諾如病毒分析檢測(cè)方法

高光普

諾如病毒感染性腹瀉是在全世界范圍內(nèi)的流行疾病，全年均可發(fā)生感染，感染對(duì)象主要是成人和學(xué)齡兒童，寒冷季節(jié)呈現(xiàn)高發(fā)狀態(tài)。諾如病毒感染性強(qiáng)，近些年國(guó)內(nèi)外也爆發(fā)過(guò)多次由諾如病毒引起的病毒感染事件。為了讓大家更好地了解諾如病毒，北京良潤(rùn)生物科技有限公司總經(jīng)理劉磊老師來(lái)到了食安大講堂，向觀眾分享了他多年來(lái)從事諾如病毒研究的相關(guān)認(rèn)知。

諾如病毒感染事件

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)爆發(fā)了多次諾如病毒感染事件：2010年12月，廣州從化有429人發(fā)病，調(diào)查后最終確認(rèn)是由水污染引起的諾如病毒感染；2013年4月，揭陽(yáng)市某學(xué)院有近400人患感染性腹瀉，經(jīng)當(dāng)?shù)丶部刂行幕?yàn)判斷，主要是諾如病毒傳播引起的；2014年2月，嘉興市有400多名學(xué)生感染就醫(yī)，累計(jì)報(bào)告發(fā)病人數(shù)511人；2014年12月，廣州越秀區(qū)某小學(xué)21人發(fā)病，波及217人；2015年1月深圳有140名發(fā)病，經(jīng)檢測(cè)已確定引發(fā)此癥狀的原因系諾如病毒；2016年3月，北京市衛(wèi)計(jì)委公布數(shù)據(jù)顯示，2016年1～2月，北京市報(bào)告了31起急性胃腸炎聚集性疫情，其中有28起是由諾如病毒引發(fā)。以上每次事件波及的人數(shù)眾多，對(duì)我國(guó)人民的生命財(cái)產(chǎn)安全造成了很大損失。

諾如病毒檢測(cè)方法

諾如病毒（Norovirus，NoV），又稱諾瓦克病毒，是一組形態(tài)類似、抗原略有不同的病毒顆粒?？筛腥救嘶騽?dòng)物，引發(fā)急性腸胃炎、冬季嘔吐性疾病、胃腸性流感等病癥，主要臨床表現(xiàn)為頭痛、發(fā)熱、惡心、腹痛腹瀉等，是非細(xì)菌性胃腸炎的主要病原體之一。隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷進(jìn)步，對(duì)于諾如病毒的檢測(cè)也出現(xiàn)了越來(lái)越多的方法，其中代表性的方法有電鏡法、免疫法、RT-PCR 3種（對(duì)比見(jiàn)表1）。

諾如病毒最初是通過(guò)電鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)的，因此最初的諾如病毒診斷方法主要是電鏡法（EM）與免疫電鏡法（IEM）。通過(guò)電鏡觀察病毒粒子的形態(tài)來(lái)確認(rèn)諾如病毒，需要的病毒濃度較高，因此靈敏度與特異性相對(duì)較低，并且只能夠在比較專業(yè)的檢測(cè)機(jī)構(gòu)才能進(jìn)行，無(wú)法普及。

隨著人們對(duì)諾如病毒研究的不斷深入，免疫法逐漸被用來(lái)檢測(cè)諾如病毒。免疫法主要有放射免疫法（RIA）、生物素-親和素免疫法（Biotin- Avidin Immunoassy）以及酶聯(lián)免疫法（ELISA）。RIA的靈敏度要比IEM高10～100倍，但需要使用放射元素進(jìn)行標(biāo)記，且時(shí)間較長(zhǎng)（6d）；BiotinAvidin Immunoassy是美國(guó)疾病預(yù)防控制中心基于RIA建立的簡(jiǎn)化方法，靈敏度與RIA相近；ELISA具有靈敏度高、耗時(shí)少、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)，便于廣泛推廣，但株型特異性太強(qiáng)，應(yīng)用范圍較狹窄。

隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，市場(chǎng)上出現(xiàn)了更加靈敏、特異、快速的核酸檢測(cè)方法，包括等溫核酸擴(kuò)增（NASBA）、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）、熒光染料RT-PCR、熒光探針RT-PCR、多重RT-PCR等。RT-PCR方法是目前檢測(cè)諾如病毒應(yīng)用最廣泛的方法，被稱為檢測(cè)諾如病毒的“金標(biāo)準(zhǔn)”。NASBA直接擴(kuò)增RNA來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，儀器相對(duì)簡(jiǎn)便，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳、印跡雜交或者熒光檢測(cè)來(lái)鑒定結(jié)果，靈敏度低于RT-PCR；RTPCR通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄RNA模板、PCR擴(kuò)增特異性產(chǎn)物，使用瓊脂糖凝膠電泳來(lái)鑒定結(jié)果；熒光染料RT-PCR通過(guò)向RT-PCR反應(yīng)體系中添加非特異性的熒光染料，可以在反應(yīng)過(guò)程中監(jiān)測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的生成量，但需要做熔解曲線分析來(lái)確定反應(yīng)的特異性；熒光探針RT-PCR通過(guò)特異性的熒光探針與引物，可實(shí)時(shí)監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程中特異性產(chǎn)物的變化，并且可以實(shí)現(xiàn)同一管中多個(gè)基因的檢測(cè)（多重），特異性較好，假陽(yáng)性率低，檢測(cè)靈敏度可達(dá)10～100拷貝/反應(yīng)，可用于取代普通RT-PCR。