基于深井原位采集技術的塔里木油田內源微生物多樣性研究

孟祥娟, 歐陽國強, 曾有信, 楊忠武, 徐海霞

(中國石油天然氣股份有限公司 塔里木油田分公司 油氣工程研究院， 庫爾勒 841000)

基于深井原位采集技術的塔里木油田內源微生物多樣性研究

孟祥娟, 歐陽國強, 曾有信, 楊忠武, 徐海霞

(中國石油天然氣股份有限公司 塔里木油田分公司 油氣工程研究院， 庫爾勒 841000)

為深入了解塔里木油田高溫高壓環(huán)境中內源微生物的群落組成及潛在功能，利用原油高壓物性儀在輪南和塔中區(qū)塊分別選擇LN-A井和TZ-B井進行深井原位采樣和井口采樣，比較油水樣品中微生物群落多樣性的差異。環(huán)境基因組技術分析結果顯示：在深井原位采集樣品中，LN-A井優(yōu)勢菌群為Bacillus(芽孢桿菌屬，56%)，TZ-B井為Pseudomonas(假單胞菌屬，50%)；井口樣品中優(yōu)勢菌群與原位樣品一致，但比例偏高。原位采集組的樣品中微生物群落結構更為豐富(LN-A井原位和井口采集樣品中分別為14種和3種；TZ-B井分別為12種和3種)，優(yōu)勢菌群分散，同時還發(fā)現(xiàn)多種新型功能微生物。深井原位采集技術、環(huán)境基因組技術和微生物群落分析技術的有機結合，對于充分認識并深度挖掘高溫高壓油藏中功能微生物資源，并應用于微生物采油技術中具有現(xiàn)實的指導意義和推廣價值。

塔里木油田；深井原位采集技術；環(huán)境基因組學；微生物多樣性分析；微生物采油

塔里木油田油藏環(huán)境條件復雜苛刻，多數(shù)油井埋深超過5000 m，內部溫度高達110℃～150℃，礦化度高達11×104～26×104mg/L[1]，開發(fā)新型高效的采油新材料也頗具挑戰(zhàn)性。然而西部地區(qū)復雜多樣的極端生態(tài)環(huán)境下有大量寶貴的微生物資源，在已有的微生物提高原油采收率技術(Microbial enhanced oil recovery, MEOR)理論依據(jù)和實踐經驗的基礎上開展微生物采油可行性研究，是塔里木油田提高采收率的一個重要技術方向。

目前已有文獻報道從西部地區(qū)各大油田中篩選功能微生物，進行室內驅油效率評價并應用于現(xiàn)場提高采收率[2-3]。新疆陸梁油田微生物種群及其多樣性研究結果顯示：16S rDNA序列分析證實該油藏具有大量微生物類群(155個細菌屬和7個古生菌屬)，如此豐富的微生物菌群，表明該油藏具有廣闊的MEOR潛力[4]。選取新疆克拉瑪依油田某區(qū)塊，進行稠油降黏菌株BT-003的MEOR現(xiàn)場試驗，共應用10余井次，措施有效率達85%，累積增油量高于1500 t[5]。在新疆油田七中區(qū)克上組實施微生物驅實驗和陸梁油田陸9井區(qū)微生物驅先導實驗，采用4注9采，單泵對雙井集中注入微生物激活劑，壓風機連續(xù)或段塞式注入空氣工藝施工兩年，累計增油量高于1.3×104t。MEOR在新疆區(qū)域礦場實施的成功案例，對于塔里木油田開展微生物的群落結構、功能、多樣性、調控等方面的深入研究，開發(fā)新型MEOR技術體系和產品具有重要的指導意義[6-7]。

塔里木油田極端的油藏環(huán)境條件下存在大量不為人知的極端微生物，獨特的基因類型、特殊的生理機制及代謝產物，使它們具有成為未來石油工程新材料的無限可能；但是由于極端生活條件的限制，傳統(tǒng)采樣方法很難獲得原始內源微生物樣品并加以研究，即使應用較先進的環(huán)境基因組學分析方法，由于采集過程中，壓力、溫度等環(huán)境條件的變化，有可能使內源微生物死亡，甚至連殘存的DNA片段也無法有效提取。因此，保持穩(wěn)定的環(huán)境條件采集方式是研究人員面臨的一個難題。目前國內非自噴井的高壓物性采樣技術分為常規(guī)采樣(包括自然沉降法、撈油筒采樣法、江斯頓地層測試器采樣法、灌輕質油法)和電控式采樣[8]。其中電控式采樣中的高壓物性儀(壓力-溫度-體積測試儀，Pressure-volume-temperature，PVT)原位采集系統(tǒng)具有油、氣、水界面測量功能，能在采樣前掌握地層流體相態(tài)、氣油比、流體類型、壓力與體積系數(shù)、壓力與原油黏度關系等，從而避免盲目采樣。PVT原位樣品采集過程封閉，至地面無菌操作間開啟后導出流體，迅速過濾并冷卻，可最大程度地保留內源微生物遺傳信息以便于后續(xù)分析[9]。

本文在塔里木油田的LN-A和TZ-B兩口油井進行PVT深井原位采樣，結合環(huán)境基因組技術，研究油藏內源環(huán)境中的微生物群落，完成微生物種類的鑒定和定量分析。本文是國內首次利用PVT儀進行深井采集并開展微生物多樣性分析，為深度挖掘適應高溫高壓(High pressure and high temperature, HPHT)油藏等極端環(huán)境的潛在采油微生物資源提供新的方法，該技術體系可全面精準地反映油藏內源微生物群落特征，并為塔里木油田MEOR的開發(fā)和應用提供最直接的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

用于內源微生物研究的PVT樣品采集與常規(guī)PVT樣品采集選井原則略有不同。常規(guī)PVT樣品采集井要求選擇產水率小于5%的油氣井。用于微生物研究的PVT采集為排除外來微生物的干擾，要求選擇的油井是未注水層位的油井，或注水后間隔30 d以上未再行注水的油井，對產水率沒有要求。通過嚴格篩選，樣品分別采集自新疆塔里木油田輪南和塔中兩區(qū)塊的LN-A井和TZ-B井。兩口井基本地層參數(shù)見表1。LN-A井埋深5252.80 m，地層溫度121.30℃，壓力為51.00 MPa，地層水礦化度為1.90×105mg/L，偏酸性。TZ-B井埋深4093.00 m，地層溫度106.09℃，壓力為42.53 MPa，地層水礦化度為5.61×104mg/L，偏堿性。兩口井的油藏物性存在明顯差別，具有一定差異性和區(qū)塊代表性，可以進行深井原位采集和環(huán)境基因組分析。

表1 LN-A井和TZ-B井基本地質信息

1.2 方法

1.2.1 采樣方法 利用PVT儀分別在候選深井進行原位采樣，可以實現(xiàn)一次性采集目標油藏特定埋深處的油水樣品。PVT深井采樣現(xiàn)場包括作業(yè)車、PVT儀、井上無菌微生物收集系統(tǒng)、微生物分篩所需設備儀器。采樣過程首先根據(jù)數(shù)值模擬結果、采樣所需的埋藏深度，結合PVT所連鋼纜的下放速度，調節(jié)PVT儀上的開啟時間，由井口入井下。本實驗設定采集埋深為4500 m，下放速度為100 m/min，PVT自動開啟及收集定時為1 h，收集時間為10 min；連續(xù)油管總長度6200 m，實際下連續(xù)油管至預定位置4590 m，此時連續(xù)油管內壓力為56 MPa。待PVT儀完成開啟、收集、關閉程序后，由作業(yè)車在設定時間內提升并收回鋼纜，回收PVT儀；在地面無菌操作間迅速開啟PVT儀處理樣品。

1.2.2 微生物多樣性分析方法

1)基因組總DNA提?。喝VT儀中的100 mL水樣于70℃水浴30 min，濾紙過濾油水混合物，收集水相。留在濾紙上方的原油與2倍體積無菌PBS混合，充分攪拌，用濾紙過濾收集水相，重復3次。合并過濾后水相用0.22 μm微孔濾膜真空抽濾，富集菌體于濾膜上。使用TaKaRa細菌基因組DNA小量純化試劑盒提取已富集菌體的基因組DNA。按照文獻[10]中方法進行瓊脂糖凝膠電泳，可獲得基因組DNA相對分子質量。

2)16S rDNA擴增 使用細菌16S rDNA通用引物8F(5′-TTTGATCCTGGCTCAG-3′)及1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)從深井及井口樣品基因組DNA中擴增細菌16S rDNA片段。使用TaKaRa TP600 PCR儀(寶生物，大連)進行PCR反應，反應體系為50 μL，反應條件為94℃預變性4 min；94℃變性45 s，50℃退火45 s，72℃延伸90 s，共30個循環(huán)；72℃再延伸10 min，4℃保存。

3)RIS Library分析 使用TaKaRa DNA Ligation Kit中的Solution I，將純化后的PCR產物和pMD19-T Vector連接，連接產物命名為CTD414，熱轉化至E.coli感受態(tài)細胞JM109中，涂布平板，37℃過夜培養(yǎng)。待轉化子長出后，挑選白色菌落(原位采集組每井50個克隆，井口采集組每組40個克隆)進行重組子的PCR鑒定和重組載體酶切鑒定[10-11]，委托寶生物工程(大連)有限公司測序，與GenBank中已知序列進行同源性比較，確定微生物種屬。

2 結果

2.1 原油物性分析

深井原位采集和井口采集(對照)所獲樣品表觀性狀觀察與含油量測定結果顯示：深井采集樣品為淡黃色油水混合物，含水率較高，含油量小于10%；井口樣品為暗褐色油水混合物，相對含油增多至40%～50%，含水量為50%～60%。表明原油在舉升過程中，逐漸運移、聚導致含水相對減少。但是通過對脫水原油組分的檢測，發(fā)現(xiàn)深井和井口采集成分變化不顯著。LN-A井和TZ-B井深井與井口樣品原油組分見表2所示。

表2 LN-A井和TZ-B井原油組分分析

2.2 PVT深井原位采集樣品的微生物多樣性分析

深井采集的油樣通過基因組總DNA提取，獲得相對分子質量約為23 ku的細菌全基因組組分，證實深井原位采集技術可獲取完整的微生物遺傳信息資源，表明井下采樣操作對微生物的活性不會造成顯著影響。以所獲基因組DNA為模板，進行16S rDNA全序列擴增，所獲PCR產物經純化后連接于pGEM-T載體中構建基因文庫，用于后續(xù)多樣性分析。使用RIS Library分析方法對16S rDNA插入序列進行隨機測序，通過與GenBank中已知序列進行同源性比較，確定微生物種屬。

LN-A井與TZ-B井深井原位采集樣品的群落多樣性結果見圖1所示。LN-A井中優(yōu)勢菌群為Bacillus(芽孢桿菌屬)，占微生物總數(shù)的56%，包括8個種：Bacillussubtilis(枯草芽孢桿菌)、Bacilluslicheniformis(地衣芽孢桿菌)、Bacillushalodurans(鹽芽孢桿菌)、Bacilluscereus(蠟狀芽孢桿菌)、Bacillusmethylotrophicus(甲醇芽孢桿菌)、Bacillusokhensis(奧哈芽孢桿菌)、Bacilluspermians(二疊紀芽孢桿菌)和Bacilluspumilus(短小芽孢桿菌)，所占比例分別為38%、6%、2%、2%、2%、2%、2%和2%；其次為Pseudomonas(假單胞菌屬)，占微生物總數(shù)的16%，包含兩個種，Pseudomonasaeruginosa(銅綠假單胞菌)和Pseudomonasputida(惡臭假單胞菌)，所占比例分別為12%和4%；除此之外還有2%的Acinetobacter(不動桿菌屬)、2%的Chryseobacterium(金黃桿菌屬)和18%的未可培養(yǎng)微生物(圖1-a)。

TZ-B井中優(yōu)勢菌群為Pseudomonas，占微生物總數(shù)的50%，其下分為P.aeruginosa46%、P.putida4%；其次為Bacillus，占微生物總數(shù)的10%，其中B.subtilis和Bacillusniacini(煙酸芽孢桿菌)所占比例分別為8%和2%；除此之外還有6%的Acinetobacter、2%的Burkholderia(伯克霍爾德菌屬)、14%的未可培養(yǎng)微生物和其他5種微生物(圖1-b)。

圖1 深井原位采集微生物群落多樣性(a： LN-A井；b： TZ-B井)

A： well LN-A; b： well TZ-B

2.3 井口采集樣品的微生物多樣性分析

井口采集樣品組通過基因組總DNA提取，同樣獲得相對分子質量約為23 ku的細菌全基因組組分。微生物多樣性分析同PVT深井原位采集樣品分析方法。

LN-A井與TZ-B井井口樣品群落多樣性結果如圖2所示。LN-A井中優(yōu)勢菌群為Bacillus，占微生物總數(shù)的82.5%，其中分別為B.subtilis(80%)和B.licheniformis(2.5%)；除此之外還有12.5%的不可培養(yǎng)微生物(圖2-a)。TZ-B井中優(yōu)勢菌群為Pseudomonas，占微生物總數(shù)的80%，其次為Bacillus，占微生物總數(shù)的16.7%，同時存在3.3%的未可培養(yǎng)微生物(圖2-b)。

圖2 井口采集微生物群落多樣性(a： LN-A井；b： TZ-B)

A： well LN-A; b： well TZ-B

2.4 兩種采集方式的微生物群落對照

LN-A井和TZ-B井深井原位采集和井口采集方式的環(huán)境基因組和微生物群落對照分別見圖3和表3。將兩種采集方式的油樣通過基因組總DNA提取，獲得相對分子質量約為23 ku的細菌全基因組組分；再比較同樣體積油水樣品中所獲得的基因組總DNA量(圖3)，凝膠電泳圖上結果顯示：PVT采集方式得到的微生物群落多樣性顯著高于井口采集方式，證明該技術可以最大限度地保持油藏內部微生物群落的真實狀態(tài)。

圖3 油水樣品中環(huán)境基因組凝膠電泳圖

Line1：LN-A井深井采集樣品微生物基因組；Line2：LN-A井口采集樣品微生物基因組；Line3：TZ-B井深井采集樣品微生物基因組；Line4：TZ-B井口采集樣品微生物基因組；Marker為分子量標記

3 討論

LN-A井與TZ-B井深井原位采集樣品的群落多樣性對比結果顯示：LN-A井中Bacillus占優(yōu)勢地位，B.subtilis所占比例遠高于其他微生物種群，其他12種微生物所占比例為2%～18%；TZ-B井中則以Pseudomonas占主導地位，可培養(yǎng)微生物豐度略低于LN-A井樣品，P.aeruginosa比例接近總數(shù)一半，其余菌種比例為2%～14%。種群結構出現(xiàn)顯著差異性的原因在于輪南和塔中兩個區(qū)塊油藏特點存在較大差別：輪南區(qū)塊是由超深、多層砂巖組成的水驅油田，目前處于高含水階段；塔中區(qū)塊巖性以細砂巖為主，屬中孔、中滲儲集層，油藏類型主要為底水塊狀油藏[1]。油藏環(huán)境和原油物性差別造成微生物種類及分布不同。

已有文獻報道Bacillus和Pseudomonas是MEOR的重要功能微生物。實驗室環(huán)境下，以烴類為碳源從油井產出液中分離得到的主要是Bacillus[12]。Bacillus通過產生生物表面活性劑降低原油與水以及巖石之間的界面張力；或通過降解長鏈烴類降低原油黏度[13]、增加原油流動性；或產生生物聚合物選擇性地堵塞油藏中的高滲孔道，增加注入水的波及系數(shù)從而達到提高原油采收率的目的[12]。P.aeruginosa是油田中最常見且應用最多的石油微生物，能降解長碳鏈烴、非烴類和芳香烴類等，尤其對非烴類和芳香烴類含量較高的原油降解效果顯著[14-15]。此外，P.aeruginosa產生的鼠李糖脂生物表面活性劑，具有乳化、潤濕、增溶、吸附、發(fā)泡、破乳、絮凝、滲透等性能[16-18]，廣泛用于MEOR和石油污染修復。P.aeruginosa和B.subtilis復合菌株發(fā)酵液可將水的表面張力降低到25.1 mN/m，室內驅油模擬實驗表明，復合微生物驅替可使采收率提高17.38%[19]。

LN-A井與TZ-B井的井口采集樣品群落多樣性對比分析結果顯示：LN-A井樣品中可培養(yǎng)微生物只有Bacillus，TZ-B井樣品中可培養(yǎng)微生物則以Pseudomonas占主要地位，此外為少量Bacillus。兩口井井口樣品所含菌種單一，無法準確反應油藏環(huán)境微生物資源的豐度。井口樣品中微生物組成種類較少，主要原因可能為微生物在原油開采過程由深井帶入井口附近，壓力、溫度、礦化度和pH等條件的改變，導致大量微生物因環(huán)境改變而死亡。此外，摻稀等增產措施的污染及地表淺層微生物污染同樣會造成大量菌株死亡，導致井口微生物組成單一。

表3 塔里木油田LN-A井和TZ-B井兩種采集方式微生物群落對照

通過對兩口井微生物群落多樣性分析，可全面了解深井原位采集和井口采集的樣品中微生物的種屬組成(表3)，分析如下。

1)深井原位采集樣品與井口采集樣品群落結構中的優(yōu)勢菌屬大體相似，但井口采集組的微生物多樣性較深井原位采集組簡單，且呈現(xiàn)優(yōu)勢菌群相對密集的現(xiàn)象。

2)兩口井的優(yōu)勢菌屬均為Bacillus和Pseudomonas，為油田常見的MEOR工程微生物，可實施于微生物降黏、驅油及選擇性封堵等工藝措施[31]。兩個菌屬的絕大多數(shù)微生物與已知的嗜熱菌具有95%以上的同源性(結果未顯示)，對應的嗜熱菌經文獻調研，理論上至少可耐受100°C以上的高溫。

3)深井原位采集組中的B.subtilis、P.aeruginosa和P.putida通?？杀磉_高效生物表面活性劑和聚合物，用于稠油降黏、微生物驅油、調剖和清防蠟等[32]；Acinetobacter所表達的生物表面活性劑emulsan是目前已知的最有效的生物乳化劑[26]。

4)在礦化度較高的LN-A井中，深井原位采集樣品組檢測出少量鹽芽孢桿菌，該菌為耐鹽菌種，在MEOR應用中可作為高礦化度油藏微生物工程菌的潛在分子載體。

兩種采集方法分析結果顯示：深井原位采集技術與傳統(tǒng)井口采集技術相比，可獲得更為詳盡精準的微生物資源信息，表明塔里木油田LN-A井和TZ-B井具有激發(fā)內源微生物，進而提高原油采收率的潛力。

4 結論

1)塔里木油田的大多數(shù)油藏屬于HPHT油藏，油藏深層蘊藏著豐富的極端微生物資源。地表采集樣品往往不能充分反映油藏深層情況，為充分利用內源微生物資源，有必要進行深井原位采集樣品。

2)PVT深井原位采集技術的微生物多樣性分析結果顯示：LN-A井深井原位采集與井口樣品中優(yōu)勢菌群均為Bacillus，原位組微生物多樣性(14種)顯著多于井口樣品(3種)；TZ-B井原位采集與井口樣品中優(yōu)勢菌群均為Pseudomonas，原位組微生物多樣性(12種)顯著多于井口組(3種)?；诖耍罹徊杉夹g有望為塔里木油田開展MEOR提供堅實的物質基礎。

3)通過PVT深井原位采集技術，結合微生物學、分子生物學、環(huán)境基因組學以及基因工程的技術手段，可以大大縮短微生物菌種及代謝產物的開發(fā)周期，加深對HPHT油藏內源微生物的認識，在微生物及功能分子篩選過程中可做到有的放矢。

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Endogenous microbial diversity in Tarim oilfield based on deep well in-situ sampling technique

MENG Xiang-juan, OUYANG Guo-qiang, ZENG You-xin, YANG Zhong-wu, XU Hai-xia

( Institute of Oil and Gas Engineering, Traim Oilfield Company, PetroChina, Korla 841000, China)

To insight into the endogenous microbial communities and potential functions living in high pressure and high temperature (HPHT) reservoirs of Tarim Oilfield, crude oil pressure-volume-temperature (PVT) properties equipment was operated for deep wellsin-situsampling in both LN-A and TZ-B wells selected in Lunnan and Tazhong zone, respectively. Meanwhile, wellhead samples were collected as the control. The differences of microbial community diversity in oil-water samples were compared and analyzed. The metagenomics results showed that the dominant microorganism frominsitusamples of LN-A well wasBacillus(56%), which of TZ-B well wasPseudomonas(50%). Comparing with samples from wellhead, the dominant microorganism was in accord with that ofin-situ, however, the percentage was a little bit higher. The results of the two sampling methods showed that the microbial community structure was richer, dominant bacteria was dispersed, and more new functional microorganisms were found in deep well group (in-situand wellhead samples were 14 and 3 species from LN-A well, respectively, while those of TZ-B well were 12 and 3 species). In this study, deep wellin-situcollection, metagenomics and microbial community analysis technologies were integrated, which can help us fully understand and probe in-depth the functional microbial resource in HPHT reservoir. Additionally, this article can provide practical instructions and application value in microbial enhanced oil recovery technology performed in HPHT reservoir.

Tarim oilfield; deep wellin-situsampling; metagenomics; microbial diversity analysis; microbial enhanced oil recovery

2016-08-09；

2016-12-26

中國石油股份公司重大科技專項《塔里木油田勘探開發(fā)關鍵技術研究》

孟祥娟，工程師，研究方向為化學工程與采油工藝，E-mail:mengxj-tlm@petrochina.com.cn

X172

A

2095-1736(2017)04-0082-06

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.04.082