促兔眼藍莓生長菌根真菌的分離與鑒定

趙 磊， 劉 偉， 傅 翔， 單曉笛， 張書祥， 蔣光月， 黃 蓓

(1. 安徽大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 合肥 230601; 2. 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 合肥 230031)

促兔眼藍莓生長菌根真菌的分離與鑒定

趙 磊1， 劉 偉1， 傅 翔1， 單曉笛1， 張書祥1， 蔣光月2， 黃 蓓1

(1. 安徽大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 合肥 230601; 2. 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 合肥 230031)

利用優(yōu)勢菌根真菌提高弱根系兔眼藍莓對營養(yǎng)元素的吸收，促進兔眼藍莓植株的生長。從皖南地區(qū)兔眼藍莓菌根分離得到的9種真菌進行了功能試驗：通過兔眼藍莓幼苗接種試驗，觀察菌根真菌對兔眼藍莓幼苗存活率及株高的影響；盆栽兔眼藍莓植株接種試驗觀察菌根真菌侵染情況，檢測其對兔眼藍莓植株葉片N、P、K及葉綠素含量變化的影響。篩選得到4種對兔眼藍莓生長有顯著促進作用的菌株。利用形態(tài)學(xué)觀察、DNA測序及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析發(fā)現(xiàn)其中3種屬于毛霉屬卷枝毛霉種(Mucorcircinelloides)，其亞種水平有差異，另外1種屬于毛霉屬總狀枝毛霉(Mucorracemosus)，其相似率均大于99%。毛霉屬卷枝毛霉種及總狀枝毛霉種對兔眼藍莓營養(yǎng)元素的吸收和植株的生長具有明顯的促進作用。

兔眼藍莓; 菌根真菌; 接種試驗；ITS序列;分子鑒定

藍莓即越橘(Vacciniumuliginosum) 又名篤斯，野生藍莓被稱為都柿(大小興安嶺、伊春)屬于杜鵑花科(Ericaceae)越桔屬[1]，原產(chǎn)于北美，約有450種。藍莓可分為矮叢、半高叢、高叢和兔眼藍莓四大類。藍莓果實中富含有豐富的熊庶果甙、花青素、黃酮等多種具有抗氧化性能的多酚類生理活性成分，被譽為“漿果之王”[2]。兔眼藍莓的栽培土壤是酸性土壤(pH 4.0～5.0)，根細缺少根毛，接觸面積小，分布淺，吸收能力較弱[3]。自然條件下，菌根真菌能與植物形成互利共生的關(guān)系[4]，因而篩選出有益的菌根真菌能夠促進兔眼藍莓對營養(yǎng)元素的吸收，有助于兔眼藍莓生長和提高果實營養(yǎng)價值，改良兔眼藍莓根系微生物環(huán)境以及增強兔眼藍莓的生長勢和對病蟲害的抵抗能力。

袁繼鑫等對大興安嶺野生藍莓菌根進行研究，觀察到3種類型菌絲體：有隔外生菌絲體、穿梭于細胞間和形成菌絲團的內(nèi)生菌絲[5]。肇瑩等通過形態(tài)觀察結(jié)合18S rRNA測序比對篩選出對藍莓的生長起到明顯促進作用的晶粒鬼傘菌種(Coprinusmicaceus)[6]。藍莓菌根真菌的侵染受到地域環(huán)境的綜合影響，不同地域存在差異性。兔眼藍莓為皖南地區(qū)的主栽品種，該品種生態(tài)適應(yīng)性、長勢和抗病蟲性較強，比較抗旱耐濕熱，但抗寒性較差，而人工改良后的土壤也影響根系對營養(yǎng)成分的吸收，因此篩選出促進兔眼藍莓生長的菌根真菌尤為重要。同時，菌根真菌制劑的使用還能夠降低栽培管理的費用和減少由于農(nóng)藥化肥等導(dǎo)致的環(huán)境污染，實現(xiàn)快速可持續(xù)性發(fā)展。

促兔眼藍莓生長的菌根真菌的分離與鑒定是本課題組擬解決的關(guān)鍵技術(shù)問題。為此，從皖南地區(qū)兔眼藍莓種植密集區(qū)域隨機選點采樣進行根系真菌菌落的培養(yǎng)，通過觀察選出長勢較好的，形態(tài)上存在一定差異的菌落分離培養(yǎng)，得到候選菌株后進行兔眼藍莓苗接種試驗，挑選對生長有效的菌株再進行盆栽兔眼藍莓植株的接種試驗，通過對受試兔眼藍莓植株葉片營養(yǎng)元素、葉綠體含量的測定，篩選出優(yōu)勢菌株，結(jié)合形態(tài)學(xué)進行初步分類鑒定。再利用分子生物學(xué)手段，將提取得到的真菌基因組用ITS通用引物進行PCR擴增，得到的ITS序列進行測序，分析其 rDNA 的ITS序列進行分子鑒定[7-9]。

1 材料與方法

1.1 供試材料

藍莓植株由安徽省蕪湖市無為縣玉泰農(nóng)業(yè)有限公司和安徽省蕪湖市南陵縣泓源農(nóng)業(yè)戴工山藍莓基地提供，藍莓組培苗由合肥師范學(xué)院藍莓種苗培育基地提供。

量子共振檢測儀為深圳同康公司生產(chǎn)。

1.2 菌根真菌的分離及觀察

將根剪成3～4 cm。采用75%酒精、75%酒精和0.1%升汞結(jié)合的表面滅菌。選取幼根為分離材料，在無菌條件下再剪成0.5 cm根段，選用PDA培養(yǎng)基[10]，每個培養(yǎng)皿中放置5個根段。待菌絲從根橫切面發(fā)出，挑取真菌菌絲，轉(zhuǎn)接于新的PDA培養(yǎng)基上，繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接幾次直至獲得純化菌株。純化后的菌株接種于PDA斜面，4℃保藏。

將菌株接種于PDA培養(yǎng)基，25℃下培養(yǎng)。觀察菌落特征，挑取菌絲在光學(xué)顯微鏡觀察真菌的分生孢子、孢子囊、菌絲體等形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.3 藍莓幼苗接種試驗

將已分離純化的菌種轉(zhuǎn)接到新的PDA培養(yǎng)基上， 將其置于生化培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)15 d，備用。將培養(yǎng)土放入121℃高壓蒸汽滅菌20 min，分成80 g等量的小份，倒入無菌10 cm×8 cm×7 cm培養(yǎng)盆中，挖一個深5 cm的3 cm×3 cm的坑，加入25 mL土豆培養(yǎng)液，1 cm×1 cm菌餅2個，將藍莓苗移入。將藍莓幼苗置于通風(fēng)恒溫(25℃)光照環(huán)境培養(yǎng)，澆無菌水。移栽后第30天，統(tǒng)計成活率及幼苗株高。

1.4 藍莓盆栽植株侵染試驗

將候選菌根真菌接種于溫室大棚藍莓植株，3周后采集藍莓植株毛根，先在10%KOH溶液中(60 ℃)浸泡20 h，然后取出根樣用蒸餾水沖洗10 min，再用1%HCl溶液浸泡10 min。將菌根剪成0.5 cm大小的根段，用0.05%臺盤藍溶液(0.15%臺盼藍∶85%乳酸∶甘油1∶1∶1)染色1 h，在甘油中脫色30 min，最后將根樣放在載玻片上進行顯微觀察。

1.5 藍莓植株營養(yǎng)元素相對含量檢測

采集受試植株第3～5片葉子5 g，用量子共振儀進行藍莓葉片N、P、K相對含量檢測。量子共振檢測儀(Quantum resonance spectrometer，QRS)是一種類似核磁共振和紅外光譜分析原理波譜分析儀器，通過測定生物體及物質(zhì)中微高斯至毫高斯級的磁場，能直接從生物體或物質(zhì)收集電磁波進入儀器，通過與儀器內(nèi)置的標準量子共振譜相比較，輸出由負到正的量價值輸出由負到正的量價值[11-13]。檢測單位為安徽省微量元素研究會。

1.6 葉綠素含量檢測

采用多光譜成像系統(tǒng)技術(shù)檢測。采集每張藍莓葉片的圖片，然后提取19個波段的光譜數(shù)據(jù)，再與葉片的實際葉綠素含量聯(lián)合，用偏最小二乘法建立葉綠素校正模型，再提取每張葉片各個像素點的光譜數(shù)據(jù)帶入校正模型，就可以得到各個像素點的葉綠素實際含量值，然后把實際含量返回到葉片上面，在這個可視化過程中只產(chǎn)生葉綠素各個像素點的實際含量[14]。

1.7 菌根真菌的分子鑒定

根據(jù)王旭麗等為真菌rRNA基因的ITS設(shè)計了3對通用引物，即ITS1、ITS4和ITS5。通用引物: ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCG-3′;ITS4: 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，用于PCR對ITS 序列擴增。PCR 反應(yīng)體系為: 95℃預(yù)變性 10 min；95℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸2 min，30個循環(huán)；72℃延伸 5 min。將PCR擴增產(chǎn)物純化后送至滁州通用生物公司進行測序，所得產(chǎn)物序列提交到 NCBI 核酸數(shù)據(jù)庫[15]。菌根真菌rDNA ITS序列輸入GenBank 數(shù)據(jù)庫中，獲得GenBank登錄號[16]，并進行 BLAST 比對，獲得相似性最高的序列進行分析[17]，運用 Clustal W軟件進行多重序列匹配排列( Multiple Alignments) 分析，使用 MEGA 6.06軟件中的Neighbor-joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[18]，以確定該菌株分類學(xué)地位。

2 結(jié)果與分析

我們分別從安徽省蕪湖市南陵縣戴工山和無為縣開城藍莓園基地的兔眼藍莓根部采集根樣，土壤pH 4.5～5.5。將土壤樣品中的兔眼藍莓根樣進行培養(yǎng)，選取長勢良好的菌落進行分離純化培養(yǎng)。

將分離純化得到的9種菌根真菌(A～I)接種于PDA培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)7 d，觀察菌落生長狀態(tài)，然后對其菌落形態(tài)特征進行分類比較。

2.1 菌根真菌對兔眼藍莓苗生長的影響

圖1菌根真菌對兔眼藍莓苗高的影響Fig 1 Effects of mycorrhizal fungi on the height of blueberry of shoots

圖中不同字母表示有顯著性差異(P<0.05)；a表示與CK相比差異極顯著(P<0.01)；b表示與CK相比差異顯著；c表示與CK相比差異不顯著

圖2 菌根真菌對兔眼藍莓幼苗成活率影響Fig 2 Effects of mycorrhizal fungi on the survival rate blueberry shoots

將分離純化的9種菌根真菌接種到兔眼藍莓幼苗根部，接種后30 d，統(tǒng)計兔眼藍莓苗高和成活率。試驗設(shè)置3次重復(fù)，應(yīng)用方差分析(ANOVA)對試驗數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析(SPSS 19.0)，當P<0.05 時，表示差異顯著[19]。

從圖1可看出，B、D、F、H和I組影響效果顯著(P<0.05)，平均增長率均明顯高于對照組。從圖2中發(fā)現(xiàn)，B、F、H 和I菌根真菌對兔眼藍莓幼苗存活率影響與CK組比較差異極顯著(P<0.01)。

結(jié)果顯示，B、F、H和I這4種菌根真菌能夠顯著提高兔眼藍莓幼苗存活率，促進其幼苗生長。

2.2 菌根真菌對兔眼藍莓植株葉片氮磷鉀含量的影響

在菌根真菌對兔眼藍莓幼苗生長試驗的基礎(chǔ)上，進行菌根真菌對1年生大棚兔眼藍莓植株氮磷鉀含量的影響試驗。菌根真菌接種3周后，采集兔眼藍莓葉片，用量子共振儀對兔眼藍莓葉片N、P、K相對含量進行檢測。量子共振檢測儀能夠識別待測物質(zhì)所需要的成分，與儀器內(nèi)置的標準量子共振譜相比較，通過計算機處理后，輸出由負到正的量價值。量價值的大小標志營養(yǎng)水平的高低等，正值越高表示含量或功能性越好。

從表2可以看出，B、F、G、H和I組的氮磷鉀相對含量高于CK組，說明這5種菌根真菌對兔眼藍莓植株氮磷鉀的吸收具有促進作用。

表2 藍莓葉片N、P、K相對含量的檢測

參考值：-1～+6

2.3 菌根真菌對兔眼藍莓植株葉片葉綠素含量的影響

圖3 菌根真菌對兔眼藍莓植株葉片葉綠素含量的影響Fig 3 Effects of mycorrhizal fungi on the chlorophyll content of blueberry plants

垂直色條代表圖像的葉綠素含量

利用多光譜成像系統(tǒng)對侵染菌根真菌的兔眼藍莓植株葉片葉綠素含量進行檢測。多光譜成像系統(tǒng)技術(shù)可以從光譜維和空間維獲取被測目標的信息，可應(yīng)用于作物生長狀態(tài)監(jiān)測和農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)檢測等[20]。通過葉片各個像素點的光譜數(shù)據(jù)與內(nèi)置標準含量的校正模型相比較，可以得到各個像素點的葉綠素實際含量。

圖3檢測結(jié)果顯示，與對照組CK相比較，B、F、H及I 4種菌株對兔眼藍莓植株葉片葉綠素含量提高更顯著。

2.4 菌根真菌對兔眼藍莓植株根侵染的形態(tài)學(xué)觀察

綜合以上功能篩選試驗發(fā)現(xiàn)，B、F、H和I 4種菌根真菌對兔眼藍莓植株生長和葉片營養(yǎng)元素含量提高都有明顯的促進作用。因此，我們選擇這4種菌根真菌進行兔眼藍莓植株根侵染實驗。侵染3周后，利用臺盼藍染色對各個處理組中兔眼藍莓根系進行染色觀察。

從圖4中看出，4種菌株處理組中均觀察到菌根真菌的浸染。其中在B菌浸染的表皮細胞中觀察到胞內(nèi)菌絲團，在外皮層中有平行菌絲，表皮外有根外菌絲；在F菌浸染的表皮細胞中也見到了胞內(nèi)菌絲團、平行菌絲及胞外多根菌絲；在F菌浸染的表皮細胞中發(fā)現(xiàn)了顆粒狀物質(zhì)及根外菌絲，根部浸染的部分整體著色均勻；而在I菌浸染內(nèi)外皮層細胞中見到了較多的胞內(nèi)游走菌絲及平行菌絲。值得注意的是，在B、F和I感染的菌根中均觀察到平行排列的菌絲體，而在H菌中，菌絲體纏繞緊密，螺旋狀排列居多。

圖4 兔眼藍莓菌根真菌回接試驗顯微觀察Fig 4 Microscopic observation of mycorrhizal fungi on the roots of the tested blueberry

2．5 兔眼藍莓菌根真菌的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

篩選出的促兔眼藍莓生長的B、F、H和I優(yōu)勢菌株，通過菌落外觀形態(tài)、菌絲光學(xué)顯微觀察，結(jié)合臺盼藍染色進行菌絲形態(tài)差異性比較，對4種優(yōu)勢菌株進行初步分類鑒定。形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果如圖5所示，其結(jié)構(gòu)特征總結(jié)如見表3。

表3 菌根菌株的形態(tài)學(xué)特征

圖5 菌根真菌菌落和菌絲體結(jié)構(gòu)觀察
Fig 5 Colony and mycelium observation of mycorrhizal fungi

B、F、H、I菌角標：1表示菌落形態(tài)；2表示菌絲形態(tài)；3表示臺盼藍染色后的菌絲形態(tài)

根據(jù)魏景超的真菌鑒定手冊，對4種真菌進行形態(tài)學(xué)分類，初步鑒定為毛霉科真菌。

2.6 菌根真菌的分子鑒定

為了對4種真菌進行種屬的分類，本試驗利用 18S rDNA 測序技術(shù)，從核酸水平對菌株進行分類鑒定，以真菌 rDNA 的 ITS 序列通用引物對供試菌株ITS序列進行擴增。將測序獲得的ITS序列在 GenBank 數(shù)據(jù)庫中進行 BLAST 比對分析，其ITS序列與毛霉屬真菌的部分序列同源性較高，同時對搜索結(jié)果得到的同源性大于 97% 的序列運用 Clustal W 軟件進行序列匹配分析，運用 MEGA6.06軟件中的 Neighbor-joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定供試菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位。

在系統(tǒng)發(fā)育樹分析過程中，我們選出與菌株親緣關(guān)系較近的4株菌株進行序列的相似率分析，其中B菌與Mucorcircinelloidesf.lusitanicus的序列覆蓋度(Query coverage) 達到 100%，最大序列相似度(Max Ident) 達到 100%；F菌與Mucorcircinelloides的序列覆蓋度(Query coverage) 達到 99%，最大序列相似度( Max Ident) 達到 99.5%；H菌與Mucorracemosus的序列覆蓋度(Query coverage) 達到 99%，最大序列相似度(Max Ident) 達到 99.8%；I菌與Mucorcircinelloides的序列覆蓋度(Query coverage) 達到 99%，最大序列相似度(Max Ident) 達到 99.8% 。綜合發(fā)育樹與相似率及形態(tài)學(xué)觀察分析，判斷B菌屬于毛霉屬卷枝毛霉種(Mucorcircinelloidesf.lusitanicus)，F(xiàn)和I菌也歸屬于毛霉屬卷枝毛霉種(Mucorcircinelloides)；H菌屬于毛霉屬總狀枝毛霉種(Mucorracemosus)。由此可以看出菌根真菌B、F、H和I與毛霉屬真菌的親緣關(guān)系較近。

圖6 菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig 6 Phylogenetic tree of mycorrhizal fungi strains

3 討論

藍莓屬于菌根植物，其根系常含有多種類型菌根真菌[21]，國外研究證明菌根真菌既可以促進藍莓對多種營養(yǎng)元素的吸收，也可以在重金屬元素過量時起到拮抗作用[22-23]。本文對安徽省皖南地區(qū)藍莓基地栽培的兔眼藍莓菌根進行采集，分離得到了促進兔眼藍莓植株生長的菌根真菌并鑒定出其在分類學(xué)上的地位。通過對兔眼藍莓植株葉片的N、P、K的相對含量及葉綠色含量的檢測，表明分離得到的菌根真菌能夠促進藍莓植株營養(yǎng)元素的吸收。

兔眼藍莓菌根結(jié)構(gòu)屬于典型的杜鵑類菌根，形成特殊毛根。最外層的表皮層是菌根真菌的侵染場所。在浸染的過程中，首先是菌絲進入表皮細胞進行分支，形成分枝狀或圈狀的胞內(nèi)菌絲團,菌絲在通過這個結(jié)構(gòu)時變細，侵入表皮內(nèi)部。被杜鵑類菌根真菌侵染的細胞每個菌絲群結(jié)構(gòu)都與胞外菌絲直接相連，在根的表面可以觀察到根外菌絲。

通過試驗選出的4個菌株在兔眼藍莓毛根試驗中均觀察到了菌絲體侵染現(xiàn)象，呈現(xiàn)出典型的杜鵑花類菌根特征，其中在B菌、F菌侵染毛根表皮細胞中觀察到胞內(nèi)菌絲團，B、F、I菌侵染毛根表皮細胞中都觀察到了平行排列的菌絲體，而在H菌中，菌絲體纏繞緊密，螺旋狀排列居多。

本試驗首次使用量子共振技術(shù)和多光譜成像系統(tǒng)技術(shù)對兔眼藍莓葉片營養(yǎng)元素和葉綠素含量進行檢測，分析菌根真菌對兔眼藍莓生長的影響，試驗方法更加簡便可信。由于真菌的菌落形態(tài)受環(huán)境因素和培養(yǎng)條件的影響，其形態(tài)學(xué)和培養(yǎng)特征不穩(wěn)定，在培養(yǎng)條件下很難產(chǎn)孢，為真菌的形態(tài)學(xué)鑒定帶來困難[24-25]，且菌根真菌的分布具有地理區(qū)域差異性。因此，通過形態(tài)學(xué)觀察鑒定，結(jié)合分子鑒定手段，可以提高兔眼藍莓菌根真菌鑒定結(jié)果的可靠性。

形態(tài)學(xué)分類結(jié)果顯示，這4種菌屬于毛霉科真菌；分子生物學(xué)鑒定得知B菌歸屬于毛霉屬卷枝毛霉種f.lusitanicus(Mucorcircinelloidesf.lusitanicus)，F(xiàn)和I菌也歸屬為毛霉屬卷枝毛霉種(Mucorcircinelloides)，其亞種分類待定，H菌歸屬于毛霉屬總狀枝毛霉種(Mucorracemosus)。本試驗鑒定得到的兔眼藍莓菌根真菌與其它地區(qū)藍莓的菌根真菌不同，屬于毛霉屬菌根真菌。

4 結(jié)論

課題組首次從皖南兔眼藍莓根系篩選出4株促進兔眼藍莓生長的內(nèi)生菌根真菌。通過對兔眼藍莓幼苗及兔眼藍莓植株的菌根真菌接種試驗及N、P、K元素相對含量的檢測，證明4種優(yōu)勢菌株對兔眼藍莓植株的生長具有促進作用。通過分子生物學(xué)鑒定得知菌根真菌B菌歸屬于毛霉屬卷枝毛霉f.lusitanicus種(Mucorcircinelloidesf.lusitanicus)，F(xiàn)和I菌也歸屬為毛霉屬卷枝毛霉種(Mucorcircinelloides)，H菌歸屬于毛霉屬總狀枝毛霉種(Mucorracemosus)。該項研究成果為后期兔眼藍莓菌根真菌商業(yè)化的制備提供可能和基礎(chǔ)。

致謝：感謝安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院黃勃教授真菌分子鑒定上給予的技術(shù)支持；感謝合肥師范學(xué)院藍莓苗組培中心的徐德聰博士提供的幫助；感謝安徽大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院潘文娟博士在多光譜成像系統(tǒng)技術(shù)方面提供的指導(dǎo)！

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Isolation and identification of mycorrhizal fungi for the promoting growth ofVacciniumAshei

ZHAO Lei1, LIU Wei1, FU Xiang1, SHAN Xiao-di1, ZHANG Shu-xiang1, JIANG Guang-yue2, HUANG Bei1

(1. School of Life Science， Anhui University， Hefei 230601; 2. Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei 230031， China)

Nine mycorrhizal fungi were isolated from the roots ofVacciniumAsheiinsouthern Anhui Province. The inoculation experiments for the mycorrhizal fungi were performed to detect the survival rate and the height in the shoots and to test the nutrient elements and chlorophyll content in plants of blueberry. four Fungi strains were found as dominant strains in promoting growth ofVacciniumAshei. Through morphological observation and molecular identification method, we found that three strains belong to familiesMucorspeciesMucorcircinelloides, and the different among them may be in subspecies level. Another species belongs to familiesMucorspeciesMucorracemosus, and the similarity between them was greater than 99%. The mycorrhizal fungi from familiesMucorspeciesMucorcircinelloidesandMucorracemosuscan significant promote the nutrient absorption and growth ofVacciniumAshei.

VacciniumAshei； mycorrhizal fungi； inoculation experiment； ITS sequence； molecular identification

2016-09-14；

2016-09-26

安徽省科技廳科技攻關(guān)項目(No. 1301032140)

趙 磊，碩士研究生，研究方向為生物化學(xué)與分子生物學(xué)，E-mail：1012941160@qq.com

黃 蓓，博士，教授，研究方向為細胞生物學(xué)，E-mail：beihuang@163.com

Q93-331

B

2095-1736(2017)04-0016-05

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.04.116