乳酸菌發(fā)酵羊乳制備抗氧化肽的研究

楊麗娜，葛武鵬，萬金敏，王智，袁亞娟，耿煒，李小鵬，吳小勇

（1.西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院，陜西楊凌712100；2.陜西百躍優(yōu)利士乳業(yè)有限公司，陜西咸陽712000；3.咸陽質(zhì)量技術(shù)檢測檢驗所，陜西咸陽712000；4.咸陽市食品藥品檢測檢驗中心，陜西咸陽712000）

乳酸菌發(fā)酵羊乳制備抗氧化肽的研究

楊麗娜1，葛武鵬1，萬金敏1，王智2，袁亞娟3，耿煒3，李小鵬4，吳小勇4

（1.西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院，陜西楊凌712100；2.陜西百躍優(yōu)利士乳業(yè)有限公司，陜西咸陽712000；3.咸陽質(zhì)量技術(shù)檢測檢驗所，陜西咸陽712000；4.咸陽市食品藥品檢測檢驗中心，陜西咸陽712000）

為研究羊乳發(fā)酵后乳清提取物的抗氧化能力，采用乳酸菌對其進行發(fā)酵。從發(fā)酵菌株的篩選到發(fā)酵條件的優(yōu)化以及發(fā)酵產(chǎn)物的初步分離做了研究。以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）及羥基自由基（·OH）清除率為指標，通過乳酸菌的篩選與復配，優(yōu)化發(fā)酵工藝條件，并利用膜技術(shù)分離其抗氧化組分。結(jié)果表明：①確定了最佳發(fā)酵條件，在此條件下發(fā)酵羊乳乳清提取物對DPPH、·OH清除率分別為70.30%和88.42%，較未發(fā)酵前分別提高了64.63%和27.20%。②比較羊乳發(fā)酵前后提取物的不同分子量組分的抗氧化活性，結(jié)果表明，分子量小于6 ku組分其抗氧化活性高且羊乳發(fā)酵后抗氧化活性明顯提高。

羊乳；乳清；乳酸菌；抗氧化肽；抗氧化活性

0 引言

活性氧(ROS)和自由基是具有一個或多個未成對電子的高活性的分子，可以直接攻擊DNA、RNA、蛋白質(zhì)和其他生物大分子[1]。證據(jù)表明，含有抗氧化活性的食物可以清除ROS和自由基，幫助預防一些疾病[2]。乳酸菌細胞內(nèi)有一套較完整的降解蛋白質(zhì)的酶體系，并為益生菌[3]。Kullisaar等[2]研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵能提高山羊乳抗氧化活性；Nandhini等[4]發(fā)現(xiàn)，乳酸菌發(fā)酵的山羊乳有較強的自由基清除和抑制脂質(zhì)過氧化能力。目前，國內(nèi)外一般采用酶解法從牛乳或乳蛋白中制備抗氧化肽，發(fā)酵羊乳中的抗氧化肽的研究國內(nèi)鮮見報道。本研究主要探討優(yōu)選乳酸菌與傳統(tǒng)發(fā)酵劑嗜熱乳酸菌優(yōu)化復配發(fā)酵羊乳乳清提取物的抗氧化活性。以新鮮脫脂羊乳為基料，優(yōu)選復配乳酸菌菌株，優(yōu)化發(fā)酵條件，發(fā)酵后分析評價其乳清提取物的抗氧化活性，為乳酸菌發(fā)酵羊乳制備抗氧化多肽提供參考。

1 實驗

1.1 材料與試劑

鮮山羊乳：采自西北農(nóng)林科技大學畜牧養(yǎng)殖廠。

乳酸菌株：本實驗室優(yōu)選并經(jīng)過安全性評價的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，LP）LPGY-L086和LPGY-L089，以及類干酪乳桿菌類干酪亞種(Lb.paracasei ssp.paraca?sei,LC)LCGY-L003和LCGY-L004；嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus,ST)。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（分析純）；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

DRP-9162生化培養(yǎng)箱；SW-CJ-2D雙人單面超凈臺；HC-3018R高速低溫冷凍離心機；紫外可見分光光度計。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵劑的制備

將乳酸菌菌株活化，在滅菌脫脂乳培養(yǎng)基（115℃，20 min）連續(xù)傳代3次后，接入37～42℃靜止培養(yǎng)6 h。

1.3.2 實驗方案

首先通過水解度和抗氧化活性篩選出優(yōu)良的乳酸菌;接著分別就接菌量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間和菌株復配比等進行單因素試驗確定其相應水平值。并在單因素基礎上進行正交實驗L9(43)，確定最佳發(fā)酵工藝條件。對最優(yōu)條件的發(fā)酵產(chǎn)物進行超濾處理，對分離的不同分子量的組分進行抗氧化活性比較。

1.3.3 pH值的測定

參照GB/T 12456-2008。

1.3.4 發(fā)酵羊乳中乳清提取物的制備

為了找出發(fā)酵對抗氧化活性的影響，把發(fā)酵好的羊乳樣品，調(diào)節(jié)pH值到等電點，離心(5 000 g，20 min）除去其中未水解酪蛋白，上清液過0.45 μm的濾膜，得到的濾液氮氣處理后儲存在-20℃?zhèn)溆谩Ｎ窗l(fā)酵羊乳做同上處理做為對照。

1.3.5 蛋白水解度（DH）的測定

用凱氏定氮法測定脫脂羊乳中蛋白的含量；用OPA法測定樣品的水解度[5]：取2 mL發(fā)酵樣品加入1 mL的蒸餾水后使其徹底混合，然后與5 mL質(zhì)量濃度為120 g/L的三氯乙酸(TCA)混合在一起，靜止反應10 min，混合物在3 000 g離心10 min，得上層清液備用。用質(zhì)量濃度為0.1 g/L的絲氨酸（Serine）做標準溶液。分別取400 μL的預處理好的樣品、標準溶液和去離子水與3 mL的OPA試劑混勻，精確反應2 min后在340 nm出測其吸光值（OD）。

1.3.6 抗氧化活性的測定

（1）DPPH清除能力測定。參考shabboo[6]的方法，準確吸取1 mL，0.1 mmol/L DPPH無水乙醇溶液與適量濃度的樣品充分混合，在室溫下避光反應30 min，于517 nm處測定樣品的吸光度。

（2）·OH的清除能力[7]。取少量的待測樣品加入1.8 mL的蒸餾水中混勻，分別加入2 mL，6 mmol/L FeSO4，2 mL濃度為6 mmol/L的H2O2混合后靜置10 min，然后加入2 mL濃度為6 mmol/L水楊酸混勻，避光反應30 min。在510 nm處測吸光值，記錄為Am。用雙蒸水代替水楊酸再次測其吸光值，記錄為An，空白對照組以雙蒸水代替樣品，測其吸光值，記錄為Ap。羥基自由基的清除率為

式中：Ap為對照組吸光值；Am為樣品組吸光值；An為空白組吸光值。

（3）螯合Fe2+的能力。測定螯合Fe2+的能力參考Li Yun等[8]的方法，取適量的樣品用去離子水稀釋至3.7 mL，加入0.1 mL濃度為2 mmol/L的FeCl2，反應3 min后加入0.2 mL濃度為5 mmol/L的菲洛嗪抑制此反應。混勻此混合溶液后在室溫下放置10 min，在562 nm在測其吸光值?？瞻讓φ帐怯萌ルx子水替代樣品。

螯合能力計算公式為

式中：As為樣品的吸光值；Ac為空白對照的吸光值。

（4）還原能力測定。采用鐵氰化鉀法測定[9]。取1 mL樣品溶液于試管中，然后加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH6.6)2.5 mL和1%的鐵氰化鉀溶液2.5mL?；旌衔镌?0℃水浴中反應20 min，迅速冷卻并加入10%TCA 2.5 mL，混勻后以3 000 rpm離心10 min，離心后取2.5 mL上清液加入0.1%FeCl3溶液0.5 mL并混勻，再加2.5 mL蒸餾水并混合均勻，以蒸餾水為空白對照管，在700 nm處測定吸光度。樣品的吸光值越高，說明樣品的還原能力越強。

1.4 羊乳發(fā)酵前后抗氧化組分的初步分離

將羊乳、發(fā)酵羊乳制備的乳清提取物，用標準分子量6 ku的超濾膜進行超濾處理，得到大于和小于6 ku兩個組分，冷凍干燥后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 統(tǒng)計分析

結(jié)果以均值±標準差（x±SD）表示。采用Minit?ab16.2.3進行統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析，采用Origin8.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選

2.1.1 單菌培養(yǎng)對羊乳發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化活性影響

將LPGY-L086，LPGY-L089，LCGY-L003和LCGY-L004分別接入已滅菌的脫脂羊乳中，接種量5%，37℃培養(yǎng)，在發(fā)酵0，4，8，12，20，24，28，32，36，48 h取樣15 mL；4℃環(huán)境下放置24 h后，測其pH值、水解度和抗氧化活性；抗氧化活性以DPPH和·OH自由基清除率為指標。同時以未發(fā)酵脫脂羊乳做空白對照，結(jié)果如圖1所示。

圖1 測定用乳酸菌發(fā)酵脫脂羊乳過程中pH值，DH，DPPH及·OH清除的變化

由圖1可以看出，由于乳酸菌前期快速增長，產(chǎn)酸能力強，pH值先迅速下將到4.5后趨于平穩(wěn)。DH隨發(fā)酵時間的增加，呈現(xiàn)上升趨勢，這是因為在發(fā)酵過程中，羊乳蛋白被乳酸菌產(chǎn)生的胞外蛋白酶水解，從而形成多肽片段。同時乳清提取物的DPPH和·OH清除率基本呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，在24 h左右達到最大值，且DPPH清除率與·OH清除率之間存在相關(guān)性，LPGY-L086（r=0.962），LPGY-L089（r=0.863）高度相關(guān)；LCGY-L003（r=0.650），LCGY-L004（r=0.638）中度相關(guān)。隨著時間延長自由基清除率有所下降的原因是一部分具有抗氧化活性的肽被蛋白酶水解。LPGY-L086和LPGY-L089比其他兩株菌具有較高的DH及自由基清除能力。LCGY-L003發(fā)酵后的羊乳DH和自由基清除率與其他乳酸菌相比處于中間。LCGY-L004發(fā)酵的羊乳的DH及自由基清除率都低。因此，單一菌株發(fā)酵時2株LP為最好。

2.1.2 菌株復配培養(yǎng)對羊乳發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化活性影響

有研究表明，乳酸桿菌和嗜熱鏈球菌之間存在共生作用，混合培養(yǎng)將促進兩者更好地生長，在蛋白質(zhì)水解過程中存在良好的協(xié)同作用[10]。將2株LP分別與傳統(tǒng)發(fā)酵劑ST以1∶1接入已滅菌的脫脂的羊乳中，接種量5%，37℃培養(yǎng)24 h后，測其pH值、水解度和抗氧化活性，同時與羊乳對照，如表1所示。

表1 菌株復配培養(yǎng)后產(chǎn)物pH值、DH、DPPH和·OH清除率比較

由表1可以看出，與未發(fā)酵羊乳相比，發(fā)酵后的羊乳乳清提取物的DH、DPPH及·OH清除率都有一定程度的提高；菌株復配培養(yǎng)后的DH、DPPH及·OH清除率明顯提高。與單菌培養(yǎng)相比，混合培養(yǎng)后自由基清除率的效果并非都好，比如：LPGY-L089與ST混合后DPPH清除率有所提高，但·OH清除率變化不大。造成這種現(xiàn)象可能的因為菌株的相互作用使發(fā)酵產(chǎn)物里抗氧化組分種類及含量不同引起的。綜合比較以LPGY-L086與ST進行混合發(fā)酵為優(yōu)，可以作為發(fā)酵羊乳的菌種。

2.2 從羊乳中制備抗氧化肽發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1 接菌量對發(fā)酵產(chǎn)物自由基清除率的影響

圖2 接菌量對自由基清除率的影響

本研究固定菌種比為1∶1，發(fā)酵溫度為37℃，發(fā)酵時間24 h，研究隨著接種量的不斷提高發(fā)酵乳清提取物對DPPH及·OH清除率的變化。如圖2所示，當接種量在4%時產(chǎn)物對DPPH及·OH自由基清除率較高，此后隨著接種量的增加自由基清除率增加緩慢，從自由基清除率及發(fā)酵成本考慮選定4%的接菌量。

2.2.2 發(fā)酵溫度對發(fā)酵產(chǎn)物自由基清除率的影響

固定接種量4%，發(fā)酵時間24 h，菌種比1∶1，研究產(chǎn)物對DPPH及·OH清除率隨溫度的變化情況，結(jié)果如圖3所示。

圖3 發(fā)酵溫度對自由基清除率的影響

由圖3可以看出，隨著發(fā)酵溫度的增加，發(fā)酵乳清提取物的DPPH及·OH清除率先增大后減小，在37℃達到最大。這是因為培養(yǎng)溫度影響乳酸菌的生長和混合生長菌株的比例，從而影響著代謝產(chǎn)物的形成[9]。

2.2.3 發(fā)酵時間對發(fā)酵產(chǎn)物自由基清除率的影響

由圖4可以看出，發(fā)酵時間為20 h和24 h時，產(chǎn)物對DPPH及·OH清除率呈上升趨勢，當超過24 h，產(chǎn)物對DPPH及·OH清除率呈下降趨勢，因此選擇發(fā)酵時間為24 h。

2.2.4 菌株復配比對發(fā)酵產(chǎn)物自由基清除率的影響

固定接種量4%，發(fā)酵溫度37℃，發(fā)酵時間24 h，研究產(chǎn)物對DPPH及·OH清除率隨菌株復配比的變化情況，由圖5所示，當菌株復配比(LPGY-L086∶ST)為1∶1時DPPH及·OH清除率達到最大值，分別為56.71%和78.52%。

2.2.5 正交實驗

在篩選乳酸菌菌種基礎上，選取接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間和菌株復配比(LPGY-L086∶ST)4個因素，通過L9(43)正交表進行優(yōu)化實驗，以期得到最佳的發(fā)酵培養(yǎng)條件。實驗設計及正交實驗結(jié)果如表2所示。

圖4 發(fā)酵時間對自由基清除率的影響

圖5 菌株復配比對自由基清除率的影響

由表2中極差分析的結(jié)果顯示，發(fā)酵接菌量是影響發(fā)酵產(chǎn)物自由基清除率的主要因素，菌株復配比對其產(chǎn)生的影響相對最小。各因素的影響程度從大到小依次為A＞C＞B＞D。所以，對于發(fā)酵羊乳清提取物清除DPPH及·OH而言，最優(yōu)的發(fā)酵水平組合為A1B3C2D1，即接種量為3%，發(fā)酵溫度為42℃，發(fā)酵時間為24 h，菌株復配比(LPGY-L086∶ST)為2∶1。該條件下的發(fā)酵乳清提取物產(chǎn)物對DPPH和·OH清除率分別為70.30%和88.42%。發(fā)酵乳清提取物對DPPH和·OH清除率分別為70.30%和88.42%，較羊乳乳清提取物分別提高了64.63%和27.20%。

表2 L9（43）正交實驗方案與結(jié)果

表3 膜分離后各組分的抗氧化活性

2.3 超濾分離后各組分的抗氧化活性

用標準分子量為6 ku的超濾膜將羊乳乳清提取物進行超濾處理，依次按分子量大小分離為2個組分：組分FA（分子量＜6 ku）、組分FB（分子量＞6 ku）。收集分離的組分進行冷凍干燥，再配制成一定濃度，測其抗氧化活性。同時與同等濃度的VC作對照，如表3所示。

由表3可以看出，在同等濃度時，VC對DPPH及·OH清除率和還原能力最大，螯合Fe2+能力均小于羊乳和發(fā)酵羊乳乳清提取物分離組分FA；羊乳和發(fā)酵羊乳乳清提取物的組分FA對DPPH及·OH清除率、螯合Fe2+能力及還原能力均顯著大于組分FB，且發(fā)酵羊乳乳清提取物的組分FA的抗氧化活性大于羊乳乳清提取物的組分FA。因此羊乳中抗氧化組分主要集中在分子質(zhì)量6 ku以下，這同前人的研究結(jié)果一致[11-13]。

3 結(jié)論

（1)從4株乳酸菌中優(yōu)選出2株植物乳桿菌，分別于傳統(tǒng)發(fā)酵劑ST復配后，LPGY-L086與ST的發(fā)酵產(chǎn)物與單菌培養(yǎng)相比，DPPH及·OH清除率明顯提高。本研究選取LPGY-L086和ST作為羊乳發(fā)酵培養(yǎng)的菌株。

（2)從羊乳中制備抗氧肽的最佳發(fā)酵工藝條件：菌株復配比（LPGY-L086∶ST）為2∶1，接種量為3%，發(fā)酵溫度為42℃，發(fā)酵時間為24 h。發(fā)酵產(chǎn)物的DPPH清除率為70.30%，·OH清除率為88.42%，較羊乳分別提高了64.63%和27.20%。

（3)對羊乳和發(fā)酵羊乳乳清提取物進行超濾分離，比較分離出的不同分子量組分的抗氧化活性表明：羊乳和發(fā)酵羊乳乳清提取物中分子量小于6 ku組分其抗氧化活性高；且發(fā)酵后乳清提取物中分子量小于6 ku的抗氧化活性明顯高于發(fā)酵前，即發(fā)酵羊乳乳清提取物中抗氧化組分分子質(zhì)量在6 ku以下。

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Study on antioxidant activity of peptides in fermented goat milk with Lactic acid bacteria

YANG Lina1，GE Wupeng1，WAN Jinmin1，WANG Zhi2，YUAN Yajuan3，GENG Wei3，
LI Xiaopeng4，WU Xiaoyong4
(1.College of Food Science and Engineering,Northwest A&F University,Yangling 712100,China;2.Shanxi Baiyue You lishi Dairy Co.,LTD,Xian 710000,China;3.Institution of Inspection of Xianyang Bureau of Quality and Supervi?sion,Xianyang 712000,China;4.Xianyang Food and Drug Inspection Center,Xianyang 712000,China)

The fermented products of the goat milk was prepared by Lactic acid bacteria for studying on the antioxidant capability.This article mainly from the fermentation strain screening to the optimization of fermentation conditions and fermentation product preliminary separation to do the research.The scavenging rate of 1,1-dipheny l-2-trinitrobenzene hydrazine(DPPH)and hydroxyl radicals(·OH)was used to evaluate the antioxidant capacity.By Lactic acid bacteria screening and distribution,optimization of fermentation conditions,and the antioxi?dant components were separated by membrane separation technology.The results showing that:①Under the optimum condition of the goat milk whey fermentation extracts on DPPH,·OH clearance respectively 70.30%and 88.42%,increased by 64.63%and 27.20%respectively than before fermentation.②It showing that,by comparing the antioxidant activities of component with different molecular weights isolated from extract from whey of before and after fermented,it is the component with less than 6 ku molecular weight that has higher antioxidant activity and goat milk antioxidant activity increased significantly after fermented,that is,the molecular weight of antioxidant peptide in goat milk fermented is less than 6 ku.

goat milk;whey;Lactic acid bacteria;antioxidant peptides;antioxidant activity

Q939.11+7

：A

：1001-2230（2017）07-0004-05

2016-11-30

陜西省科技廳戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)重大產(chǎn)品（群）項目(2015KTC Q03-08)及(2016KTZDNY02-04)。

楊麗娜(1992-)，女，碩士研究生，研究方向為食品科學。

葛武鵬