應用微環(huán)DNA技術體外誘導和制備重組的乙型肝炎病毒共價閉合環(huán)狀DNA

朱園飛，李改云，常豪，魚康康，高月求，鄧強

1. 上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院細胞免疫實驗室，上海 201203； 2. 中國科學院上海巴斯德研究所分子病毒與免疫重點實驗室，上海 200032

·論著·

應用微環(huán)DNA技術體外誘導和制備重組的乙型肝炎病毒共價閉合環(huán)狀DNA

朱園飛1, 2，李改云2，常豪2，魚康康2，高月求1，鄧強1, 2

1. 上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院細胞免疫實驗室，上海 201203； 2. 中國科學院上海巴斯德研究所分子病毒與免疫重點實驗室，上海 200032

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)共價閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)是病毒慢性感染的分子基礎。本課題組前期研究通過Cre/loxP介導的位點特異性DNA重組策略，在細胞核內(nèi)由前體質粒誘導重組cccDNA(rcccDNAloxP)產(chǎn)生，首次建立了HBV cccDNA的體外培養(yǎng)細胞和小鼠實驗模型。本研究基于大腸埃希菌ZYCY10P3S2T PhiC31重組酶誘導表達系統(tǒng)，建立了一種體外誘導HBV rcccDNA(rcccDNAattR)微環(huán)產(chǎn)生和純化的策略。純化的rcccDNAattR微環(huán)具有超螺旋結構，細胞培養(yǎng)實驗證實其能支持功能性的HBV復制和抗原表達。與普通的線性HBV復制子編碼質粒相比，rcccDNAattR尾靜脈高壓注射小鼠模型能誘導顯著延長的病毒抗原血癥。因此，本研究在原核表達系統(tǒng)和實驗小鼠水平提供了一種更為簡化的HBV cccDNA實驗模型系統(tǒng)，并再次顯示rcccDNA具有顯著的穩(wěn)定性，能作為一種基本策略在小鼠模型中誘導病毒持續(xù)感染。

微環(huán)DNA技術；PhiC31；位點特異性重組；乙型肝炎病毒；共價閉合環(huán)狀DNA

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)成熟粒子中含有約3.2 kb的松弛環(huán)狀DNA基因組(relaxed circular DNA，rcDNA)。在病毒感染的肝細胞核內(nèi)，rcDNA修復為共價閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA, cccDNA)，是HBV 轉錄復制的原始模板[1]。rcDNA修復生成的cccDNA具有超螺旋結構，能結合組蛋白等形成串珠樣核小體的微小染色體結構[2]，具有表觀遺傳學修飾特征[3]。細胞核cccDNA具有較長的代謝周期，且能通過細胞分裂傳遞至子代細胞。細胞凋亡或壞死是cccDNA體內(nèi)代謝的主要途徑[4]。cccDNA是HBV慢性感染的分子基礎，現(xiàn)有抗病毒藥物可有效抑制病毒復制和rcDNA形成，但難以清除cccDNA，這是慢性乙型肝炎難以徹底治愈的主要原因[5-6]。

HBV感染的肝細胞中cccDNA拷貝數(shù)較低，迄今仍缺乏簡單、高效的技術方法用于研究。本課題組早先通過構建含有線性單拷貝HBV基因組的編碼質粒prcccDNA，在HBV基因組兩側引入同向loxP位點；在細胞核內(nèi)，Cre重組酶引發(fā)loxP位點之間DNA 重組和環(huán)化，生成含有單拷貝loxP位點的rcccDNA；loxP位點則位于一段約90 bp的外源內(nèi)含子5′供體序列與3′受體序列之間，可在RNA轉錄過程中實現(xiàn)高效拼接[7]。應用尾靜脈高壓技術，共注射前體質粒prcccDNA及Cre編碼質粒，能在免疫功能健全小鼠中誘導顯著延長的HBV抗原血癥，可作為一種基本策略用于發(fā)展HBV持續(xù)感染和慢性肝炎的實驗小鼠模型[7]。

本研究報道了一種由PhiC31介導的位點特異性重組策略[8-9]，在大腸埃希菌中誘導rcccDNA產(chǎn)生。由于系統(tǒng)中刪除了具有原核特征的質粒骨架序列，應用純化的rcccDNA尾靜脈高壓注射小鼠，可能僅激活有限的宿主免疫反應，所以能誘導顯著延長的HBV持續(xù)感染。此外，這一顯著簡化的模型系統(tǒng)將為高通量篩選抗cccDNA化合物提供更多的便利。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸埃希菌ZYCY10P3S2T 購自SBI公司(MN920A-1)。人肝癌細胞株HepG2為本實驗室保存。prcccDNA質粒為本實驗室構建[7]，編碼單拷貝的HBV基因組(ayw亞型，GenBank登錄號V01460.1)。微環(huán)母質粒pMC為SBI公司產(chǎn)品(MN501A-1)。實驗所用的高保真DNA聚合酶PrimeSTAR和限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司。C57BL/6雄性小鼠購自上海靈暢生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 質粒構建 以prcccDNA為模板，聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增HBV單拷貝基因組。引物序列分別為：F： 5′-GGGCGCGGCACCTATTGGTCTTACTGAC-3′； R：5′-ACGGTACCTTACCCCCAACTGAGAGA-ACTCAAAGGTTACCCCAGTTGGGGTATTGG-TCTCCTTAAACCTGTC-3′(斜體為KpnⅠ酶切位點，下劃線為反方向的位點特異性重組相關序列attP)。PCR產(chǎn)物經(jīng)KpnⅠ消化后連接到KpnⅠ/SmaⅠ雙酶切的微環(huán)母質粒pMC中，獲得亞克隆質粒prcccDNA-IV。pwtHBV1.2-intron質粒編碼1.2拷貝的線性HBV基因組，attR雜合內(nèi)含子編碼序列(圖1)插入HBV表面抗原(HBV surface antigen，HBsAg)基因中相應位置。

1.2.2 rcccDNA的體外誘導和制備 prcccDNA-IV常規(guī)轉化大腸埃希菌ZYCY10P3S2T。微環(huán)DNA的誘導和制備按廠商指導手冊進行，簡述如下：100 μL 新鮮培養(yǎng)的prcccDNA-IV轉化菌轉接入400 mL含有50 μg/mL卡那霉素的TB 培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)16 h；加入400 mL LB培養(yǎng)液，16 mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液及400 μL 20%L-阿拉伯糖，32 ℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)6 h；離心收集細菌沉淀，-80 ℃存儲備用。

The parental vector of rcccDNAattR(prcccDNA-IV) replicates in anE.colistrain ZYCY10P3S2T which harbors an arabinose-inducible system to express the PhiC31 integrase and the I-SceI endonuclease. PhiC31 recognizes two heterotypic sites (attBandattP) within prcccDNA-IV and catalyzes intramolecular recombination, thereby generating a rcccDNA minicircle containing anattR-chimeric intron (rcccDNAattR) and a minicircle of the plasmid backbone. The latter contains several engineered I-SceI restriction sites that ultimately leads to degradation. TheattR-chimeric intron is inserted within HBsAg gene. The exogenous insert should be removed from viral transcripts through RNA splicing.

圖1 體外誘導和制備rcccDNAattR的示意圖

Fig.1 Schematic of the induction of rcccDNAattRinvitro

1.2.3 rcccDNA的純化 采用去內(nèi)毒素的DNA純化試劑盒(Qiagen，12831)純化rcccDNA，離心收集細菌裂解液上清，避免物理切割超螺旋DNA。柱純化洗脫的DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，切膠后分離具有超螺旋結構的rcccDNA(約2.0 kb)，用膠純化試劑盒(Qiagen，28704)回收純化。

1.2.4 細胞培養(yǎng)和轉染 HepG2細胞在含10%胎牛血清、100 U/mL青/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基(Gibco BRL)中常規(guī)培養(yǎng)。細胞轉染試劑采用Lipofectamine 2000(Invitrogen)，轉染后4 d收取細胞上清液，檢測HBsAg和HBV e抗原(HBV e antigen，HBeAg)的表達。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測 采用上?？迫A生物工程股份有限公司的ELISA試劑盒，檢測細胞培養(yǎng)上清液中HBeAg和HBsAg的表達。用Benchmark ELISA酶標儀(BioRad)讀取450 nm波長處光密度(optical density,OD)。調整樣品稀釋度，使OD450值為0.1～3.0。小鼠血清中HBsAg濃度用Abbott熒光定量PCR儀(于上海交通大學附屬瑞金醫(yī)院)測定。

1.2.6 DNA印跡檢測 參照文獻[7]進行。細胞裂解液用含1%十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)的蛋白酶K(Merck)溶液(1 mg/mL)于55 ℃ 消化過夜，用酚/氯仿法抽提HBV DNA復制中間體。1%瓊脂糖凝膠電泳分離DNA，并轉移至Hybond-N+尼龍膜(Amersham)上。用地高辛標記檢測試劑盒Ⅱ(Roche)標記HBV特異性探針，用于DNA雜交。

1.2.7 小鼠尾靜脈高壓注射 參照文獻[7]進行。簡述如下：將4～5周齡C57BL/6雄性小鼠經(jīng)尾靜脈分別高壓注射 pwtHBV1.2-intron 質粒2～8 μg或 rcccDNAattR2.4 μg，注射后每周從小鼠眼眶后靜脈叢采血，分離血清。

2 結果

2.1 基于phiC31介導的位點特異性重組策略構建rcccDNAattR

利用PhiC31 重組酶特異性識別attP和attB位點的特征，設計構建含有單拷貝HBV基因組的微環(huán)母質粒prcccDNA-IV(圖1)。在插入的微環(huán)母質粒中，HBV基因組起始于HBsAg基因3′端(ayw亞型，nt203)，結束于HBsAg基因5′端(nt202)，上下游組成依次為34 bpattB、46 bp 3′內(nèi)含子序列、3 182 bp HBV單拷貝基因、41 bp 5′內(nèi)含子序列及39 bpattP序列。5′內(nèi)含子(供體序列)和3′內(nèi)含子(分支序列和受體序列)分別來自人類基因組的球蛋白基因和免疫球蛋白基因[7]。prcccDNA-IV在PhiC31作用下實現(xiàn)分子內(nèi)剪切，形成含有123 bpattR雜合內(nèi)含子的rcccDNA微環(huán)(rcccDNAattR)。與基于Cre/loxP重組系統(tǒng)構建的rcccDNAloxP相似，attR雜合內(nèi)含子插于HBV基因組nt202與nt203之間，具有典型的外顯子邊界特征，能在病毒mRNA轉錄過程中被高效移除。母體質粒骨架形成的微環(huán)DNA中含有質粒復制元件及抗生素篩選基因，由于含有多個 I-SceⅠ酶切位點，在大腸埃希菌ZYCY10P3S2T中能被L-阿拉伯糖誘導表達的I-SceⅠ內(nèi)切酶剪切而降解。

2.2 體外誘導和純化具有超螺旋結構的rcccDNAattR

ZYCY10P3S2T菌株中含有阿拉伯糖轉運蛋白基因LacY A177C，加入L-阿拉伯糖能誘導PhiC31重組酶和I-SceⅠ內(nèi)切酶的表達。Qiagen柱純化的rcccDNAattR微環(huán)在瓊脂糖凝膠電泳中顯示為約2.0 kb的條帶，與野生HBV cccDNA電泳條帶相似，提示具有相似的超螺旋結構特征(圖2)。rcccDNAattR超螺旋能耐受95 ℃熱變性(10 min)[10]，用HBV基因組特異限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ處理后回復到3.2 kb，類似于HBV rcDNA的電泳特征。盡管如此，經(jīng)柱純化的rcccDNAattR產(chǎn)物并不理想，如圖2A所示，瓊脂糖凝膠電泳于2.0 kb超螺旋DNA之外仍可見很多污染物，可能包括宿主菌DNA片段、未重組的母體質粒、母體質粒骨架形成的微環(huán)DNA及含有多拷貝HBV基因組的DNA超螺旋，后者能耐受95 ℃熱變性和限制性內(nèi)切酶NdeⅠ的消化(NdeⅠ位點僅存在于微環(huán)母質粒骨架結構中，圖2B)。進一步應用瓊脂糖凝膠回收方法，獲得單一條帶的rcccDNAattR(圖2C)，這一純化方法簡便、高效，并不影響rcccDNAattR的超螺旋特征。瓊脂糖凝膠純化的rcccDNAattR通過DNA測序得到證實。

2.3 rcccDNAattR誘導功能性的病毒復制和抗原表達

HBsAg可指示rcccDNA的形成(圖1)。應用純化的rcccDNAattR轉染肝腫瘤細胞系HepG2，在轉染后4 d的培養(yǎng)細胞上清液中檢測到HBeAg和HBsAg的表達(圖3A)。與rcccDNAloxP前體質粒的轉染相似[7]，應用微環(huán)前體質粒prcccDNA-IV轉染HepG2細胞僅能檢測到少量HBeAg的表達。另一方面，通過DNA印跡雜交法，在rcccDNAattR轉染的HepG2細胞中檢測到HBV特異的病毒復制中間體(圖3B)。這些結果表明，rcccDNAattR能誘導功能性的HBV復制和抗原表達。

2.4 尾靜脈高壓注射rcccDNAattR誘導小鼠模型中延長的抗原血癥

小鼠是理想的實驗模式動物， 但HBV并不感染小鼠[11]；此外，由于未知原因，小鼠肝臟細胞中不能形成HBV cccDNA[12-13]。因此，本研究應用尾靜脈高壓注射法[14-15]對rcccDNAattR誘導的HBV抗原血癥進行分析。如圖4所示，應用1.2拷貝HBV基因組編碼質粒(4 μg)注射免疫功能正常的C57BL/6小鼠，可檢測到血清中短暫的病毒抗原表達(通常在2周以內(nèi))。有意思的是，注射等摩爾比的rcccDNAattR(2.4 μg)可在小鼠模型中誘導出顯著延長的HBV抗原血癥(5～7周)。注射2 μg或4 μg rcccDNAattR均有類似的發(fā)現(xiàn)。以上結果提示，與普通的編碼線性HBV基因組的質粒DNA相比，rcccDNAattR微環(huán)在體內(nèi)具有顯著的穩(wěn)定性。

A: DNA minicircles purified from theE.colistrain were heated to 95 ℃ for 10 min, with or without plasmid-safe (Pla) treatment as indicated at the bottom of each lane. B: After heat-denaturation, DNA minicircles were treated withEcoRI orNdeI. C: rcccDNAattRsupercoils (about 2.0 kb) were purified through gel extraction (QIAquick).

圖2 鑒定體外制備的rcccDNAattR

Fig.2 Identification of rcccDNAattRpreparedinvitro

A: ELISA assay of HBeAg and HBsAg in the medium of HepG2 cells 4 d after transfection with rcccDNAattR. pcDNA3.1 and the parental vector prcccDNA-IV were used as controls. B: Intracellular viral replication detected in HepG2 cells transfected with rcccDNAattRor prcccDNA-IV, by Southern blotting using HBV-specific probe. RC, relaxed circular form; DSL, double-stranded linear form; SS, single-stranded form.

圖3 rcccDNAattR誘導HepG2細胞中HBV抗原表達和病毒復制

Fig.3 rcccDNAattRinduces HBV antigen expression and viral replication in HepG2 cells

Kinetics of serum HBsAg at the indicated time points in C57BL/6 mice (4 weeks old, male;n=5) hydrodynamically injected with rcccDNAattR(2.4 μg). Mice injected with pwtHBV1.2-intron at indicated doses were set as controls. pwtHBV1.2-intron harbors 1.2-copy linear HBV genome with anattR-chimeric intron inserted into HBsAg gene. HBsAg was quantified using an architect platform (Abbott).

圖4 rcccDNAattR在免疫功能正常小鼠模型中誘導出延長的HBV抗原血癥

Fig.4 rcccDNAattRinduces prolonged HBV antigenemia in immunocompetent mice

3 討論

HBV相關體內(nèi)外研究多采用線性化的病毒復制子系統(tǒng)，即DNA質?；蛑亟M病毒載體編碼部分重復或多拷貝串聯(lián)重復的HBV基因組[16]，以替代cccDNA模板啟始病毒復制周期。然而，由于具有較大的基因組長度及攜帶大量的外源性片段(如原核特征的質粒復制和抗性篩選元件等)，DNA質?；蛑亟M病毒載體可能具有與3.2 kb HBV cccDNA顯著不同的病毒學特征和宿主反應性。本課題組早期通過Cre/loxP介導的位點特異性重組策略，由前體質粒誘導rcccDNAloxP產(chǎn)生[7]，首次建立了HBV cccDNA的體外培養(yǎng)細胞和小鼠實驗模型，因而獲得廣泛關注。

需指出的是，細胞核內(nèi)重組產(chǎn)生的rcccDNAloxP可能具有一些與HBV野生cccDNA不一致的特征。例如，Cre/loxP介導的位點特異性重組可能在表觀遺傳學水平影響rcccDNA微小染色體的重建，影響rcccDNAloxP在細胞核中的穩(wěn)定性。此外，rcccDNAloxP前體質粒中的骨架結構及共轉染的重組酶Cre編碼質粒引入了大量原核生物特征元件，重組酶Cre的表達和DNA重組效率也明顯增加了系統(tǒng)復雜性。本研究通過設計基于PhiC31 重組酶介導的位點特異性重組，在大腸埃希菌系統(tǒng)(體外)誘導rcccDNAattR產(chǎn)生。rcccDNAattR直接轉染培養(yǎng)的細胞或通過尾靜脈高壓注射轉染小鼠肝細胞，有效避免了上述rcccDNAloxP系統(tǒng)的缺陷。

本研究沒有特別針對rcccDNAloxP與rcccDNAattR兩種系統(tǒng)的病毒學特征、體內(nèi)穩(wěn)定性等進行比較。上述兩種系統(tǒng)的雜合內(nèi)含子序列并不相同，rcccDNAattR在體外誘導和純化，而rcccDNAloxP在培養(yǎng)細胞系或實驗小鼠肝細胞核中由Cre重組酶介導的DNA重組形成。應用rcccDNAloxP進行實驗對照時，須在系統(tǒng)中平行引入Cre表達質粒，同時須考慮rcccDNAloxP重組效率及細胞核內(nèi)DNA重組對rcccDNA表觀遺傳學的影響等。

cccDNA是HBV慢性感染的分子基礎。與普通的線性HBV復制子編碼質粒相比，直接應用rcccDNAloxP尾靜脈高壓注射小鼠誘導了顯著延長的病毒抗原血癥，這一結果與本課題組早先基于rcccDNAloxP系統(tǒng)的研究類似。因此，(r)cccDNA的穩(wěn)定性是其內(nèi)在特征，與細胞核內(nèi)位點特異性重組及系統(tǒng)引入的非HBV DNA元件沒有顯著關聯(lián)。

總之，本研究是基于早期工作的改進，報道了一種體外誘導rcccDNA產(chǎn)生和純化的策略，在原核表達系統(tǒng)和實驗小鼠水平提供了一種更為簡化的實驗模型系統(tǒng)，也將為高通量篩選抗cccDNA化合物提供更多的便利。

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s. GAO Yueqiu, E-mail: gaoyueqiu@hotmail.com；LI Gaiyun, E-mail: ligaiyun@ips.ac.cn

Preparing recombinant cccDNA of hepatitis B virusinvitrousing minicircle DNA vector technology

ZHU Yuanfei1, 2, LI Gaiyun2, CHANG Hao2, YU Kangkang2, GAO Yueqiu1, DENG Qiang1, 2

1.LaboratoryofCellularImmunity,ShuguangHospitalAffiliatedtoShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201203,China; 2.KeyLaboratoryofMolecularVirologyandImmunology,InstitutPasteurofShanghai,ChineseAcademyofSciences,Shanghai200032,China

Covalently closed circular DNA (cccDNA) of hepatitis B virus (HBV) is essential to establish and sustain viral replication. We recently reported a technique involving HBV recombinant cccDNA (rcccDNA) usingCre/loxP-mediated DNA recombination (rcccDNAloxP). rcccDNAloxPcould be substantially induced in the nuclei of hepatocytes, which thus represents a useful surrogate for HBV cccDNA-related investigations. In the present study, we described an approach to prepare rcccDNA in anEscherichiacoli(E.coli) strain ZYCY10P3S2T based on PhiC31-mediated site-specific recombination (rcccDNAattR). Purified rcccDNAattRminicircles were supercoils which demonstrated to support functional HBV expression and replication in the cell culture. Using the technique of hydrodynamic injection, rcccDNAattRinduced significantly prolonged HBV antigenemia in immunocompetent mice, as compared to a regular plasmid encoding linear HBV replicon. Collectively, our study provided a simplified method to surrogate HBV cccDNA in the prokaryotic expression system and in the mouse model. Our results suggested again that rcccDNA is intrinsically stable and could act as a prototype for modeling HBV persistence in mouse livers.

Minicircle DNA vector technology; PhiC31; Site-specific recombination; Hepatitis B virus; Covalently closed circular DNA

上海市科學技術委員會科研計劃項目(16401970600、17ZR1433400)

高月求，李改云

2017-02-28)