人胎盤部位滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系的建立及其鑒定

劉齊雨，李 可，胥 婧，黃云柯，趙晨燕，羅建民，李桂玲，康 玉，徐叢劍

1.復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，上海 200011；

2.上海市女性生殖內(nèi)分泌相關(guān)疾病重點實驗室，上海 200011；

3.復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院病理科，上海 200011；

4.復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)影像研究中心，上海 200032

人胎盤部位滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系的建立及其鑒定

劉齊雨1,2，李 可1,2，胥 婧1,2，黃云柯1,2，趙晨燕3，羅建民4，李桂玲1,2，康 玉1,2，徐叢劍1,2

1.復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，上海 200011；

2.上海市女性生殖內(nèi)分泌相關(guān)疾病重點實驗室，上海 200011；

3.復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院病理科，上海 200011；

4.復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)影像研究中心，上海 200032

背景與目的：胎盤部位滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤(placental site trophoblastic tumor，PSTT)是一種特殊類型的妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤。該研究旨在建立人PSTT細(xì)胞系，鑒定其基本特性。方法：通過手術(shù)切除的PSTT組織標(biāo)本原代培養(yǎng)，純化并傳代，建立人PSTT細(xì)胞系。鑒定方法包括：觀察細(xì)胞形態(tài)，CCK-8法繪制細(xì)胞生長曲線，進(jìn)行染色體核型分析，細(xì)胞與腫瘤組織短串重復(fù)序列(short tandem repeat，STR)分析，以及免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果：建立穩(wěn)定傳代的人PSTT細(xì)胞系PSTT-1。PSTT-1細(xì)胞單層貼壁生長，失去接觸抑制性，呈多突起的紡錘形結(jié)構(gòu)。體外培養(yǎng)生長良好，每5 d傳代1次，目前已傳至30余代。染色體核型分析結(jié)果為正常女性核型：46，XX。PSTT-1與腫瘤組織STR分析結(jié)果高度匹配。PSTT-1細(xì)胞表達(dá)β-catenin、CD146、人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin，hCG)、人胎盤生乳素(human placental lactogen，hPL)和Muc4。結(jié)論：該研究成功建立人PSTT細(xì)胞系PSTT-1，為PSTT的研究提供了體外實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

PSTT；細(xì)胞系；原代培養(yǎng)

胎盤部位滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤(placental site trophoblastic tumor，PSTT)起源于胎盤種植部位的中間型滋養(yǎng)細(xì)胞(intermediate trophoblast，IT)，是一種特殊類型的妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤，占妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的1%～2%［1-3］。

多數(shù)PSTT病灶局限于子宮，預(yù)后較好；但是有10%～20%的患者會發(fā)生轉(zhuǎn)移，一旦轉(zhuǎn)移，即使患者接受手術(shù)和聯(lián)合化療，預(yù)后仍會不良。PSTT患者10年生存率為49%，復(fù)發(fā)患者的5年生存率不足30%［4-5］。

PSTT對化療的敏感性低于絨毛膜癌，子宮切除術(shù)是主要的治療方式［6］。PSTT多見于育齡期，子宮切除術(shù)將導(dǎo)致育齡期患者失去自然懷孕的能力?；焺t作為術(shù)后的輔助治療，臨床上多采用聯(lián)合化療方案，但是PSTT的最佳化療方案尚不明確［5,7］。

因PSTT臨床相對少見，目前的文獻(xiàn)報道多為小樣本或個例報道，基礎(chǔ)研究進(jìn)展緩慢。腫瘤細(xì)胞系的建立在腫瘤基礎(chǔ)研究中具有重要作用，但是目前世界范圍內(nèi)幾個權(quán)威細(xì)胞庫，如美國典型菌種保藏中心、德國微生物菌種保藏中心及日本理化學(xué)研究所等，均沒有PSTT細(xì)胞系。本研究通過PSTT組織原代培養(yǎng)建立可穩(wěn)定傳代的人PSTT細(xì)胞系PSTT-1，并鑒定其生物學(xué)特性，為PSTT的研究提供體外實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

1 材料和方法

1.1 組織來源

組織來源于2014年9月復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院收治的1例PSTT患者經(jīng)全子宮切除術(shù)后的組織標(biāo)本?；颊吲裕?9歲，術(shù)后病理診斷：子宮PSTT，浸潤子宮深肌層；免疫組織化學(xué)檢測：AE1/AE3(+)，hCG(散在+)，hPL(++)，Inhibin-α(+)。腫瘤組織H-E染色可見特征性的中間型滋養(yǎng)細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞形態(tài)相對一致，浸潤肌層和血管(圖1)。

圖 1 PSTT組織病理照片F(xiàn)ig. 1 Pathology photomicrograph of PSTT tissue

1.2 主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自美國Sigma公司，HEPES緩沖液、丙酮酸鈉溶液、青霉素-鏈霉素和胰酶細(xì)胞消化液購自美國Gibco公司，CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所，DNA提取試劑盒購自美國Axygen公司，β-catenin抗體(ab32572)購自美國Abcam公司，CD146抗體(GTX108777)購自美國GeneTex公司，hCG抗體(ab9376)、hPL抗體(ab15554)和Muc4抗體(ab150381)購自美國Abcam。

1.3 原代細(xì)胞培養(yǎng)及建系

取新鮮手術(shù)切除的腫瘤組織1 cm3浸入無菌Hanks溶液清洗，去除結(jié)締組織和壞死組織，剪成約1 mm3大小的小塊。將組織塊均勻接種于T25培養(yǎng)瓶瓶壁，靜置培養(yǎng)，每3 d半量換液1次，接種約3周后觀察直至細(xì)胞從組織塊長出。接種約7周后傳第1代，用0.25%胰酶消化，將細(xì)胞懸液接種于1個培養(yǎng)瓶中(培液不含血清)靜置15～20 min，在倒置相差顯微鏡下觀察，見部分細(xì)胞貼壁，將細(xì)胞懸液倒入另1個培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。下次傳代時再按上述方法處理，重復(fù)3～5次，可使腫瘤細(xì)胞與成纖維細(xì)胞完全分離。

當(dāng)細(xì)胞布滿瓶底時，吸除原瓶中的舊培養(yǎng)液，用PBS緩沖液漂洗1遍，用0.25%胰酶消化，按1∶3的比例傳代，目前已傳至30余代。體外常規(guī)培養(yǎng)條件為含10%FBS、1%丙酮酸鈉、1%L-谷氨酰胺、1%HEPES及1%雙抗的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的溫箱中培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞生長曲線

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，胰酶消化后調(diào)整細(xì)胞懸液密度為2×104個/mL，混勻后按0.1 mL/孔接種于96孔板，每3孔為1組，共7組。接種后連續(xù)6 d在同一時間加入CCK-8試劑反應(yīng)4 h，用酶標(biāo)儀測定在450 nm波長處的吸光度(D)值。以時間為橫軸，D相對值(以最后1天為100%)為縱軸，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.5 染色體核型分析

取對數(shù)生長期細(xì)胞，用0.25 μg/mL秋水仙素處理6 h，37 ℃過夜。采集分裂中期細(xì)胞，甲醇-冰醋酸(3∶1)固定處理。標(biāo)本經(jīng)胰酶消化處理后，用Giemsa染液染色，于顯微鏡下觀察計數(shù)。選取分散良好，染色適中的分裂相進(jìn)行核型分析。

1.6 短串重復(fù)序列(short tandem repeat，STR)分析

用Axygen-DNA抽提試劑盒提取PSTT-1細(xì)胞與PSTT腫瘤組織DNA，PCR擴增。共選取20個位點(包括性別基因)：D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、VWA、TH01、AMEL、TPOX、CSF1PO、D12S391、FGA、D2S1338、D21S11、D18S51、D8S1179、D3S1358、D6S1043、PENTAE、D19S433和PENTA，用ABI 3730XL型遺傳分析儀對STR位點進(jìn)行檢測。用一致位點數(shù)目除以總檢測位點數(shù)目，取百分?jǐn)?shù)即為相似度。

1.7 免疫組織化學(xué)染色

將單克隆PSTT-1細(xì)胞用4%甲醛溶液固定，石蠟包埋切片。切片常規(guī)二甲苯脫蠟、乙醇水化。加入檸檬酸鈉緩沖液(pH為6.0)95 ℃加熱12 min，緩慢冷卻至室溫。采用0.3%H2O2-甲醇溶液37 ℃溫育15 min，加入10%牛血清蛋白溶液封閉60 min。加入稀釋后的一抗(β-catenin 1∶200、CD146 1∶400、hCG 1∶200、hPL 1∶200、Muc4 1∶100)，4 ℃過夜。加入HRP標(biāo)記的二抗，于37 ℃溫育90 min。DAB顯色1～5 min后，用自來水沖洗15 min終止反應(yīng)，然后依次進(jìn)行蘇木精復(fù)染、脫水、透化、封片。以TBS取代一抗作為陰性對照。

檢測結(jié)果根據(jù)染色強度和陽性細(xì)胞百分比綜合評定。染色強度：陰性為0分，弱陽性為1分，中等陽性為2分，強陽性為3分；陽性細(xì)胞百分比：無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞數(shù)1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，大于75%為4分。二者相乘，0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為中度陽性(++)，9～12分為強陽性(+++)。隨機選取5個高倍視野(×400)觀察評分，取其均值。

2 結(jié) 果

2.1 在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)

通過腫瘤組織塊法原代培養(yǎng)，反復(fù)貼壁法去除成纖維細(xì)胞，建立可穩(wěn)定傳代的人PSTT細(xì)胞系，命名為PSTT-1。在倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞單層貼壁生長，失去接觸抑制，細(xì)胞體較大，呈多突起的星形或紡錘形結(jié)構(gòu)，形態(tài)不均一(圖2)。

2.2 CCK-8法觀察細(xì)胞生長曲線

PSTT-1體外培養(yǎng)生長良好，每5 d傳代1次，能夠連續(xù)穩(wěn)定傳代，目前已傳至30余代。細(xì)胞生長曲線見圖3。凍存后復(fù)蘇，細(xì)胞生長良好。

2.3 G顯帶觀察染色體核型

隨機計數(shù)21個細(xì)胞，染色體數(shù)目均為46條。G顯帶分析2個細(xì)胞核型，為正常女性核型：46，XX(圖4)，在此顯帶水平上未見明顯染色體異常。

2.4 STR分析PSTT-1細(xì)胞來源

PSTT-1細(xì)胞與PSTT腫瘤組織STR分析匹配度高度一致(表1)。細(xì)胞系相比于腫瘤組織位點相似度達(dá)100%(相似度大于等于80%認(rèn)為同源［8］)，提示PSTT-1來源于腫瘤組織。

2.5 免疫組織化學(xué)染色

圖 2 PSTT-1細(xì)胞形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of PSTT-1

PSTT-1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，β-catenin主要在細(xì)胞膜表達(dá)，呈強陽性(+++)；CD146主要在細(xì)胞膜表達(dá)，呈中度陽性(++)；hCG在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜表達(dá)，呈中度陽性(++)；hPL在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜表達(dá)，呈強陽性(+++)；Muc4主要在細(xì)胞膜表達(dá)，呈中度陽性(++)。符合中間型滋養(yǎng)細(xì)胞特征(圖5)。

圖 3 PSTT-1細(xì)胞生長曲線Fig. 3 Growth curve of PSTT-1

圖 4 PSTT-1染色體核型分析Fig. 4 Chromosomal karyotype analysis of PSTT-1

圖 5 PSTT-1細(xì)胞系表達(dá)β-catenin、CD146、hCG、hPL和Muc4Fig. 5 Expression of β-catenin, CD146, hCG, hPL and Muc4 in PSTT-1 cell line

表 1 PSTT-1與腫瘤組織STR分析Tab. 1 STR pro filing of PSTT-1 cell line and PSTT tissue

3 討 論

本研究通過手術(shù)切除的PSTT組織標(biāo)本原代培養(yǎng)，純化并傳代，建立人PSTT細(xì)胞系PSTT-1。PSTT-1具有以下生物學(xué)特征：

① 單層貼壁生長，失去接觸抑制，形態(tài)不均一，呈多突起的星形或紡錘形結(jié)構(gòu)；② 體外培養(yǎng)生長良好，每5 d傳代1次，能夠連續(xù)穩(wěn)定傳代，目前已傳至30余代；③ 染色體核型分析結(jié)果為正常女性核型：46，XX；④ PSTT-1與腫瘤組織STR分析結(jié)果高度匹配，提示PSTT-1來源于腫瘤組織；⑤ PSTT-1細(xì)胞表達(dá)β-catenin、CD146、hCG、hPL和Muc4。

hCG和hPL是教科書上經(jīng)典的滋養(yǎng)細(xì)胞標(biāo)志物［9］。而滋養(yǎng)細(xì)胞又分為3種不同功能的亞型：細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞、合體滋養(yǎng)細(xì)胞和中間型滋養(yǎng)細(xì)胞，3種細(xì)胞亞型的鑒別對臨床診斷有重要意義。近年來已有一些較公認(rèn)的鑒別診斷標(biāo)志物：中間型滋養(yǎng)細(xì)胞特異性表達(dá)CD146［2,10］；β-catenin在中間型滋養(yǎng)細(xì)胞為細(xì)胞膜表達(dá)，而在細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞為細(xì)胞核表達(dá)［11］；中間型滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)Muc4［11］。PSTT-1的鑒定結(jié)果與文獻(xiàn)報道一致，符合中間型滋養(yǎng)細(xì)胞的特征。

因PSTT臨床相對少見，相關(guān)基礎(chǔ)研究進(jìn)展緩慢。目前僅有1例關(guān)于PSTT細(xì)胞系建立的報道，Shih等［12］于2002年成功建立1例PSTT細(xì)胞系IST-2，該團(tuán)隊利用IST-2探索了MAPK通路在PSTT侵襲和遷移中的作用。

化療是腫瘤的主要治療手段之一，特別是對于進(jìn)展期腫瘤，但是其療效受限于腫瘤的耐藥性［13］。化療耐藥一直是腫瘤基礎(chǔ)研究的熱點，腫瘤的耐藥機制復(fù)雜，包括藥物外排增加、藥物靶點突變、DNA損傷修復(fù)及細(xì)胞凋亡逃避等［14］。但是PSTT的化療耐藥問題尚未得到足夠的重視，目前尚不清楚PSTT具體對何種化療藥物耐藥，也不了解其耐藥機制。本研究建立的PSTT細(xì)胞系，能夠為PSTT的化療敏感性研究提供體外實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

PSTT多見于育齡期女性，近年來，隨著生活質(zhì)量的提高和二胎政策的開放，生育功能的保留成為治療中需要特別考慮的問題。目前臨床上對PSTT保留生育功能的治療還處在探索階段，對于有強烈保留生育功能意愿、病灶局限且無不良預(yù)后因素的患者，可以考慮行保守性手術(shù)；病灶彌漫者不適用［15-17］。但是考慮到轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)患者的預(yù)后不佳，PSTT保留生育功能的治療仍有爭議。通過PSTT基礎(chǔ)研究如果能夠找到逆轉(zhuǎn)化療耐藥的靶點，將有助于臨床上開展保留生育功能的治療。

PSTT是妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤中一種特殊的類型，目前對PSTT的認(rèn)識還非常有限，以致臨床對轉(zhuǎn)移性患者處理棘手，對保留生育功能的治療仍需探索。本研究建立的細(xì)胞系為PSTT的病因?qū)W、轉(zhuǎn)移機制及耐藥機制等基礎(chǔ)研究提供了體外實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

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Establishment and identi fication of human placental site trophoblastic tumor cell line

LIU Qiyu1,2, LI Ke1,2, XU Jing1,2, HUANG Yunke1,2, ZHAO Chenyan3, LUO Jianmin4, LI Guiling1,2, KANG Yu1,2, XU Congjian1,2
(1. Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Obstetrics and Gynecology Hospital of Fudan University, Shanghai 200011, China; 2. Shanghai Key Laboratory of Female Reproductive Endocrine Related Diseases, Shanghai 200011, China; 3. Department of Pathology, Obstetrics and Gynecology Hospital of Fudan University, Shanghai 200011, China; 4. Center for Biomedical Imaging, Fudan University, Shanghai 200032, China)

Correspondence to: KANG Yu E-mail: yukang@fudan.edu.cn

Background and purpose: Placental site trophoblastic tumor (PSTT) is a special type of gestational trophoblastic tumor. It remains no general cell line for PSTT. The aim of this study was to establish and identify a human PSTT cell line. Methods: In this study, a PSTT cell line (PSTT-1) was derived from primary culture of a surgically resected PSTT tissue. We further identi fied the basic characteristics of PSTT-1, including cell morphology, cell growth curve, karyotype analysis, short tandem repeat (STR) profiling of PSTT-1 and its parental tumor, and immunohistochemistry analysis. Results: A human PSTT cell line named PSTT-1 was successfully established. PSTT-1 formed a monolayer growth and lost contact inhibition, and exhibited a pleomorphic morphology. PSTT-1 cells grew actively in vitro. PSTT-1 was passaged every 5 days, and maintained in culture for more than 30 passages. Karyotyping of PSTT-1 revealed normal female karyotype: 46, XX. STR pro filing of PSTT-1 was nearly identical to itsparental tumor. Immunohistochemistry analysis of PSTT-1 revealed expression of β-catenin, CD146, human chorionic gonadotropin (hCG), human placental lactogen (hPL) and Muc4. Conclusion: This study established a PSTT cell line, which could be useful for further research on PSTT.

Placental site trophoblastic tumor; Cell line; Primary culture

10.19401/j.cnki.1007-3639.2017.07.001

R737.33

A

1007-3639(2017)07-0521-06

2017-01-04

2017-03-12）

國家自然科學(xué)基金(81472423)；上海市科委國際合作項目(14430723000)。

康 玉 E-mail：yukang@fudan.edu.cn