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    擬南芥冷害脅迫下基因表達(dá)譜的統(tǒng)合分析

    2013-07-12 06:43:56徐兆華吳為人
    關(guān)鍵詞:基序擬南芥芯片

    徐兆華,吳為人,2

    (1 浙江大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院,浙江 杭州310058;2 福建農(nóng)林大學(xué) 作物科學(xué)學(xué)院,福建 福州350002)

    基因芯片能夠在基因組水平上分析基因表達(dá)譜.檢測(cè)不同條件下的差異表達(dá)基因(Differentially expressed gene,DEG)是基因芯片技術(shù)的一個(gè)主要應(yīng)用方向[1-2].近年來(lái),隨著基因芯片等表達(dá)譜分析技術(shù)的出現(xiàn),大量的冷調(diào)控基因被發(fā)現(xiàn)[4-5].但是通過(guò)比較發(fā)現(xiàn),不同試驗(yàn)得到的DEG 數(shù)量從幾百到數(shù)千不等,結(jié)果差異很大[6-9].造成這種低重現(xiàn)率的重要原因之一就是試驗(yàn)中所用的樣本(重復(fù)芯片)數(shù)量不足,從而降低了統(tǒng)計(jì)功效[10].

    統(tǒng)合分析(Meta-analysis)是一種經(jīng)典的統(tǒng)計(jì)分析方法.該方法的特點(diǎn)是將關(guān)于同一科學(xué)問(wèn)題的不同研究當(dāng)中可以合并的信息整合起來(lái)進(jìn)行分析,以此取得更加可靠的結(jié)果[11].近年來(lái),統(tǒng)合分析被應(yīng)用于芯片試驗(yàn)數(shù)據(jù)的整合分析[12-14].與單個(gè)試驗(yàn)相比,將多個(gè)實(shí)驗(yàn)室來(lái)源的數(shù)據(jù)合并起來(lái)可以大大增加統(tǒng)計(jì)分析的樣本量,使得分析結(jié)果更加可靠有效..

    迄今為止,有關(guān)基因芯片數(shù)據(jù)的統(tǒng)合分析多集中在方法研究,實(shí)際應(yīng)用的研究還很少.本文利用SAM 軟件對(duì)來(lái)自4 個(gè)不同實(shí)驗(yàn)室的擬南芥冷脅迫處理芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行了統(tǒng)合分析,對(duì)基于SAM 的統(tǒng)合分析的可行性和有效性及其實(shí)際應(yīng)用進(jìn)行了探索.研究結(jié)果表明,統(tǒng)合分析能夠比單獨(dú)分析檢測(cè)出更多可靠的DEG,并能檢測(cè)出一批單獨(dú)分析沒(méi)有檢測(cè)到的DEG,為統(tǒng)合分析的實(shí)際應(yīng)用提供一個(gè)范例.

    1 材料與方法

    1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

    本研究中所用的數(shù)據(jù)是從數(shù)據(jù)庫(kù)GEO 和NASCArrays 下載得到,試驗(yàn)編號(hào)分別為GSE5535、GSE5620、GSE5621、GSE6177 和NASCARRAY-404.其中,GSE5620 是GSE5621 的對(duì)照試驗(yàn),兩者組成1套試驗(yàn)數(shù)據(jù).這樣,本研究所用數(shù)據(jù)總共包括4 套與擬南芥冷脅迫處理有關(guān)的芯片試驗(yàn)數(shù)據(jù).這4 個(gè)試驗(yàn)中,總RNA 均來(lái)自植株的地上部分.所用芯片都是Affymetrix 第1 代擬南芥基因組芯片,其中包含22 746個(gè)擬南芥基因.每個(gè)試驗(yàn)中都有1 個(gè)共同的處理,即4 ℃條件下處理24 h.將4 個(gè)試驗(yàn)中由這一共同處理得到的試驗(yàn)數(shù)據(jù)分別命名為D1、D2、D3 和D4.其中,D1 來(lái)自GSE5535,D2 來(lái)自GSE5620 和GSE5621,D3 來(lái)自GSE6177,D4 來(lái)自NASCARRAY-404.D1、D2 和D3 各包含4 張芯片數(shù)據(jù),對(duì)照和處理各2 張;D4 則包含6 張芯片數(shù)據(jù),對(duì)照和處理各3張.每個(gè)基因表達(dá)強(qiáng)度值都由一組探針合并計(jì)算而來(lái),每個(gè)值都有一個(gè)標(biāo)示(Call)值來(lái)表示其檢測(cè)質(zhì)量,分別為出現(xiàn)(Present)、臨界(Marginal)和缺失(Absent).

    1.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理

    首先對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理和篩選.用于單獨(dú)分析的數(shù)據(jù)先做以2 為底的對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換,然后進(jìn)行篩選.篩選的原則是如果某個(gè)基因在1 個(gè)試驗(yàn)75%以上的芯片(即在D1、D2 和D3 中的3 張或3 張以上芯片,D4 中的5 張或5 張以上芯片)中的表達(dá)數(shù)據(jù)Call 值為Present 或Marginal,則該基因的數(shù)據(jù)保留下來(lái)做后續(xù)的分析.

    將來(lái)自4 套試驗(yàn)共18 張芯片的數(shù)據(jù)合并起來(lái)組成一個(gè)大的數(shù)據(jù)集用于統(tǒng)合分析,命名為Dm.用DNA-chip analyzer(dChip)軟件[15]對(duì)合并的數(shù)據(jù)進(jìn)行重新的標(biāo)準(zhǔn)化處理.標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)做以2 為底的對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化,再用與單獨(dú)試驗(yàn)同樣的篩選原則進(jìn)行篩選.經(jīng)過(guò)以上篩選后,Call 值為Absent 的數(shù)據(jù)被剔除,作為缺失數(shù)據(jù)處理.

    1.3 差異表達(dá)基因的檢測(cè)

    SAM(Significance analysis of microarrays)是目前最流行的統(tǒng)計(jì)分析軟件之一,主要用于DEG 的檢測(cè)[16].該方法采用經(jīng)驗(yàn)分布來(lái)估計(jì)誤差而不需要對(duì)誤差分布進(jìn)行假設(shè),能夠克服不同來(lái)源數(shù)據(jù)之間的異質(zhì)性問(wèn)題.本研究采用SAM 軟件進(jìn)行DEG 的檢測(cè).參數(shù)選擇如下:分析模式選用“Two class unpaired”;顯著性水平FDR 閾值設(shè)為0.01;缺失數(shù)據(jù)由SAM 自帶的軟件處理;其他參數(shù)采取默認(rèn)設(shè)置.

    1.4 基因本體(Gene ontology,GO)的分析

    采用基于網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器的EasyGO 軟件[17]對(duì)統(tǒng)合分析檢測(cè)到的DEG 進(jìn)行GO 富集分析,上調(diào)基因(Upregulated gene,URG)和下調(diào)基因(Down-regulated gene,DRG)分開(kāi)來(lái)分析.軟件的參數(shù)選擇如下:模型選用卡方檢驗(yàn);顯著性水平用假陽(yáng)性率(False discovery rate,F(xiàn)DR)來(lái)表示,閾值設(shè)為0.01;其他參數(shù)采取默認(rèn)設(shè)置.

    1.5 啟動(dòng)子基序的分析

    利用一個(gè)基于網(wǎng)絡(luò)的分析工具Athena[18]中的一個(gè)模塊Analysis suite 來(lái)分析DEG 啟動(dòng)子中的順式作用元件.

    2 結(jié)果與分析

    2.1 差異表達(dá)基因的檢測(cè)

    經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)的預(yù)處理和篩選,D1、D2、D3、D4 和Dm 分別保留了13 214、13 243、13 499、13 218 和12 791 個(gè)基因用以檢測(cè)DEG(表1).通過(guò)比較發(fā)現(xiàn),D1、D2、D3 和D4 中保留的基因不但在數(shù)量上接近,而且兩兩之間重疊的基因都不低于92%.說(shuō)明4 套不同來(lái)源的試驗(yàn)彼此之間在基因表達(dá)上還是比較穩(wěn)定的.

    本研究從4 個(gè)單獨(dú)試驗(yàn)中總共檢測(cè)到10 684 個(gè)DEG,其中包括3 816 個(gè)URG 和6 868 個(gè)DRG.然而,單獨(dú)試驗(yàn)之間DEG 的數(shù)量卻差異很大.DEG 的總數(shù)介于707~7719,其中URG 的數(shù)量在483~2 678,DRG 的數(shù)量在224~5 491(表1).

    表1 單獨(dú)和統(tǒng)合分析檢測(cè)的DEGTab.1 Numbers of DEGs detected in the individual and the mixed datasets

    能夠被多個(gè)試驗(yàn)共同檢測(cè)到的DEG 隨著試驗(yàn)數(shù)量的增加迅速減少(表2).結(jié)果表明,不同試驗(yàn)得到的DEG,無(wú)論是數(shù)量上還是基因本身都存在非常顯著的差異.可以將4 個(gè)單獨(dú)試驗(yàn)中檢測(cè)到的所有DEG 分為2 組:一組稱為“較可靠”(More reliable)的DEG(簡(jiǎn)稱mrDEG),它們至少被2 個(gè)或2 個(gè)以上單獨(dú)試驗(yàn)檢測(cè)到;另一組稱為“較不可靠”(Less reliable)的DEG(簡(jiǎn)稱lrDEG),它們只被1 個(gè)單獨(dú)試驗(yàn)檢測(cè)到.

    統(tǒng)合分析從Dm 中分別檢測(cè)到3 134 個(gè)URG 和2 983 個(gè)DRG(表1).盡管統(tǒng)合分析檢測(cè)到的URG和DRG 比單獨(dú)試驗(yàn)的總和要少,但URG 的數(shù)量是mrDEG 中URG 的兩倍,DRG 的數(shù)量也幾乎與mrDEG 中相當(dāng)(表2).統(tǒng)和分析檢測(cè)到了25.8%的lrDEG,在URG 當(dāng)中尤其明顯,比例達(dá)到48.9%(表2).在統(tǒng)合分析檢測(cè)到的DEG 中,有553 個(gè)基因沒(méi)有被任何單獨(dú)試驗(yàn)檢測(cè)到,其中包括521 個(gè)URG 和32 個(gè)DRG,占其總數(shù)的9.0%.以上結(jié)果表明,統(tǒng)合分析不但能夠非常高效地識(shí)別mrDEG,而且還能夠有效地鑒別不少lrDEG,甚至能夠發(fā)現(xiàn)一些不能被單獨(dú)試驗(yàn)檢測(cè)到的DEG.為了證實(shí)統(tǒng)合分析檢測(cè)出的DEG 的可靠性,本研究對(duì)統(tǒng)合分析識(shí)別的DEG 進(jìn)行了基因本體(GO)和啟動(dòng)子基序分析.

    表2 多個(gè)試驗(yàn)檢測(cè)的DEGsTab.2 Numbers of DEGs simultaneously detected in different analyses 個(gè)

    2.2 GO 分析

    GO 包括3 方面的內(nèi)容:生物學(xué)過(guò)程(Biological process,BP)、分子功能(Molecular function,MF)和細(xì)胞組分(Cellular component,CC)[19].由于BP 能夠比較直觀地評(píng)價(jià)DEG 的合理性,所以本文的分析就集中在BP 上,特別是與各種應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)的GO 條目(Term).將統(tǒng)合分析檢測(cè)的URG 和DRG 分別進(jìn)行GO 分析,結(jié)果見(jiàn)表3.

    從表3 可以看出,URG 在BP 中的富集條目,有1個(gè)直接與冷脅迫有關(guān),共包含69 個(gè)基因.由于本研究所選的4 個(gè)試驗(yàn)都是研究擬南芥在冷脅迫條件下的基因表達(dá)譜,因此這個(gè)結(jié)果是符合預(yù)期的.另外,有研究[20]表明,不同的信號(hào)反應(yīng)途徑之間可能存在著一些共有的集合,使得植物不同的脅迫反應(yīng)之間存在著一定的交叉現(xiàn)象.

    通常情況下,大多數(shù)植物都生長(zhǎng)在晝夜交替的光照和溫度條件下.有研究表明,一些受晝夜節(jié)律調(diào)控的基因也是與冷脅迫反應(yīng)有關(guān)的[21].在富集的條目中,除了與應(yīng)激或脅迫有關(guān)外,還有與晝夜節(jié)律和繁殖等有關(guān)的條目在URG 中得到富集.

    分析表明由統(tǒng)合分析檢測(cè)出的553 個(gè)DEG 中確實(shí)富集了許多與各種外界脅迫反應(yīng)有關(guān)的基因,包括6 個(gè)直接與冷脅迫反應(yīng)相關(guān)的基因:AT4G01370[22-23]、AT1G31812[24]、AT5G12250[25]、AT3G49910[26]、AT1G17190[27-29]、AT4G36930[30-31],這幾個(gè)基因在單獨(dú)試驗(yàn)的結(jié)果中都沒(méi)有被檢測(cè)到,可見(jiàn)統(tǒng)合分析彌補(bǔ)了單獨(dú)分析的不足.

    2.3 啟動(dòng)子基序分析

    對(duì)統(tǒng)合分析檢測(cè)的DEG 的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行了基序的分析(表4).總共有16 個(gè)基序在這些DEG 的啟動(dòng)子區(qū)域得到富集.其中,URG 的啟動(dòng)子區(qū)域有13 個(gè)基序出現(xiàn)富集,DRG 的啟動(dòng)子區(qū)域有6 個(gè)基序出現(xiàn)富集.其中,有3 個(gè)基序在URG 和DRG 的啟動(dòng)子區(qū)域都出現(xiàn)富集.

    表3 統(tǒng)合分析檢測(cè)的DEG 的GO 富集分析1)Tab.3 Gene ontology enrichment in the DEGs identified by meta-analysis

    表4 統(tǒng)合分析檢測(cè)的DEG 的啟動(dòng)子基序富集分析1)Tab.4 Promoter motif enrichment in DEGs detected by meta-analysis

    這16 個(gè)基序基本可以分成3 組.第1 組包括3個(gè)基序,即“DRE core motif”、“DREB1A/CBF3 motif”和“LTRE promoter motif”.這3 個(gè)基序的序列中都含有1 個(gè)共同的核心序列,即“CCGAC”.有研究表明,這個(gè)核心序列存在于大量的受冷脅迫調(diào)控的植物基因的啟動(dòng)子區(qū)域[32].

    第2 組由“ABFs binding site motif”、“ABRE binding site motif”、“ABRE-like binding site motif”、“ACGTABREMOTIFA2OSEM”和“GADOWNAT”5 個(gè)基序組成.它們都是與植物的脫落酸(Abscisic acid,ABA)反應(yīng)有關(guān)的基序.ABA 在植物應(yīng)對(duì)干旱與高鹽脅迫以及種子的成熟與休眠當(dāng)中扮演著重要的角色[33].內(nèi)源ABA 的含量在植物遭遇冷脅迫時(shí)會(huì)持續(xù)增加,而且外源ABA 的應(yīng)用還會(huì)提高植物對(duì)冷害的忍耐能力[34].這些都說(shuō)明ABA 在植物應(yīng)對(duì)冷害威脅的過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用.

    第3 組是包含基序最多的一個(gè)組,共有“CACGTGMOTIF”、“EveningElement promoter motif”、“GBF1/2/3 BS in ADH1”、“GBOXLERBCS”、“Ibox promoter motif”、“TELO-box promoter motif”、“TGA1 binding site motif”和“UPRMOTIFIAT”8 個(gè)基序.這些基序都受到光的調(diào)控.已知在包括擬南芥在內(nèi)的許多植物中,光照能提高其對(duì)冷脅迫的忍耐能力[35-36].植物光敏色素B 是光信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的一個(gè)光受體,它通過(guò)一個(gè)順式作用元件“CRT/DRE”來(lái)激活低溫誘導(dǎo)下的基因表達(dá)譜[37].這說(shuō)明,在光反應(yīng)和冷脅迫反應(yīng)之間也存在著一定的交叉.以上3 組啟動(dòng)子基序都是與植物應(yīng)對(duì)冷脅迫有關(guān)的.再一次證明,統(tǒng)合分析識(shí)別的DEG 是與冷脅迫有關(guān)的,其結(jié)果是可靠的.

    3 討論與結(jié)論

    在利用基因芯片進(jìn)行各種研究時(shí),各個(gè)試驗(yàn)之間DEG 的重現(xiàn)率往往較低.這是一個(gè)始終困擾著學(xué)者們的難題,它表明許多從芯片試驗(yàn)中檢測(cè)到的DEG 可靠性都存在著一定程度的問(wèn)題[38].統(tǒng)合分析通過(guò)整合來(lái)自多個(gè)試驗(yàn)的有用信息來(lái)增加試驗(yàn)結(jié)果的可靠性,為提高DEG 的檢測(cè)效率提供了一條可行之路.本研究的結(jié)果表明,統(tǒng)合分析的應(yīng)用顯著地提高了DEG 檢測(cè)的可靠性.

    此外,統(tǒng)合分析還檢測(cè)到了553 個(gè)未被單獨(dú)分析檢測(cè)到的DEG.通常認(rèn)為,一個(gè)基因在統(tǒng)合分析結(jié)果中是否表現(xiàn)出差異顯著取決于它在各個(gè)試驗(yàn)之間的表達(dá)變化的大小(平均效應(yīng))和其表達(dá)行為的一致性[12].平均效應(yīng)越高,表達(dá)越一致,其在統(tǒng)計(jì)分析中的表現(xiàn)越顯著,越有可能被統(tǒng)合分析檢測(cè)出來(lái)[13].因此,上述的553 個(gè)DEG,盡管其對(duì)冷脅迫的反應(yīng)不是很強(qiáng)烈,但它們?cè)? 個(gè)單獨(dú)試驗(yàn)中的差異表達(dá)是一致的,所以能被統(tǒng)合分析檢測(cè)出來(lái),彌補(bǔ)了單獨(dú)分析的不足.這是統(tǒng)合分析的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn).

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