子糖、山梨醇、蔗糖、蕈糖、6.5%NaCl、水楊苷、馬尿酸鹽、七葉苷、V-P等觀察其生化特性。分離菌株的生化試驗結果見表3。

2.3 血清學試驗結果

試驗分離培養(yǎng)的菌株與豬鏈球菌2型標準血清發(fā)生凝集反應。

2.4 毒力因子PCR檢測結果

病菌毒力因子PCR檢測結果表明毒力因子為EF基因，PCR結果如圖1所示。

2.5 耐藥性檢測

試驗分離菌株耐藥性檢測結果是環(huán)丙沙星、阿莫西林、頭孢唑肟鈉對其敏感，而慶大霉素、鏈霉素、紅霉素、壯觀霉素和林可霉素對其表現(xiàn)出耐藥。其結果見表4。

2.6 動物復制試驗

小鼠腹腔注射后4 h后開始出現(xiàn)死亡，眼瞼、面部水腫，伴隨有共濟失調(diào)、麻痹或驚厥等神經(jīng)癥狀。死亡后剖檢肺有出血點，肝脾腫大，腸系膜和胃壁有出血現(xiàn)象，對照組小鼠未見異常。

仔豬病初表現(xiàn)為精神降低，體溫升高、厭食，隨后表現(xiàn)為共濟失調(diào)、震顫發(fā)抖、角弓反張、呼吸困難、走路出現(xiàn)搖晃，3 d后有1只病豬死亡，解剖可見全身臟器出現(xiàn)充血或出血現(xiàn)象。具體試驗結果如表5所示。

3 小結與討論

通過細菌分離、培養(yǎng)、生化鑒定、血清學試驗、PCR檢測等試驗方法進行研究的結果鑒定了病豬病原為豬鏈球菌2型。同時，通過藥物敏感性試驗篩選出環(huán)丙沙星、阿莫西林和頭孢唑肟鈉為其敏感藥物；通過攻毒試驗證明了豬鏈球菌2型對小白鼠和健康仔豬有很強的致病性。

病料采集為病豬的關節(jié)液，雜菌少，易于分離，比常規(guī)從肺臟和扁桃體等部位采集病料分離病菌要好得多，且結果準確些。耐藥性檢測可以看出，該病菌對頭孢唑肟鈉、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、阿莫西林敏感性高，這些藥物臨床應用要晚于耐藥性強的藥物，如對青霉素、鏈霉素、慶大霉素和壯觀霉素。這一點也證明了臨床上不宜長期、大劑量的使用抗生素，造成病菌耐藥而影響人類健康。

參考文獻：

[1] 崔 立.豬鏈球菌2型四川株與江蘇株對SPF豬的致病性[J].上海交通大學學報，2006（1）：45-69.

[2] 倪宏波.長春地區(qū)豬鏈球菌的分離與鑒定[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學學報，2002（1）：264-268.

[3] 李 春，張 東，李金海，等.四川省豬鏈球菌的分離與鑒定[J].四川畜牧獸醫(yī)，2005（9）：25-26.

[4] 何孔旺，倪艷秀，王繼春，等.豬鏈球菌2型的分子流行病學研究田[J].中國人獸共患病雜志，2002，18（5）：45-47.

[5] 張秀亮，沈琴芳，鄭新添，等.豬鏈球菌的鑒定及其PCR分型方法的建立[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2005（9）：86-87.

[6] 倪艷秀，何孔旺，王繼春，等.豬鏈球菌2型的PCR快速檢測[J].中國獸醫(yī)學報，2002，22（5）：474-477.

[7] 胡曉抒，朱風才，汪 華，等.人-豬鏈球菌感染性綜合癥研究[J].中華預防醫(yī)學志，2000，24（3）：150-152.