色瑞替尼對精子制動作用和質(zhì)膜損傷的體外研究

舒妮燕 于合國 王玉柱 李衛(wèi)華 施惠娟 刁 華△

(1復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院生殖生物學(xué)研究室 上海 200032; 2復(fù)旦大學(xué)生殖與發(fā)育研究院,上海市計劃生育科學(xué)研究所,國家人口和計劃生育委員會計劃生育藥具重點實驗室 上海 200032)

色瑞替尼對精子制動作用和質(zhì)膜損傷的體外研究

舒妮燕1,2于合國2王玉柱2李衛(wèi)華2施惠娟2刁 華2△

(1復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院生殖生物學(xué)研究室 上海 200032;2復(fù)旦大學(xué)生殖與發(fā)育研究院,上海市計劃生育科學(xué)研究所,國家人口和計劃生育委員會計劃生育藥具重點實驗室 上海 200032)

目的 研究前期篩選到的精子功能調(diào)節(jié)候選化合物色瑞替尼的體外精子制動作用和機(jī)制。方法 計算機(jī)輔助精液分析(computer assistant sperm analysis,CASA)系統(tǒng)測定色瑞替尼對人和小鼠高活力精子20 s內(nèi)的制動效果;低滲膨脹(hypo-osmotic swelling,HOS)實驗、SYBR-14/PI染色探究精子質(zhì)膜的完整性;用電鏡觀察色瑞替尼處理后精子質(zhì)膜的變化;用色瑞替尼處理VK2/E6E7、End1/E6E7、Ect1/E6E7細(xì)胞,CCK-8及熒光染色法檢測細(xì)胞活性。結(jié)果 色瑞替尼對于(5～10)×106/mL人精子的20 s瞬間殺精最小有效濃度(minimal effective concentration,MEC)為(74.87±31.46) μmol/L,而相同條件下測到的殺精藥物壬苯醇醚(nonoxynol-9,N-9)的MEC為(219.75±20.89) μmol/L。CASA系統(tǒng)分析表明,色瑞替尼對精子的制動作用有時間-濃度依賴關(guān)系。HOS實驗及SYBR-14/PI染色法驗證色瑞替尼對精子質(zhì)膜有一定的損傷,并可致精子死亡。電鏡顯示色瑞替尼處理后的精子質(zhì)膜破裂,頭尾分離較多。色瑞替尼對上皮細(xì)胞有一定損傷。結(jié)論 色瑞替尼對精子有快速的制動作用,具有潛在的避孕藥效。

色瑞替尼; 精子制動; 避孕潛能; 小鼠

精子功能調(diào)控已成為不孕不育和安全避孕相關(guān)的重要生殖健康課題。隨著社會工業(yè)化程度的提高和環(huán)境污染的加重,不孕不育率顯著增加。我國不孕不育率已高達(dá)15%～20%,其中與男性因素相關(guān)的約占50%。男性不育的主要原因是精子數(shù)量的減少和質(zhì)量的下降。另一方面,如何安全避孕也是全球性的問題。目前,主要是女性負(fù)擔(dān)了避孕的重任,而男性僅可采用性交中斷(體外排精)、避孕套(陰莖套)和輸精管絕育術(shù)。調(diào)查顯示,男性可以也愿意承擔(dān)更多的責(zé)任。不論男性還是女性,對男性避孕藥的態(tài)度都相當(dāng)積極[1]。當(dāng)前迫切需要發(fā)展安全、有效、可逆的針對精子的避孕藥物。目前男性節(jié)育藥物包括激素類和非激素類,男性避孕措施中激素避孕方法和新的外科節(jié)育方法最接近臨床應(yīng)用[2]。但是,非激素類的男性避孕方法因特異針對睪丸、附睪或者精子特異的靶標(biāo),可能具有較少的不良反應(yīng)和較好的可逆性,因而成為研究開發(fā)的趨勢。

我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)翻譯后修飾如乙?；?、磷酸化等對精子功能調(diào)控有重要作用,在此基礎(chǔ)上針對性地從化合物庫中篩選出一系列乙酰化、磷酸化相關(guān)的抑制劑且具有顯著的調(diào)控精子功能活性的非激素類作為候選化合物。其中色瑞替尼(ceritinib)對人精子運動抑制效應(yīng)非常明顯,表現(xiàn)為20 s內(nèi)使所有精子失去運動活性所需的藥物最小濃度(minmal effective concentration,MEC)比經(jīng)典的殺精藥物壬苯醇醚(nonoxynol-9,N-9)還要低3倍左右。色瑞替尼是治療間變性淋巴瘤激酶-陽性轉(zhuǎn)移且對克唑替尼進(jìn)展或不能耐受的非小細(xì)胞肺癌患者的二線藥物,2014年獲美國FDA加速審批程序批準(zhǔn)上市。FDA的研究報告了色瑞替尼導(dǎo)致孕鼠少量胚胎發(fā)育異常,但推薦劑量下用猴、大鼠進(jìn)行的毒理學(xué)研究未發(fā)現(xiàn)其對雄性和雌性生殖器官有不良效應(yīng)[3-4]。我們對色瑞替尼體外精子制動作用及其機(jī)制進(jìn)行了探索,并參照N-9的殺精效果進(jìn)行了比較,初步探究了色瑞替尼作為外用殺精劑的潛力,同時提示育齡男性色瑞替尼用藥潛在的精子毒性風(fēng)險。

材 料 和 方 法

主要試劑及儀器 色瑞替尼(美國Selleck公司)溶解在DMSO (美國Sigma公司)中制備成10 mmol/L儲液;N-9(西安瑞聯(lián)生物技術(shù)有限公司)溶解在超純水中制備成40 mg/mL儲液;精子細(xì)胞BWW培養(yǎng)液(以下簡稱為BWW培養(yǎng)液)按WHO第5版配方配制,所需試劑均購自美國Sigma公司;LIVE/DEAD精子存活測定試劑盒(L-7011,美國Invitrogen公司);細(xì)胞增殖分析試劑盒(CCK-8,上海同仁藥業(yè)股份有限公司);角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(美國Gibco公司);計算機(jī)輔助精液分析(computer assistant spermanalysis,CASA,HTM-TOX IVOS版本12.3A)系統(tǒng)為瑞士漢密爾頓有限公司產(chǎn)品;掃描電子顯微鏡(Quanta 250 FEG,荷蘭FEI公司);高級濺射鍍膜儀(Leica EM SCD050,上海電子光學(xué)技術(shù)研究所);透射電子顯微鏡CM 120 (荷蘭Philips公司)。流式細(xì)胞儀(Accuri C6,美國BD公司);酶標(biāo)儀(ELx800,美國BioTek公司);倒置相差顯微鏡(DMi1,德國Leica公司);激光共聚焦顯微鏡(A1R,日本Nikon公司)。

細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng)基 VK2/E6E7陰道上皮細(xì)胞系購自美國ATCC細(xì)胞庫;End1/E6E7宮頸細(xì)胞系、Ect1/E6E7宮頸陰道細(xì)胞系均獲贈于南京大學(xué)。所有細(xì)胞株均采用角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng),37 ℃、5% CO2條件下使細(xì)胞呈單層貼壁生長,取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

實驗動物 SPF級C57小鼠購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司,飼養(yǎng)至8～10周進(jìn)行實驗。

精子制動實驗

精液標(biāo)本的采集 選取2016年3～9月就診于上海計生所醫(yī)院門診部的男性患者,年齡25～35歲,平均年齡(30.0±5.0)歲,禁欲3～8天,手淫法收集精液,選取的精液樣本應(yīng)在0.5 h內(nèi)液化,精子密度≥15×106/mL,精子活率>70%,pH值為7.2～8.0,精液量>2 mL,(a+b)級精子≥50%或a級精子≥25%,白細(xì)胞<1×106/mL,血清和精漿抗精子抗體均為陰性,符合《WHO人類精液檢查與處理實驗室手冊》(第5版)標(biāo)準(zhǔn)。本研究經(jīng)上海市計劃生育科學(xué)研究所倫理委員會批準(zhǔn),精液標(biāo)本捐獻(xiàn)者知情同意,標(biāo)本在完成實驗后,全部煮沸,高溫殺滅。

高活力精子的獲取 采用精子上游法獲得高活力精子[5]:將500 μL液化的精液標(biāo)本加在1 000 μL BWW培養(yǎng)液下方,在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育45～60 min。取上層600 μL培養(yǎng)液,可獲高活力精子,用精子培養(yǎng)液調(diào)整精子濃度至(10～20)×106/mL。

小鼠的高活力精子獲取:將小鼠以頸椎脫臼法處死,取出小鼠附睪尾部并剪開一道小口,以鑷子擠出里面的精液放入37 ℃預(yù)熱的1 mL BWW培養(yǎng)液中,在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)15 min,取上層清液即得高活力小鼠精子。

瞬間殺精效果測定 瞬間殺精效果,即20 s能夠100%制動精子的最低藥物濃度(minimal effective concentration,MEC)。

實驗共設(shè)空白對照組、陽性對照組(N-9)和色瑞替尼組。室溫條件下在96孔板內(nèi)用BWW培養(yǎng)液逐孔倍比稀釋藥物,每孔為50 μL。 96孔板放置在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育30 min。逐孔加入50 μL精子懸浮液,勻速吹打5次混勻,鏡下(×100)觀察在20 s內(nèi)精子是否全部失活。最終測出MEC。對小鼠精子MEC的測定方法同上。

CASA系統(tǒng)分析化合物制動精子的運動參數(shù) (10～20)×106/mL高活力精子懸浮液分別置入各EP管中,與500 μL各濃度的藥物分別充分混勻,置于37 ℃培養(yǎng)箱0.5～3 h后用CASA分析(每樣品記錄5個視野)。繪制藥物對精子制動效果的時間-劑量曲線。

精子復(fù)活試驗 選擇經(jīng)MEC色瑞替尼處理后的精子樣本,以BWW培養(yǎng)液300×g離心5 min,洗滌2次去除色瑞替尼,加入0.5 mL BWW培養(yǎng)液,并在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)30～60 min,顯微鏡下觀察10個視野,記錄是否有活動精子。

低滲膨脹實驗 300×g離心5 min去除精子懸液中的藥液,200 μL BWW培養(yǎng)液重懸后取100 μL加入1 mL低滲膨脹(hypo-osmotic swelling,HOS)溶液(75 mmol/L果糖,20 mmol/L檸檬酸鈉)混合,置于37 ℃溫箱中30 min。將混合液滴加在載玻片上,蓋玻片封蓋,倒置相差顯微鏡下計數(shù)顯示特征尾部卷曲或腫脹的精子數(shù)目。

精子尾部腫脹率=尾部腫脹數(shù)/精子計數(shù)的總數(shù)×100%。對照組中有60%以上的精子出現(xiàn)尾部腫脹,則認(rèn)為HOS實驗正常。

流式細(xì)胞儀法檢測精子存活率 采用SYBR-14/PI雙染法觀察精子存活情況及質(zhì)膜完整性。取5 μL SYBR-14加入1 mL精子懸浮液中(終濃度為100 nmol/L),混勻后37 ℃、5% CO2避光孵育5～10 min。BWW培養(yǎng)液300×g離心5 min,洗滌2次后重懸沉淀,加入5 μL碘化丙啶(propidium iodide,PI)(終濃度為12 μmol/L),37 ℃、5% CO2避光孵育5～10 min。流式細(xì)胞儀檢測SYBR-14/PI染色后的各組精子,精子計數(shù)>10 000,計SYBR-14+/PI-的精子數(shù)為質(zhì)膜完整精子數(shù)。

電子顯微鏡觀察精子質(zhì)膜的損傷 取精子懸液制作涂片,晾干后在2.5%的戊二醛中固定2 h,PBS 300×g離心5 min,洗3次,用1%鋨酸固定,PBS 300×g離心5 min,洗3次,不同濃度酒精梯度脫水,離子濺射儀鍍金后掃描電子顯微鏡觀察并記錄。300×g離心5 min,沉淀精子,固定脫水,加包埋液浸透固化,切片,染色,透射電子顯微鏡下觀察拍片。

色瑞替尼對陰道上皮細(xì)胞的影響

CCK-8測定藥物對細(xì)胞的抑制作用 收集對數(shù)生長期的VK2/E6E7、End1/E6E7、Ect1/E6E7細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔接種約5 000個細(xì)胞。待細(xì)胞貼壁后吸去培養(yǎng)液,PBS洗滌1次,將各培養(yǎng)孔分為對照組和藥物處理組。在藥物處理組中加入200 μL預(yù)先配置好的各濃度梯度的色瑞替尼或N-9溶液,對照孔加入200 μL培養(yǎng)液,分別培養(yǎng)24 h、48 h后去除培養(yǎng)液,加入不含血清的培養(yǎng)液100 μL和10 μL的CCK-8試劑。靜置30 min后,37 ℃ 繼續(xù)培養(yǎng)2 h,采用酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光度(D)值,測得細(xì)胞抑制率,計算半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)。細(xì)胞抑制率(%)=1-(實驗孔D值-空白孔D值)/(對照孔D值-空白孔D值)×100%。

藥物對細(xì)胞形態(tài)的影響 將VK2/E6E7、Ect1/E6E7和End1/E6E7細(xì)胞分別接種在細(xì)胞培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)至貼壁細(xì)胞長至90%,更換培養(yǎng)液,分別用含和不含藥物的角質(zhì)培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h。用鈣黃綠素-AM(Calcein-AM)、PI、Hoechst 33342溶液分別進(jìn)行細(xì)胞染色(終濃度分別為2 μmol/L、4 μmol/L和0.5 μg/mL)。用激光共聚焦顯微鏡對活細(xì)胞和死細(xì)胞進(jìn)行觀察。

結(jié) 果

色瑞替尼對精子運動的抑制

色瑞替尼20s內(nèi)100%制動精子的MEC精子運動能力是精子最易觀察的活性指標(biāo),在觀察到色瑞替尼的體外精子運動抑制活性的基礎(chǔ)上,我們參考Sander-Cramer方法[6]進(jìn)行了定量的觀察。色瑞替尼20s內(nèi)制動人和小鼠精子的MEC分別為(74.87±31.46)μmol/L(n=4)和(72.00±9.70)μmol/L(n=5),具有相似的快速制動作用(圖1)。為了評估色瑞替尼對精子運動抑制的相對毒性,我們采用經(jīng)典的體外殺精劑N-9作為對照進(jìn)行比較研究。相同條件下實驗測得N-9 20s內(nèi)制動人和小鼠精子的MEC分別為(219.75±20.89)μmol/L和(310.80±36.42)μmol/L。數(shù)據(jù)表明色瑞替尼的MEC數(shù)值顯著低于N-9,提示色瑞替尼具有很強(qiáng)的制動精子運動的活性。

色瑞替尼對精子的制動效果 為了探究色瑞替尼對精子的制動作用是否有時間-濃度的依賴關(guān)系,我們利用CASA系統(tǒng)持續(xù)測定加藥處理后精子的運動參數(shù)。

non-paired student’sttest.

圖1 色瑞替尼20 s內(nèi)使精子制動的最小有效濃度

Fig 1 MEC of ceritinib required to cause permostasis spermatozoa within 20 s

色瑞替尼對人和小鼠精子運動的抑制作用表現(xiàn)為隨著濃度增加和時間延長,精子活力(a+b+c級,a+b級)逐漸降低直至無活動精子(圖2)。隨著色瑞替尼濃度的升高,精子活力(a+b+c級,a+b級)降低的越快。當(dāng)色瑞替尼濃度恒定時,隨著給藥時間的延長,活動精子數(shù)量逐漸下降(圖2A、2A′)?？芍鹛婺釋θ祟惣靶∈缶舆\動的抑制作用隨著濃度增加而增強(qiáng),且隨著作用時間延長而增強(qiáng),具有明顯的劑量-時間依賴關(guān)系。由圖2可見,30 min處理使人和小鼠精子100%制動所需的色瑞替尼濃度分別為5和25 μmol/L。而相同條件下,使人和小鼠精子100%制動所需的N-9濃度為200 μmol/L,這表明色瑞替尼對精子的制動活性大于殺精劑N-9。色瑞替尼在2 h內(nèi)100%制動人精子的濃度低至5 μmol/L。

精子復(fù)活試驗 選取20 s MEC色瑞替尼處理的100%精子制動的樣本,洗去色瑞替尼并加入0.5 mL BWW培養(yǎng)液,孵育30～60 min,顯微鏡下未觀察到活動精子,即色瑞替尼對精子的制動作用是不可逆的。

HOS實驗 為了探究色瑞替尼抑制精子運動的機(jī)制,先以HOS實驗來確定色瑞替尼作用于精子后精子的質(zhì)膜是否完整。

空白對照組中精子尾部84%發(fā)生腫脹蜷曲,證明精液標(biāo)本及HOS低滲液正常。用N-9處理精子20 s后HOS實驗可見精子尾部幾乎不發(fā)生腫脹(0.62%),提示膜已通透。色瑞替尼組的腫脹發(fā)生率低至4.67% (圖3),提示色瑞替尼MEC在20 s內(nèi)能破壞精子質(zhì)膜。

The impact of ceritinib (A) and N-9 (B) on human sperm motility and progressive motility (A’ and B’),respectively.The impact of ceritinib (C) and N-9 (D) on mouse sperm motility and progressive motility (C’ and D’),respectively.Motility (%):The percentage of motile sperm [(a+b+c)%];Progressive (%):The percentage of forward spermatozoa [(a+b)%].CN:Blank control.

圖2 低于MEC濃度的色瑞替尼對精子的制動效果與時間-濃度關(guān)系曲線

Fig 2 The time-dose related spermostatic effects of ceritinib below MEC

A:Untreated human sperm (control);B:N-9-treated (MEC with in 20 s) human sperm; C:Ceritinib-treated (MEC with in 20 s) human sperm;D:The percentage of HOS-positive sperm after treatments.CN:Blank control.(1)P<0.01,(2)P<0.05 (Chi-square test).

圖3 色瑞替尼及N-9對精子質(zhì)膜的影響(HOS實驗)

Fig 3 The effects of ceritinib and N-9 on the sperm plasma membrane integrity (HOS assay)

流式細(xì)胞儀測定精子存活率 綠色熒光標(biāo)記質(zhì)膜完整的活精子,紅色熒光標(biāo)記質(zhì)膜遭破壞的死亡精子,發(fā)出兩種熒光的雙陽性精子為正處于瀕死的過渡狀態(tài)。空白對照組活精子比率達(dá)到84% (圖4A),陽性對照N-9 處理精子的死亡率達(dá)96.1% (圖4B)。以50 μmol/L色瑞替尼處理精子20 s,精子膜通透,死亡率達(dá)93.9% (圖4C),5 μmol/L色瑞替尼處理精子30 min的死亡率達(dá)96.2% (圖4D)。表明色瑞替尼制動的精子質(zhì)膜已經(jīng)遭到破壞,并致細(xì)胞死亡。提示與N-9類似,色瑞替尼可能是通過破壞精子質(zhì)膜而對精子產(chǎn)生制動效應(yīng)。

掃描及透射電子顯微鏡觀察精子質(zhì)膜改變 掃描及透射電子顯微鏡觀察空白對照組精子頭部呈橢圓形,質(zhì)膜表面光滑(圖5A),質(zhì)膜完整(圖5C)。而用20 s MEC的色瑞替尼處理精子頭部與尾部結(jié)合處斷裂較多,頭部質(zhì)膜有溶解性改變,尾部有起泡樣改變(圖5B);透射電鏡下可見頂體輕微損傷,頭頸部有斷裂,頭部質(zhì)膜明顯破裂,線粒體部分有明顯損傷(圖5D)。而N-9處理后精子質(zhì)膜破壞嚴(yán)重,大部分精子頂體膜呈溶解性改變[7]。

色瑞替尼對上皮細(xì)胞的影響 色瑞替尼對上皮細(xì)胞具有細(xì)胞增殖抑制作用(圖6)。色瑞替尼和N-9對VK2/E6E7細(xì)胞IC50值分別為(2.507±0.159) μmol/L和(2.552±0.145) μmol/L,對End1/E6E7細(xì)胞IC50值分別為(1.758±0.215) μmol/L和(2.343±0.243) μmol/L,對Ect1/E6E7細(xì)胞IC50值分別為(3.705±0.351) μmol/L和(2.401±0.199) μmol/L,兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義,表明色瑞替尼和N-9對上皮細(xì)胞增殖抑制效果類似。

A:Control,untreated human sperm;B:Human sperm treated with 162 μmol/L N-9 for 20 s;C:Human sperm treated with 50 μmol/L ceritinib for 20 s;D:Human sperm treated with 5 μmol/L ceritinib for 30 min.

圖4 SYBR-14/PI雙染法和流式細(xì)胞術(shù)測定色瑞替尼對精子質(zhì)膜的影響

Fig 4 Flow cytometry analysis of the impact of ceritinib on sperm plasma membrane integrity after SYBR-14/PI staining

A and C:Untreated normal spermatozoa;B and D:Spermatozoa treated with 50 μmol/L ceritinib for 20 s.The red arrow indicates the damage of plasma membrane in comparison to normal spermatozoa.

圖5 掃描電鏡和透射電鏡下觀察色瑞替尼處理后人精子質(zhì)膜損傷

Fig 5 Sperm membrane damages caused by ceritinib were observed with scanning electron microscopy and transmission electron microscopy

色瑞替尼和N-9分別處理VK2/E6E7細(xì)胞6 h后,以鈣綠黃素-AM/PI/Hoechst 33342三重染色后放在激光共聚焦顯微鏡下觀察,鈣綠黃素-AM染活細(xì)胞發(fā)出綠色熒光,PI染死細(xì)胞發(fā)出紅色熒光;Hoechst 33342染細(xì)胞核發(fā)出藍(lán)色熒光?？瞻讓φ战M中VK2/E6E7綠色熒光較多,細(xì)胞形態(tài)完整,細(xì)胞生長良好;N-9處理后幾乎沒有綠色熒光,細(xì)胞大部分破裂死亡,細(xì)胞形態(tài)遭到破壞;色瑞替尼處理6 h后,有的出現(xiàn)綠色熒光,但形態(tài)不完整(圖7)?？梢娚鹛婺釋ι掀ぜ?xì)胞膜有一定的損傷。

The average cell inhibition (%) of control is viewed as 0%.

圖6 色瑞替尼和N-9對VK2/E6E7 (A、A’)、End1/E6E7 (B、B’)、Ect1/E6E7 (C、C’)細(xì)胞抑制率的比較

Fig 6 Comparison of the inhibitory effects of ceritinib and N-9 on VK2/E6E7 cells (A,A’),End1/E6E7 cells (B,B’) and Ect1/E6E7 cells (C,C’)

After treatments for 6 h,VK2/E6E7 cells were stained with Calcein-AM/PI/Hoechst33342.A:Untreated blank control;B:Treated with 100 μmol/L N-9;C:Treated with 100 μmol/L ceritinib.

圖7 激光共聚焦顯微鏡觀察化合物處理后的VK2/E6E7細(xì)胞存活情況及形態(tài)

Fig 7 Survival rates and cell morphology of VK2/E6E7 was observed under laser confocal microscope

討 論

我們首次報道色瑞替尼對精子的運動具有快速制動能力。色瑞替尼20 s內(nèi)100%制動人精子的MEC為(74.87±31.46) μmol/L,與經(jīng)典殺精劑N-9的MEC [(219.75±20.89 μmol/L)]比較,色瑞替尼具有更好的殺精制動效果。此外,色瑞替尼對人類和小鼠的精子均具有類似的精子制動作用,提示可能具有共同的作用機(jī)制。我們初步揭示了色瑞替尼體外制動精子運動活性的機(jī)制主要是通過破壞精子膜的完整性。N-9作用于精子的機(jī)制是由于表面活性劑的親脂性與精子頂體膜和中段的脂質(zhì)相互作用,裂解精子膜,導(dǎo)致精子的制動和死亡[8]。觀測色瑞替尼處理組精子的存活率及質(zhì)膜完整性實驗表明,色瑞替尼能破壞精子質(zhì)膜的完整性,導(dǎo)致絕大部分精子死亡。電鏡觀測顯示色瑞替尼作用下精子頂體膜發(fā)生脫落,精子頸部細(xì)胞膜破裂,精子頭尾分離。證明了色瑞替尼對精子質(zhì)膜有很強(qiáng)的破壞作用。精子復(fù)活實驗也證明色瑞替尼對精子造成了不可逆的功能損傷。但是其通過何種方式對質(zhì)膜造成損傷還有待研究。

色瑞替尼較N-9具有更優(yōu)良的殺精效果,提示其還有作為外用殺精劑的潛能。通過定量比較,我們證明色瑞替尼的精子制動作用比經(jīng)典的體外殺精劑N-9強(qiáng),且在低劑量如5 μmol/L以下,仍有時間和劑量依賴的效應(yīng)。N-9是目前國內(nèi)外最常用的外用陰道殺精劑,能非特異性的破壞精子細(xì)胞膜而起殺精作用。雖然N-9有較大的刺激性及感染HIV風(fēng)險增加等缺陷[9-10],但目前還沒有其他殺精劑可以取代N-9。所以在研究降低N-9刺激性、提高安全性的劑型[如安芳欣(壬苯醇醚緩釋凝膠劑)[11]]之外,還有必要開發(fā)具有優(yōu)良?xì)⒕Ч男禄衔?。色瑞替尼具有一定的潛?但還需進(jìn)行成藥性的更詳細(xì)評估。將色瑞替尼與N-9比較時,N-9的20 s制動濃度與文獻(xiàn)[12]所述0.20～0.25 mg/mL (約為324.24～405.30 μmol/L)有微小差距,主要原因可能有:N-9藥品來源不同;測定精子活力的方法雖然都使用Sander-Cramer方法,但溶液與精液比例不完全一致。

色瑞替尼在治療非小細(xì)胞肺癌時應(yīng)答性非常好,解決了對克唑替尼耐受的問題[13],根據(jù)美國FDA的研究報告,色瑞替尼的生殖毒性實驗發(fā)現(xiàn)其可通過雌性懷孕動物影響胚胎發(fā)育,造成骨異常、臟器異常、鎖骨下動脈異常等[3-4]。建議女性在完成色瑞替尼用藥治療后至少兩周進(jìn)行有效避孕[3],但沒有對育齡男性用藥進(jìn)行足夠的生殖風(fēng)險提示。我們在體外觀察到色瑞替尼有明顯的精子毒性,這是此前未見報道的,提示育齡男性患者精子接觸色瑞替尼可能具有精子毒性的潛在風(fēng)險。由于色瑞替尼是口服藥物,在體內(nèi)可能發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化,且體內(nèi)有血睪屏障的存在,其是否會對睪丸、附睪中不同發(fā)育階段的精子具有毒性,還需進(jìn)一步研究。

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The spermostatic and plasma membrane injury effects of ceritinibinvitro

SHU Ni-yan1,2, YU He-guo2, WANG Yu-zhu2, LI Wei-hua2, SHI Hui-juan2, DIAO Hua2△

(1DepartmentofReproductiveBiology,ShanghaiMedicalCollege,Shanghai200032,China;2KeyLabofReproductionRegulationofNPFPC,SIPPR,IRD,FudanUniversity,Shanghai200032,China)

Objective To explore theinvitrospermostatic effects and the mechanisms of ceritinib,a novel candidate from the active compound pools previously screened for the regulation of sperm function. Methods The vigor sperm of human and mouse were incubated with ceritinib for 20 seconds,and the sperm motility was evaluated by computer assistant sperm analysis (CASA).The integrity of the sperm plasma membrane and the survival ratio of sperm was assessed by hypo-osmotic swelling (HOS) assay and SYBR-14/PI staining.The damage of sperm plasma membrane was detected by electron microscope.The cytotoxicity of ceritinib to VK2/E6E7,End1/E6E7 and Ect1/E6E7 cells was measured by CCK-8 assay and fluorescent staining. Results The minimal effective concentration (MEC) of ceritinib to (5-10)×106/mL human sperm within 20 seconds was (74.87±31.46)μmol/L,which was significantly lower than the MEC of nonoxynol-9 (219.75±20.89) μmol/L measured in the same condition.The time-dose related spermostatic effects of ceritinib were measured by CASA system.Ceritinib was able to damage sperm membrane and caused sperm death with HOS and SYBR-14/PI staining.With electron microscopy,the sperm membrane was observed to be ruptured,and the heads and tails of sperm were separated by ceritinib.Ceritinib was also able to damage the epithelial cells. Conclusions Ceritinib has acute spermostatic effects and potential contraceptive effects.

ceritinib; spermostatic effects; contraceptive potential; mouse

國家重點研發(fā)計劃(2016YFC1000905);國家自然科學(xué)基金面上項目(81671508);上海市科技創(chuàng)新行動計劃項目(15431903000)

R697

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2017.04.001

2017-02-16;編輯:王蔚)

△Corresponding author E-mail:diaohua@sippr.org.cn

*This work was supported by the State′s Key Project of Research and Development Plan of China (2016YFC1000905),the General Program of National Natural Science Foundation of China (81671508) and the Shanghai Science and Technology Innovation Program (15431903000).