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    “觀察DNA和RNA在細(xì)胞中的分布”實(shí)驗(yàn)方法的優(yōu)化

    2017-08-20 08:49:36趙惠新
    生物學(xué)教學(xué) 2017年3期
    關(guān)鍵詞:藍(lán)綠色染色劑烘箱

    王 佳 石 樂 趙惠新

    (新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 烏魯木齊 830054)

    1 前言

    “觀察DNA和RNA在細(xì)胞中的分布”實(shí)驗(yàn)是人教版高中生物學(xué)必修1《分子與細(xì)胞》第2章第3節(jié)中的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)有效幫助學(xué)生理解DNA和RNA在細(xì)胞中的分布特點(diǎn),強(qiáng)化對基礎(chǔ)知識的掌握,提高學(xué)生的實(shí)驗(yàn)操作能力,為學(xué)習(xí)必修2(遺傳與進(jìn)化)的內(nèi)容奠定基礎(chǔ)。

    按教材步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),觀察到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均為紫紅色,細(xì)胞核難以染成綠色,影響教學(xué)效果。經(jīng)分析,可能存在以下幾種原因:①染色劑甲基綠中含有甲基紫,甲基紫易遮住甲基綠和吡羅紅所染的綠色和紅色,使整個細(xì)胞呈現(xiàn)紫紅色[1];②用酒精燈烘干裝片溫度過高:酒精燈火焰溫度在400℃~500℃左右,而高溫會使核酸分子的空間構(gòu)型發(fā)生改變,難以與甲基綠結(jié)合呈現(xiàn)綠色[2];③水解所用鹽酸溶液濃度較高:鹽酸能改變細(xì)胞膜的通透性,使DNA和蛋白質(zhì)分離,有利于DNA與甲基綠結(jié)合,但也能改變DNA構(gòu)型及細(xì)胞內(nèi)的pH,降低甲基綠與DNA的親和力;④染色劑中甲基綠與吡羅紅的體積比不適宜:如甲基綠所占比例低也可能導(dǎo)致細(xì)胞核中的DNA不被染成綠色。

    針對這些原因,對該實(shí)驗(yàn)中材料的固定方法、水解所用鹽酸的濃度、染色方法等方面進(jìn)行優(yōu)化,提出與教材比較貼合的實(shí)驗(yàn)方案。

    2 實(shí)驗(yàn)材料與方法

    2.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑 實(shí)驗(yàn)材料為人的口腔上皮細(xì)胞。主要試劑有生理鹽水、氯仿、2%~8%的鹽酸、2%的甲基綠、1%的吡羅紅。

    2.2 實(shí)驗(yàn)方法 參照教材中“觀察DNA和RNA在細(xì)胞中的分布”的實(shí)驗(yàn)操作步驟,略有改動。其中:①烘干方式采用酒精燈外焰烘烤和60℃烘箱作對比;②水解使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%、6%、4%、2%、0%梯度的鹽酸做對比;③染色劑甲基綠使用前先用氯仿分液提純,染色時甲基綠和吡羅紅的體積比分別使用3∶1、4∶1、5∶1和6∶1做對比。比較實(shí)驗(yàn)效果,提出本實(shí)驗(yàn)改進(jìn)的建議。

    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

    3.1 不同烘干方式對細(xì)胞核染色效果的影響 從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看,在火焰上(上方稍高處)和60℃烘箱內(nèi)對材料進(jìn)行烘干并不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由表1的結(jié)果顯示,A、B、E、F、I、J、M、N這8組實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞核被染成了藍(lán)綠色。從A與E、B與F、I與M、J與N為對照來看,火焰上方烘烤和60℃烘箱烘干對染色效果沒有影響,都把細(xì)胞核染成了藍(lán)綠色。但考慮到用酒精燈進(jìn)行烘干時,學(xué)生可能因操作不當(dāng)而發(fā)生玻片破碎等危險(xiǎn)情況、或因掌握不好烘烤的距離和時間使實(shí)驗(yàn)失敗,因此我們建議用烘箱代替酒精燈進(jìn)行烘干操作。

    表1 不同條件下人的口腔上皮細(xì)胞染色現(xiàn)象

    ( -表示不進(jìn)行此操作)

    3.2 不同鹽酸濃度對細(xì)胞核染色效果的影響 如表1所示,水解所用的鹽酸濃度是本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵影響因素之一。當(dāng)鹽酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不超過2%時,細(xì)胞核顯藍(lán)綠色;當(dāng)超過2%,雖然能改變細(xì)胞膜的通透性、使DNA和蛋白質(zhì)有效分離,但可能存在沖洗不徹底,細(xì)胞內(nèi)pH低于4.8,甲基綠與DNA親和力低而不結(jié)合等情況。另外,甲基綠與DNA的結(jié)合依賴于DNA完整的雙螺旋構(gòu)型。甲基綠分子結(jié)構(gòu)中帶2個正電荷的基團(tuán)只有分別與DNA雙螺旋每一圈的磷酸根結(jié)合,才能使DNA顯綠色,而吡羅紅對改變構(gòu)型的DNA和聚合度低的RNA有較大的親和力使其顯紅色。因此,當(dāng)使用較高濃度的鹽酸時,可能因細(xì)胞核中的DNA構(gòu)型發(fā)生改變,使甲基綠與DNA結(jié)合能力降低,不顯綠色。

    所以本實(shí)驗(yàn)可選用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的鹽酸或不使用鹽酸。但考慮到鹽酸能有利于DNA與蛋白質(zhì)解離,幫助學(xué)生更好地理解DNA在細(xì)胞中存在的結(jié)構(gòu)和分布等知識點(diǎn),建議在實(shí)際教學(xué)中可保留鹽酸的使用,采用2%的鹽酸進(jìn)行水解。

    3.3 甲基綠純化及兩種染色劑不同的配比對細(xì)胞核染色效果的影響 染色劑甲基綠中常含有甲基紫,易將細(xì)胞核染成紫紅色。甲基紫能溶于氯仿,而甲基綠不溶,所以在實(shí)驗(yàn)前將溶于水中的甲基綠與氯仿等體積混合,置于分液漏斗中分液,排出含甲基紫的氯仿,以減少其對染色效果的干擾。

    染色劑中甲基綠和吡羅紅的體積比也是一個關(guān)鍵的影響因素。有研究表明,作為堿性染料的甲基綠和吡羅紅都能與DNA發(fā)生結(jié)合,并存在競爭關(guān)系,但甲基綠與DNA結(jié)合能力更強(qiáng),也更穩(wěn)定,這是由DNA分子雙螺旋的空間構(gòu)型所決定的[3]。從表1中A、B、E、F、I、J、M、N組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果看,當(dāng)2%甲基綠與1%吡羅紅的體積比為5∶1或6∶1時,細(xì)胞核被染成了藍(lán)綠色,效果明顯,而在體積比為3∶1和4∶1時未能呈藍(lán)綠色,說明甲基綠在混合染液中的含量對染色效果具有重要作用。從C、D、E、F組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果對比來看,甲基綠與吡羅紅的體積比為5∶1和6∶1時細(xì)胞核被染成較明顯的藍(lán)綠色,比值在6∶1時細(xì)胞核染色更深,但由于在6∶1時細(xì)胞質(zhì)亦被染成了藍(lán)綠色,所以在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中應(yīng)選用5∶1的比例進(jìn)行染液的配制較適宜。

    4 優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件

    基于上述的結(jié)果及分析,可對該實(shí)驗(yàn)進(jìn)行相應(yīng)改進(jìn):①使用60℃的烘箱對材料進(jìn)行烘干;②將教材中水解所用的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的鹽酸換成2%的鹽酸;③對甲基綠進(jìn)行提純,并使用體積比為5∶1的2%甲基綠與1%吡羅紅配制染色劑進(jìn)行染色。使用優(yōu)化后的方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)效果明顯,且與教材中的步驟基本保持一致,對該內(nèi)容的實(shí)驗(yàn)教學(xué)具有一定參考價值。

    (*通訊作者)

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