ERK5在急性心肌梗死患者中的磷酸化水平及對(duì)體外血小板激活的影響

高 穩(wěn) 李 劍 倪喚春 謝 坤 羅心平

(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院心內(nèi)科 上海 200040)

ERK5在急性心肌梗死患者中的磷酸化水平及對(duì)體外血小板激活的影響

高 穩(wěn) 李 劍 倪喚春 謝 坤 羅心平△

(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院心內(nèi)科 上海 200040)

目的 觀察急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)患者血小板中細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶5 (extracellular signal-regulated kinase 5,ERK5)的活化水平及其特異性抑制劑XMD8-92對(duì)血小板功能的影響,探索ERK5調(diào)節(jié)血小板活性的分子機(jī)制。方法 運(yùn)用Western bolt法檢測(cè)AMI患者(n=34)和穩(wěn)定性心絞痛患者(n=33)血小板ERK5、Akt473及Akt308的磷酸化水平;通過檢測(cè)體外血小板的聚集,測(cè)定不同濃度XMD8-92對(duì)膠原(collagen)刺激引起的血小板聚集的影響;利用熒光素酶同期檢測(cè)XMD8-92對(duì)血小板致密顆粒分泌的影響;通過檢測(cè)血小板在纖維蛋白原上的鋪展、在血漿中的收縮,評(píng)價(jià)血小板整合素ɑIIbβ3的活化水平;運(yùn)用Western bolt法檢測(cè)聚集反應(yīng)中XMD8-92對(duì)Akt473、Akt308及PTEN370磷酸化的影響。結(jié)果 AMI患者組ERK5及Akt473、Akt308磷酸化水平顯著升高(P<0.05);ERK5抑制劑XMD8-92可抑制膠原誘導(dǎo)的血小板聚集、分泌、栓塊收縮及在纖維蛋白原上的鋪展等活化指標(biāo);XMD8-92處理后血小板Akt473、Akt308及PTEN370磷酸化水平減低。結(jié)論 ERK5的激活參與了AMI過程中血小板的活化;ERK5可通過調(diào)節(jié)PTEN的活性,從而調(diào)節(jié)Akt的磷酸化水平,進(jìn)而調(diào)控血小板的功能。其特異性抑制劑有望成為新的抗栓藥物。

ERK5; 血小板; 血栓; 急性心肌梗死

目前,動(dòng)脈血栓性疾病成為威脅我國人民健康的首位殺手,其死亡率已超過腫瘤。其中冠心病是主要的病種,而冠心病的致死事件多為急性心肌梗死所致。已明確動(dòng)脈血栓形成的關(guān)鍵步驟為：血管壁受損、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂暴露血管內(nèi)皮下基質(zhì),血小板立即通過其表面黏附受體 GPIb-IX-V和GPVI 黏附于內(nèi)皮下膠原(collagen)組織。膠原刺激導(dǎo)致血小板發(fā)生一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件,引起血小板產(chǎn)生血栓烷A2以及釋放細(xì)胞內(nèi)顆粒內(nèi)容物(如二磷酸腺苷 ADP等),最終導(dǎo)致血小板整合素 αIIbβ3激活,激活的整合素 αIIbβ3向內(nèi)傳遞信號(hào),加強(qiáng)血小板活化、聚集、釋放顆粒,啟動(dòng)凝血過程[1]。由此可見,血小板活化是動(dòng)脈血栓形成過程中重要的始動(dòng)環(huán)節(jié)。深入研究血小板活化新調(diào)控方式進(jìn)而發(fā)現(xiàn)新作用機(jī)制的藥物是目前醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的一個(gè)重點(diǎn)。

絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)信號(hào)通路是真核細(xì)胞中廣泛存在并發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用的信號(hào)通路,其中細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2 (extracellular signal-regulated kinases,ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal kinases,JNK)和p38絲裂原活化的蛋白激酶(p38MAPK)在血小板中的作用均有較深入的研究[2-3]。最新研究發(fā)現(xiàn)血小板中也存在細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶5 (extracellular signal-regulated kinase 5,ERK5)的穩(wěn)定表達(dá)[4],但其在急性血栓事件中的作用及調(diào)節(jié)機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)擬采用ERK5特異性抑制劑研究ERK5在血小板中的作用,并探討其分子機(jī)制,從而為ERK5作為新型抗栓藥物靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

藥品與試劑

研究對(duì)象 選擇2015年1月至2016年6月于復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院急診就診的患者,參考指南標(biāo)準(zhǔn)[5]納入急性ST段抬高心肌梗死患者。根據(jù)人群特征,從心內(nèi)科病房中入選穩(wěn)定性心絞痛患者[6]作為對(duì)照。遵循赫爾辛基宣言,在得到華山醫(yī)院倫理委員會(huì)授權(quán)后(倫理號(hào)2015-050),對(duì)所有入選患者進(jìn)行告知,并簽署知情同意書。進(jìn)行臨床資料的收集,行肘部靜脈取血6 mL。體外實(shí)驗(yàn)用血小板來自復(fù)旦大學(xué)健康志愿者,入選前簽署知情同意書。

所用試劑 膠原、熒光素酶(luciferase),購自美國CHRONO-LOG公司;ADP/ATP雙磷酸酶(apyrase)、前列腺素E1(PGE1)、纖維蛋白原(fibrinogen),購自美國Sigma公司;磷酸化Akt473抗體、磷酸化Akt308抗體、磷酸化ERK5抗體和GAPDH抗體,購自美國Cell Signaling公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔和山羊抗鼠IgG,購自美國Jackson公司;XMD8-92,購自美國Selleck公司;凝血酶(α-Thrombin),購自美國Enzyme Reseach公司。

比濁法測(cè)定人血小板的體外聚集 采用枸櫞酸鈉抗凝管采集健康志愿者血標(biāo)本,加入ADP/ATP雙磷酸酶和前列腺素E1抗凝,差速離心法制得血小板沉淀,重懸于臺(tái)式緩沖液中,采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)并調(diào)整濃度為3×108/mL。DMSO及終濃度為5、10、20 μmol/L的XMD8-92與血小板懸液共孵育3 min,使用Chrono-Log公司血小板聚集儀檢測(cè)在膠原刺激下,相應(yīng)濃度XMD8-92對(duì)人血小板聚集程度的影響[7]。

熒光素酶檢測(cè)人血小板的ATP分泌 在血小板聚集反應(yīng)達(dá)到平穩(wěn)后,加入10 μL的熒光素酶,利用血小板聚集儀同時(shí)檢測(cè)不同濃度XMD8-92對(duì)血小板ATP的分泌的影響[8]。

Western bolt法檢測(cè)Akt473、Akt308、PTEN370、PTEN380、ERK5分子的磷酸化水平 采集心?；颊呓M和穩(wěn)定性心絞痛組(對(duì)照組)血標(biāo)本,差速離心法制得洗滌血小板后,直接加入等體積2×SDS裂解液。對(duì)照組血小板在聚集反應(yīng)結(jié)束后,加入等體積2×SDS裂解液。在冰上充分裂解后,煮沸使蛋白變性,采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離蛋白,并轉(zhuǎn)至PVDF膜上。采用一抗4 ℃過夜,漂洗后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG,室溫振蕩孵育1 h。漂洗后顯色,終止反應(yīng)后拍照[9]。

血小板在纖維蛋白原上的鋪展和栓塊收縮

鋪展 在載玻片上滴加50 μg/mL纖維蛋白原溶液100 μL,4 ℃孵育過夜,PBS洗去未結(jié)合的纖維蛋白原,加2% BSA溶液室溫封閉1 h,PBS洗去未結(jié)合的BSA;分別取DMSO或不同濃度XMD8-92孵育的血小板懸液(3×107/mL)100 μL加到包被有纖維蛋白原的載玻片上,37 ℃孵育60 min,4%甲醛溶液固定后,采用鬼筆環(huán)肽對(duì)細(xì)胞骨架F-actin進(jìn)行染色,熒光顯微鏡下觀察并隨機(jī)選取視野拍照,Image J軟件測(cè)量血小板面積[10]。

栓塊收縮 向含有DMSO或XMD8-92的富血小板的血漿中分別加入凝血酶至終濃度為1 U/mL,37 ℃孵育,分別在 1 h、3 h 觀察栓塊的收縮情況并拍照,Image J 軟件測(cè)量栓塊面積。收縮率計(jì)算公式為:1-栓塊面積/起始栓塊面積。

結(jié) 果

急性心肌梗死患者組及對(duì)照組ERK5、Akt473及Akt308比較 為了明確ERK5是否參與了急性心肌梗死的發(fā)病,我們首先對(duì)急性心肌梗死患者組及對(duì)照組血小板中ERK5及Akt磷酸化水平進(jìn)行了分析。ERK5及Akt473及Akt308磷酸化水平在急性心肌梗死患者組較對(duì)照組顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖1)。參照J(rèn)UPITER研究,以CRP作為炎癥指標(biāo),以2.0mg/L為界[11],對(duì)心肌梗死患者組進(jìn)行亞組分析。CRP≥2.0mg/L組ERK5磷酸化水平略高于非炎癥組,二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.1,圖1)。該結(jié)果表明,急性心肌梗死發(fā)病過程中,血小板中ERK5活性增強(qiáng),其活化程度與炎癥水平無明顯相關(guān)性。

XMD8-92對(duì)血小板聚集和ATP分泌的影響 為了探索ERK5對(duì)血小板活化的影響,我們采用ERK5的選擇性抑制劑XMD8-92[12]對(duì)血小板的聚集進(jìn)行了檢測(cè)。以膠原為刺激劑時(shí),XMD8-92可顯著抑制血小板體外聚集,且呈現(xiàn)濃度依賴性。各濃度XMD8-92預(yù)孵育組與對(duì)照組相比,血小板聚集程度差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖2)。

采用血小板聚集儀同時(shí)檢測(cè)該抑制劑對(duì)血小板致密顆粒分泌的影響。圖2可見隨著XMD8-92濃度升高,對(duì)ATP分泌的抑制作用逐漸增強(qiáng)。與對(duì)照組相比,各處理組ATP分泌水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖2)。

XMD8-92對(duì)血小板鋪展及栓塊收縮的影響 整合素αIIbβ3是血小板表面最豐富的受體,血小板內(nèi)信號(hào)通路激活可導(dǎo)致其發(fā)生構(gòu)型改變,增加與配體纖維蛋白原結(jié)合的程度;反之,纖維蛋白原與整合素ɑIIbβ3結(jié)合也可以引起信號(hào)向血小板內(nèi)部傳導(dǎo),形成外向內(nèi)的擴(kuò)大信號(hào)[13]。血小板在纖維蛋白原表面的鋪展和在血漿中的收縮都是血小板外向內(nèi)信號(hào)的反映。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,XMD8-92抑制了血小板在纖維蛋白原上的鋪展,處理組與對(duì)照組比較,血小板平均鋪展面積顯著減小,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖3)。

同樣,XMD8-92對(duì)血小板在血漿中收縮也產(chǎn)生了顯著抑制的效果,并呈現(xiàn)濃度依賴性(圖3)。這些研究表明,針對(duì)ERK5為靶點(diǎn)抑制血小板活化,可顯著抑制血栓形成的過程。

XMD8-92對(duì)Akt473、Akt308和PTEN370磷酸化的影響Akt作為生物系統(tǒng)中重要的靶酶,其通過對(duì)血小板聚集和分泌的調(diào)控,而在血小板活化中扮演重要角色[14]。我們對(duì)聚集反應(yīng)后的血小板蛋白Akt473、Akt308位點(diǎn)磷酸化進(jìn)行了檢測(cè)。圖4表明,XMD8-92對(duì)Akt這兩個(gè)位點(diǎn)磷酸化水平均呈現(xiàn)濃度依賴性抑制作用。

Statistical analysis of Western blot of phosphorylated ERK5 (A),phosphorylated Akt473 (B) and phosphorylated Akt308 (C);D:Subgroups analysis of ERK5 phosphorylation levels according to the CRP levels of the AMI patients.Control group,n=33,AMI group,n=34.

圖1 急性心肌梗死組及穩(wěn)定性心絞痛組ERK5、Akt473及Akt308的磷酸化表達(dá)水平

Fig 1 The phosphorylation levels of ERK5,Akt473 and Akt308 in acute myocardial infarction (AMI) and stable angina (SA) group

A:The results of platelet aggregation induced by collagen in presence of XMD8-92 or dimethyl sulfoxide (DMSO);B:Collagen induced platelet aggregation was evaluated by the maximum platelet aggregation rate (MPAR);C:Platelet secretion of ATP was recorded in the presence of luciferin-luciferase agent.D:ATP secretion was evaluated by the maximum percentage.The quantitation was performed by Studentttest (mean±SEM,n≥3,(1)P<0.01).

圖2 ERK5抑制劑對(duì)膠原誘導(dǎo)的人血小板聚集和分泌的影響

Fig 2 Effect of ERK5 inhibitor XMD8-92 on human platelets aggregation and ATP secretion in response to collagen

圖3ERK5抑制劑對(duì)血小板鋪展和栓塊收縮的影響

Fig3EffectofERK5inhibitorXMD8-92onplateletspreadingandclotretraction

Washed human platelets were stimulated by collagen in the presence of XMD8-92 or DMSO,then immunoblotted with antibodies against:phosphorylated Akt473,phosphorylated Akt308,phosphorylated PTEN370,phosphorylated PTEN380 or GAPDH.

圖4 XMD8-92對(duì)Akt473、Akt308、PTEN370和PTEN380磷酸化的影響

Fig 4 The phosphorylation levels of Akt473,Akt308,PTEN370 and PTEN380 affected by XMD8-92

我們進(jìn)一步對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路中主要的調(diào)控激酶PTEN[15]磷酸化水平進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示,XMD8-92對(duì)PTEN380位點(diǎn)磷酸化無顯著影響,但對(duì)PTEN370位點(diǎn)磷酸化水平顯著抑制,趨勢(shì)和Akt磷酸化水平一致。因此,我們認(rèn)為,XMD8-92通過影響PTEN370位點(diǎn)的磷酸化水平,進(jìn)而調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)通路的活化水平,從而調(diào)控血小板的分泌、聚集及血栓的形成。

討 論

ERK5作為MAPK家族中的新成員,可通過磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白Akt、Bad、Caspase3等,調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及遷移等[16],在多種生物系統(tǒng)中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。近來有研究證明,其在人和血小板中也存在穩(wěn)定表達(dá),并利用動(dòng)物模型證實(shí)其參與了急性心肌梗死的進(jìn)展[4]。膠原與血小板的結(jié)合是動(dòng)脈血栓形成起始的關(guān)鍵步驟。本研究顯示：ERK5選擇性抑制劑XMD8-92對(duì)膠原引起的血小板的聚集及致密顆粒釋放呈濃度依賴性抑制作用,并顯著抑制了血小板在纖維蛋白原上鋪展及栓塊收縮,證明ERK5在血小板活化中扮演重要角色。

PI3K/Akt是血小板活化中的重要信號(hào)調(diào)節(jié)通路,在血小板黏附、聚集、伸展等過程中均起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。PTEN是該信號(hào)通路重要的調(diào)控激酶,而PTEN自身活性被其370及380位點(diǎn)的磷酸化負(fù)向調(diào)節(jié)[15]。PTEN可通過影響Akt磷酸化水平,負(fù)向調(diào)控膠原引起血小板的活化[7]。在本研究中,ERK5的抑制劑降低了PTEN 370位點(diǎn)的磷酸化水平,從而使PTEN活性增強(qiáng),引起Akt磷酸化水平減弱,從而抑制了血小板的聚集及分泌。

研究表明,ERK5在血小板上特異性敲除,可改善冠脈結(jié)扎后小鼠心功能的惡化[4]。我們對(duì)急性心肌梗死后患者血小板ERK5的磷酸化水平進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)較穩(wěn)定性心絞痛組,AMI組磷酸化水平顯著增加,血小板活化重要指標(biāo)Akt磷酸化水平也呈現(xiàn)類似趨勢(shì)。結(jié)合動(dòng)物模型中的研究,我們認(rèn)為ERK5通過調(diào)控血小板的活化參與了急性心肌梗死的發(fā)生發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)研究為將來把ERK5作為抗栓靶點(diǎn)提供了依據(jù)。今后尚需對(duì)其他刺激劑作用下ERK5的作用進(jìn)行探索,并應(yīng)進(jìn)一步對(duì)其抑制劑進(jìn)行在體研究。

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Phosphoryaltion levels of ERK5 in acute myocardial infarction patients and its role in platelet activationinvitro

GAO Wen, LI Jian, NI Huan-chun, XIE Kun, LUO Xin-ping△

(DepartmentofCardiology,HuashanHospital,FudanUniversity,Shanghai200040,China)

Objective To observe the phosphorylation levels of extracellular signal-regulated kinase 5 (ERK5) in acute myocardial infarction (AMI) patients and the effects of ERK5 selective inhibitor XMD8-92 on human platelet activationinvitro,and to explore its mechanism. Methods Western blot was applied to detect the phosphorylation levels of ERK5,Akt473 and Akt308 in AMI patients (n=34) and stable angina patients (n=33,control).The effects of different concentration of XMD8-92 on human platelet aggregation induced by collagen was tested by aggregometerinvitro.The release of ATP was measured simultaneously by luciferase detection.The effects of XMD8-92 on integrin ɑIIbβ3 were detected by platelet spreading on immobilized fibrinogen and clot retraction.The effects of XMD8-92 on phosphorylation levels of Akt473,Akt308 PTEN370 and ERK5 were detected by Western blot.Results The levels of phosphor-Akt473,Akt308 and phosphor-ERK5 were significantly higher in

AMI patients than that in control group (P<0.05).ERK5 inhibitor XMD8-92 diminished collagen-induced platelet aggregation,ATP secretion,the average area of platelet spreading on immobilized fibrinogen and the clot retraction extent.The levels of phosphor-Akt (Ser-473/Thr-308) and phosphor-PTEN (Ser370) were significantly down-regulated in the presence of XMD8-92. Conclusions ERK5 plays a role in platelet activation in AMI process.It regulates platelet activation by regulating PTEN and Akt phosphorylation. Its specific inhibitor is hoped to be new antithrombotic drug.

ERK5; platelet; thrombosis; acute myocardial infarction

國家自然科學(xué)基金(81270278);上海市科委科研計(jì)劃項(xiàng)目(16411965600)

R543.3

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2017.04.008

2016-12-06;編輯:王蔚)

△Corresponding author E-mail:luoxp2007@aliyun.com

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81270278) and the Scientific Research Project of Science and Technology Committee of Shanghai Municipality (16411965600).