提高“DNA粗提與鑒定”實(shí)驗(yàn)開出率的思考與探索

霍 靜

(西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/西南大學(xué)科學(xué)教育研究中心 重慶 400715)

李妞妞 曾令江

(西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 重慶 400715)

20世紀(jì)中后葉，分子生物學(xué)開發(fā)了一套人工操作DNA的技術(shù)，揭開了基因工程的序幕。目前，提取DNA已經(jīng)有了較為成熟的方法，常用的有CTAB法、SDS法、鹽析法等[1]，甚至用一些特殊的方法還能獲得標(biāo)本中“痕量級(jí)”DNA。中學(xué)學(xué)習(xí)DNA的提取，旨在結(jié)合學(xué)生已有知識(shí)，學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)研究的思路和方法。人教版教材就是利用“滲透吸水”和“鹽析”的原理，引導(dǎo)學(xué)生理解DNA提取的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。為了便于中學(xué)開出更具有操作性的DNA提取和鑒定的實(shí)驗(yàn)，本文嘗試解析DNA粗提的實(shí)驗(yàn)原理，并對(duì)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)一步改進(jìn)，尋找一個(gè)適合在一節(jié)課中完成的實(shí)驗(yàn)方案，為在中學(xué)更好地開設(shè)出該實(shí)驗(yàn)提供理論和方法的指導(dǎo)。

1 實(shí)驗(yàn)原理的解析

1．1 提取液的基本成分 從活細(xì)胞中獲取DNA，需要先構(gòu)建一個(gè)細(xì)胞的立體圖景，才能更好的確定出實(shí)驗(yàn)的基本思路，理解提取液的基本成分。細(xì)胞中的DNA大部分穩(wěn)定地存在細(xì)胞核中，線粒體和葉綠體中也有少量的DNA存在，細(xì)胞核和細(xì)胞器懸浮于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中，細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)是一個(gè)酶溶液，各種復(fù)雜的代謝反應(yīng)在這里有條不紊的進(jìn)行。

1.1.1 緩沖體系的建立 目前研究已發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)是一個(gè)高度有序的體系，其中蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間，蛋白質(zhì)與其他大分子之間通過弱鍵而相互作用，并處于動(dòng)態(tài)平衡之中，一旦細(xì)胞破裂，依靠分子間脆弱的相互作用而形成的結(jié)構(gòu)體系就會(huì)遭到破壞。所以在實(shí)驗(yàn)前，需要提供一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的緩沖環(huán)境，使各種生物大分子基本維持其在細(xì)胞中的狀態(tài)。在提取DNA的研磨液中Tris-HCl就是一種溫和的緩沖液，它被廣泛用作核酸和蛋白質(zhì)的溶劑。Tris堿性較強(qiáng)，中文名“三(羥甲基)氨基甲烷”，用HCl調(diào)配出來，就稱為Tris-HCl緩沖液。提取DNA的Tris-HCl緩沖液pH值為8，這種弱堿性溶液較好地維持了提取液的pH值，DNA被去質(zhì)子化后，提高了DNA的溶解性。

1.1.2 DNA的核酸酶抑制劑 如果DNA離開了正常的生理位置，細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中的核酸酶會(huì)立即將其降解，以免干擾正常的生命活動(dòng)。我們的汗液，唾液中也有大量的核酸酶，實(shí)驗(yàn)使用的各種器具也會(huì)帶有核酸酶。在提取DNA之前，要盡可能先將這些核酸酶鈍化，保護(hù)好DNA。乙二胺四乙酸(EDTA)是一種金屬螯合劑，能螯合溶液中Mg2+、Ca2+、Mn2+、Fe2+等二價(jià)金屬離子，而多數(shù)的核酸酶在發(fā)揮作用時(shí)需要Mg2+的參與，EDTA螯合了Mg2+，就能有效抑制核酸酶的活性。

1.1.3 DNA的溶解液 DNA在NaCl的鹽溶液中，隨著濃度的變化，溶解度也會(huì)發(fā)生變化。高濃度的NaCl(2 mol/L)溶液能溶解較多的DNA。同時(shí)，NaCl是一種中性鹽，高濃度的鹽溶液會(huì)破壞蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)，使其發(fā)生鹽析，形成沉淀。這樣就能在最初的提取環(huán)節(jié)，為DNA溶解和沉淀蛋白質(zhì)做好準(zhǔn)備。

1.1.4 在細(xì)胞膜上打洞 DNA包裹在細(xì)胞核的雙層膜結(jié)構(gòu)中，整個(gè)細(xì)胞又由細(xì)胞膜包被。實(shí)驗(yàn)要獲得游離的DNA，需要打開膜的束縛。而生物膜主要由磷脂和蛋白質(zhì)組成，只要能破壞磷脂的結(jié)構(gòu)，膜的基本骨架就會(huì)瓦解。十二烷基磺酸鈉(SDS)是一種離子型表面活性劑，對(duì)蛋白和油性污垢有較強(qiáng)的去除作用，在提取液中能有效破壞細(xì)胞膜的磷脂和膜蛋白，使細(xì)胞膜和核膜破裂。

在常用的洗滌劑中含有SDS的成分，所以洗滌劑具有較好地去除油漬的作用，但洗滌劑中不具備提取液中的其他成分，如果中學(xué)實(shí)驗(yàn)只選用洗滌劑和食鹽的配比來研究DNA的粗提取，很難保證成功提取出DNA。

1．2 去除非DNA雜質(zhì) 具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：

1.2.1 保留上清液 經(jīng)過提取液處理的材料，理論上大部分的DNA已經(jīng)溶解在提取液中，在實(shí)驗(yàn)的體系中，還有大量不溶的物質(zhì)，這些物質(zhì)會(huì)干擾后面進(jìn)一步從溶液中獲取DNA。

所以，需要保留上清液，去除其他的雜質(zhì)?？尚械牟僮鞑襟E是離心取上清，如果中學(xué)沒有離心機(jī)，可以采用四層紗布過濾，收集提取液。

1.2.2 再次純化DNA DNA是由核苷酸高度聚合而成的一種非極性的生物大分子，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不溶于極性的無水乙醇(酒精)。而不同種類的蛋白質(zhì)，由于帶有不同數(shù)量的極性基團(tuán)，乙醇就是很好的溶劑。純化DNA時(shí)，可以將收集到的上清液加入等體積或2倍體積的無水乙醇中，靜置2～3 min，白色的DNA就會(huì)呈絲狀沉淀出來。

1.3 鑒定DNA 在中學(xué)一般采用二苯胺試劑的顯色反應(yīng)，較便捷地鑒定DNA。DNA在酸性條件下加熱，其嘌呤堿與脫氧核糖間的糖苷鍵斷裂，生成嘌呤堿、脫氧核糖和脫氧嘧啶核苷酸，其中的脫氧核糖在酸性環(huán)境中加熱脫水生成ω-羥基-γ-酮基戊醛，能與二苯胺試劑反應(yīng)生成藍(lán)色物質(zhì)，如果鑒定溶液顯淺藍(lán)色，就證明提取出了DNA。

2 實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵問題思考

2.1 實(shí)驗(yàn)材料的選取 人教版教材選修1《生物技術(shù)實(shí)踐》中通過基礎(chǔ)知識(shí)的梳理，整理出了鹽析提取DNA的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，在實(shí)驗(yàn)材料選擇時(shí)提供了“魚卵、豬肝、菜花、香蕉、雞血、哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞、獼猴桃、洋蔥、豌豆、菠菜、在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的大腸桿菌”作為材料的備選，并提示實(shí)驗(yàn)可以比較哪種材料中的DNA含量更高。

如果以血液作為實(shí)驗(yàn)材料，能方便的破碎細(xì)胞，但現(xiàn)有研究表明“哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞一般是釋放到外周血中已經(jīng)不含有細(xì)胞核的網(wǎng)織紅細(xì)胞，即便是非哺乳類動(dòng)物的紅細(xì)胞也屬于高度特化的細(xì)胞種類”；選取洋蔥的肉質(zhì)鱗片，這種變態(tài)葉是一種貯藏組織；香蕉、獼猴桃是已經(jīng)成熟的果實(shí)；豌豆是種子；豬肝是高度特化的組織……這些材料內(nèi)蛋白質(zhì)或糖類等的含量較高，僅用粗提的實(shí)驗(yàn)原理，很難較好地分離出DNA，在析出DNA的環(huán)節(jié)，會(huì)得到較多的非DNA的粘稠黃白色混合物，甚至無法用二苯胺試劑檢測(cè)到DNA的存在。

在實(shí)驗(yàn)材料選擇時(shí)推薦DNA含量相對(duì)較高、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)含量較少、顏色較淺的生物材料[2]。菜花容易在菜市購(gòu)買到，在有溫室大棚蔬菜提供的城市也不受季節(jié)的影響，其中有大量的細(xì)胞在進(jìn)行旺盛地分裂，細(xì)胞內(nèi)DNA含量較高，其他生物大分子的含量不多，也沒有葉綠素的干擾，能通過研磨破碎細(xì)胞。培養(yǎng)的大腸桿菌也是提取DNA的好材料，在不具備培養(yǎng)大腸桿菌的實(shí)驗(yàn)室，取材會(huì)受到限制。如果選用植物幼嫩的芽尖提取DNA，去除非DNA雜質(zhì)時(shí)還需要加入氯仿等洗滌色素蛋白的步驟。所以，綜合考慮推薦中學(xué)選擇菜花作為實(shí)驗(yàn)材料。

2.2 充分研磨 從實(shí)驗(yàn)安全的角度考慮，不建議在液氮環(huán)境中研磨材料。根據(jù)中學(xué)的實(shí)際情況，在有提取液的條件下破碎細(xì)胞，才能更好地獲取細(xì)胞中的DNA。植物細(xì)胞被纖維質(zhì)的細(xì)胞壁保護(hù)著，只有打開細(xì)胞壁才能讓細(xì)胞的內(nèi)容物充分地流出，所以在實(shí)驗(yàn)中充分研磨是必要的。在5 mL的提取液中，稱取2 g～5 g的材料(并不是材料越多越好)迅速研磨勻漿至肉眼看不見小顆粒。研磨過程要求盡可能快，保證細(xì)胞內(nèi)含物能盡快與提取液混勻，避免DNA被降解。

2.3 避免加入與實(shí)驗(yàn)無關(guān)的藥品 DNA提取要盡量避免蛋白質(zhì)和DNA一起溶解在濾液中，嫩肉粉的主要成分為蛋白酶，它能將結(jié)構(gòu)復(fù)雜的不溶于水的蛋白質(zhì)大分子分解為能溶于水的小分子，增加了后期純化DNA 的難度。

而且，細(xì)胞中提取的DNA來源于由蛋白質(zhì)參與盤曲折疊形成的高級(jí)結(jié)構(gòu)——染色體，蛋白酶在分解蛋白質(zhì)的時(shí)候，會(huì)破壞DNA的完整結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致無法獲得理想的DNA提取物。

3 可供參考的DNA粗提與鑒定方案

根據(jù)影響實(shí)驗(yàn)成敗的因素分析，在實(shí)踐的基礎(chǔ)上，整理出適合在1節(jié)課完成的實(shí)驗(yàn)操作步驟(表1，見后頁)，供中學(xué)生物學(xué)教師參考。

(基金項(xiàng)目：西南大學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究項(xiàng)目，No.SYJ2016049)

表1用菜花提取DNA的實(shí)驗(yàn)操作步驟

步驟方法操作時(shí)長(zhǎng)(共35 min)研磨稱取剪好的菜花2～5 g于研缽中,加入5 mL研磨液,充分研磨至勻漿狀(研磨液:稱取1.01 g Tris試劑放入100 mL燒杯中,用50 mL蒸餾水溶解,再用2 mol/L的HCl將溶液酸堿性調(diào)到pH=8.0,即成為Tris-HCl緩沖液。然后再分別加入8.76 g NaCl、3.72 g EDTA(乙二胺四乙酸)、2 g SDS(十二烷基磺酸鈉),溶解后再加水定容到100 mL)2～5 min過濾在漏斗上墊四層用水潤(rùn)濕的紗布,收集過濾研磨好的菜花濾液(若自然過濾速度過慢,可以戴上一次性手套擠壓;有條件的實(shí)驗(yàn)室可采用3000 rmp、離心5～10 min的方法;若轉(zhuǎn)速更快,還可以縮短時(shí)間)2～5 min析出將濾液加入盛有兩倍體積冷凍無水乙醇的塑料離心管中,靜置。觀察白色絮狀物析出4～5 min5 min鑒定取A、B兩支試管,分別加入2 mL蒸餾水,用玻璃棒將白色絮狀物挑起放于B試管中,攪拌使其充分溶解;向兩支試管中各加入2 mL二苯胺試劑(現(xiàn)配現(xiàn)用)在沸水浴中加熱,觀察現(xiàn)象。15 min