中國Peutz-Jeghers綜合征患者STK11基因突變檢測及高頻突變分析

蔣宇亮，李偉聰，趙子夜，李白容，毛旭艷，寧守斌*

(1.中國人民解放軍空軍總醫(yī)院消化科，北京 100142；2.河北北方學(xué)院研究生院，河北 張家口 075061；3.航天中心醫(yī)院老年2科，北京 100040；4.中國人民解放軍第二七三醫(yī)院外一科，新疆 庫爾勒 841007；5.北京市新華醫(yī)院消化科，北京 101100)

·論 著·

中國Peutz-Jeghers綜合征患者STK11基因突變檢測及高頻突變分析

蔣宇亮1,2，李偉聰3，趙子夜4，李白容1，毛旭艷5，寧守斌1*

(1.中國人民解放軍空軍總醫(yī)院消化科，北京 100142；2.河北北方學(xué)院研究生院，河北 張家口 075061；3.航天中心醫(yī)院老年2科，北京 100040；4.中國人民解放軍第二七三醫(yī)院外一科，新疆 庫爾勒 841007；5.北京市新華醫(yī)院消化科，北京 101100)

目的分析Peutz-Jeghers綜合征(Peutz-Jeghers syndrome，PJS)患者絲/蘇氨酸蛋白激酶11(serine/threonine kinase 11,STK11)基因突變情況，探討不同STK11基因突變與臨床特征的關(guān)系。方法選擇完成STK11所有外顯子基因測序的患者54例，分析其臨床表現(xiàn)及突變分布規(guī)律，并比較不同突變間臨床特征。結(jié)果54例患者中，33例在STK11基因編碼區(qū)檢測出點(diǎn)突變，先證者30例(檢出率58.8%，30/51)，家族突變檢出率為55.0%(11/20)，散發(fā)突變檢出率為55.9%(19/34)。3個家系共5例患者在同一位點(diǎn)突變(c.180C>G)，疑為高頻突變；另1個家系的2例患者突變位點(diǎn)一致(c.658C>T)；1例患者同時檢測到2個突變位點(diǎn)；剩余26例患者攜帶突變各不相同。c.180C>G首次發(fā)病年齡和首次手術(shù)年齡≤7歲患者中所占比例明顯高于其他突變，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；c.180C>G與其他突變在性別、家族史、腫瘤史、腹部癥狀、手術(shù)史差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論STK11基因突變是PJS發(fā)病的主要致病原因。發(fā)現(xiàn)1例可疑為高頻突變，該突變患者首次發(fā)生癥狀及接受首次手術(shù)年齡均低于其他突變患者，應(yīng)在臨床監(jiān)測及治療過程中多予以關(guān)注。

Peutz-Jeghers綜合征；p21活化激酶類；基因；突變

Peutz-Jeghers綜合征(Peutz-Jeghers syndrome,PJS)是一種罕見的以皮膚黏膜色素沉著和胃腸道多發(fā)息肉為主要表現(xiàn)的的常染色體顯性遺傳性疾病，30%～50% PJS患者有家族遺傳病史[1]。分子遺傳學(xué)研究表明，位于19號染色體短臂19p13.3區(qū)間的絲/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine kinase 11, STK11 )基因是PJS的主要致病基因[2]，可發(fā)生基因的雜合性缺失、移碼突變或無義突變等，從而造成STK11 基因功能喪失。STK11 基因編碼區(qū)為1 302 bp，由9個外顯子組成，編碼相對分子質(zhì)量為60 000的433個氨基酸組成的STK11，屬于一種環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)依賴的蛋白激酶，其功能催化區(qū)域位于第44～309位氨基酸殘基。PJ息肉可致急慢性腹痛、腸套疊、腸扭轉(zhuǎn)、腸梗阻、胃腸道出血等嚴(yán)重并發(fā)癥，其中以小腸套疊最常見[3]，通常發(fā)生于兒童期[4]。中國人民解放軍空軍總醫(yī)院應(yīng)用PCR-DNA測序技術(shù)對54例中國PJS患者的STK11 基因編碼區(qū)進(jìn)行檢測，其中發(fā)現(xiàn)1例高頻突變位點(diǎn)，并對其臨床相關(guān)因素進(jìn)行了分析，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2009年1月—2015年1月在中國人民解放軍空軍總醫(yī)院臨床確診，并同時接受PCR擴(kuò)增技術(shù)、DNA測序及序列比對分析的PJS患者54例。其中男性30例，女性24例，年齡10～51歲，平均(30.12±10.98)歲。包括17個家系20例患者，34例散發(fā)患者。本研究遵守赫爾辛基宣言并由中國人民解放軍空軍總醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。征得所有患者及家屬同意，并簽署知情同意書。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)入組的所有患者均符合PJS的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4][即以下4條中的任何1條：①2個或多個息肉，經(jīng)組織學(xué)診斷符合PJS特點(diǎn)，即起源于黏膜肌層的平滑肌像樹枝樣延伸至息肉的黏膜下層，稱之為PJ息肉(圖1)；②具有PJS家族史且伴有任何數(shù)量的PJ息肉；③具有PJS家族史且典型的皮膚黏膜色素沉著；④典型的皮膚黏膜色素沉著且伴有任何數(shù)量的PJ息肉]；(2)均抽取外周靜脈血，提取基因組DNA，應(yīng)用PCR擴(kuò)增技術(shù)及DNA測序方法檢測STK11基因編碼區(qū)序列。排除標(biāo)準(zhǔn)：不能同時滿足以上2項(xiàng)納入標(biāo)準(zhǔn)者。

圖1 PJ息肉光鏡下表現(xiàn)(HE ×10)

Figure 1 Performance of PJ polyps tissue under light microscope(HE ×10)

1.3 研究方法

1.3.1 DNA提取 PJS患者均抽取外周靜脈血2～4 mL，EDTA-K2抗凝。應(yīng)用血液基因組DNA提取試劑盒(天根生化公司、上海南方基因科技有限公司)方法提取基因組DNA，經(jīng)紫外分光光度法檢測DNA的濃度及純度。-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物設(shè)計(jì) 應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物合成由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院合成生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室、上海南方基因科技有限公司完成。

1.3.3 PCR擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳 對以上STK11外顯子區(qū)域在PCR儀器上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增效果。

1.3.4 DNA測序 對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后應(yīng)用DNA全自動測序儀進(jìn)行測序，測序反應(yīng)引物同時擴(kuò)增產(chǎn)物，測序產(chǎn)物用MEGA 6.05軟件進(jìn)行序列分析，并將測序結(jié)果與基因庫中提供的STK11基因進(jìn)行對比。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料比較采用Fisher精確檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析結(jié)果 54例PJS患者提取的DNA樣本擴(kuò)增后所獲得的PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，結(jié)果表明PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度符合目的片段理論值且特異性好。

2.2 DNA測序結(jié)果及分析

2.2.1 突變總體檢出情況 54例PJS患者序列比對發(fā)現(xiàn)33例患者存在STK11基因編碼區(qū)的突變，30例為先證者，先證者點(diǎn)突變檢出率為58.8%(30/51)，其中錯義突變占80.0%(24/30)，刪除突變占10.0%(3/30)，插入突變占10.0%(3/30)。家族突變檢出率為55.0%(11/20)，散發(fā)突變檢出率為55.9%(19/34)。3個家系共5例患者在同一位點(diǎn)突變(c.180C>G)，疑為高頻突變；另1個家系的2例患者突變位點(diǎn)一致(c.658C>T)；1例患者(PJS12)同時檢測到2個突變位點(diǎn)(c.250A>T，c.1 062C>G)，該患者第250位密碼子A>T的突變引起K84X，在第84位氨基酸形成終止密碼子，考慮c.1 062C>G為多態(tài)性位點(diǎn)；剩余26例患者攜帶突變各不相同。其余21例患者STK11基因編碼區(qū)未檢測到點(diǎn)突變。有家族史患者14例，無家族史患者19例，比例為1∶1.3。男性18例，女性15例，男女比例1∶0.83。見表1。

表1 33例PJS患者STK11基因編碼區(qū)突變情況Table 1 Mutation of STK11 gene coding region in 33 patients with PJS

2.2.2 c.180C>G臨床特征 本組樣本平均發(fā)病年齡為5.8歲(1～14歲)；男性占比高(80.0%，4/5)；均無腫瘤家族史；均因腹痛、嘔吐發(fā)病就診；4～7歲為高發(fā)年齡段；80.0%(4/5)患者因腸梗阻、腸套疊首次接受手術(shù)。見表2。

2.2.3 c.180C>G與其他突變相關(guān)特征比較 c.180C>G首次發(fā)病年齡和首次手術(shù)年齡≤7歲患者中所占比例明顯高于其他突變，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；c.180C>G與其他突變在性別、家族史、腫瘤史、腹部癥狀、手術(shù)史差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表2 c.180C>G患者臨床特征Table 2 Clinical characteristics of patients with c.180C>G

*1例未行手術(shù)

表3 c.180C>G與其他突變患者的相關(guān)特征比較Table 3 Comparison of the related characteristics of patients with c.180C>G and other mutations (例數(shù))

注：Fisher精確檢驗(yàn)；*3例無腹部癥狀；#9例未行手術(shù)

3 討 論

PJS是一種常染色顯性遺傳病，主要表現(xiàn)為黏膜色素沉著斑、胃腸道多發(fā)息肉和隨年齡增長的腫瘤風(fēng)險。該病發(fā)病率為1/50 000～1/200 000。目前認(rèn)為該病的主要致病基因是位于19p13.3區(qū)域的STK11基因，該基因是一種抑癌基因[5]。STK11基因的功能復(fù)雜，目前尚未完全闡述明確。歐美相關(guān)研究證實(shí)其通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和細(xì)胞極化發(fā)揮作用[6-7]，位于該基因編碼區(qū)的突變可能導(dǎo)致編碼蛋白的功能失活或缺失。迄今為止，在人類基因突變庫(human gene mutations database,HGMD)中已鑒定出的STK11基因突變有396種。目前國外研究STK11突變檢出率在66%～94%之間[8]，我國學(xué)者對52個家系共116例患者使用Sanger聯(lián)合MLPA進(jìn)行基因檢測，突變檢出率達(dá)67.3%，其中點(diǎn)突變檢出率為51.9%，大段缺失檢出率為15.4%，家族性病例突變檢出率為80.0%，散發(fā)病例檢出率為55.6%[9]。本研究結(jié)果顯示，點(diǎn)突變檢出率為58.8%，家族點(diǎn)突變檢出率為55.0%，散發(fā)點(diǎn)突變檢出率為55.9%，點(diǎn)突變與國內(nèi)數(shù)據(jù)結(jié)果相近。因本研究未對未檢出突變患者進(jìn)行MLPA大段缺失檢測，故家族性、散發(fā)性突變檢出率存在一定差異。

值得注意的是，在33例可檢測到突變患者中，共有5例患者有相同突變(c.180C>G)，其中1例為散發(fā)患者，4例分布于2個不同家系，疑似為高頻突變位點(diǎn)。國內(nèi)學(xué)者在研究中檢測到2例患者攜帶該突變，且呈家族性分布，因患者分布地區(qū)各不相同，故排除同一患者可能[10-11]。國外研究也報道了2例該突變[12-13]。對5例相同突變患者的臨床特征分析：①其中以家系分布為主(80.0%，4/5)，國內(nèi)學(xué)者報道2例突變均有PJS家族病史；②上述患者均未患腫瘤及無腫瘤家族史，國內(nèi)報道也否認(rèn)患者腫瘤家族史；③均有口唇及四肢末端黑斑表現(xiàn)，并以腹痛、嘔吐為首發(fā)癥狀(100.0%，5/5)，平均年齡為5.8歲(1～14歲)，其中4例患者因腸梗阻、腸套疊接受手術(shù)(80.0%，4/5)，平均年齡為11歲(4～21歲)。根據(jù)以上臨床特點(diǎn)，考慮c.180C>G突變患者存在典型的口唇黑斑臨床表現(xiàn)，且有家族分布傾向，首次因腸梗阻、腸套疊接受手術(shù)的平均年齡早于國內(nèi)(17.29歲)[9]和國外(16歲)[14]研究數(shù)據(jù)。

STK11主要由N末端核定位信號結(jié)構(gòu)域、高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域和C末端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域組成[15]，其激酶催化區(qū)域位于第44～309位氨基酸殘基。本研究結(jié)果顯示，高頻突變位于1號外顯子第180位堿基處C>G的錯義突變，可導(dǎo)致編碼STK11蛋白激酶第60位氨基酸形成終止密碼子(TAC→TAG)，進(jìn)而產(chǎn)生截?cái)嗟鞍?。國外研究表明位于激酶區(qū)的基因突變，可能干擾與STRAD和MO25結(jié)合形成復(fù)合體，從而破壞激酶活化功能[16]。此外，STK11的C端是與STRAD結(jié)合的區(qū)域，該區(qū)域的突變可能減弱AMPK的活性，進(jìn)一步影響細(xì)胞極性和下游信號通路。該位點(diǎn)的突變導(dǎo)致部分激酶區(qū)域的缺失和C端調(diào)節(jié)區(qū)的完全缺失，通過影響生長周期、凋亡及細(xì)胞極化等機(jī)制，促進(jìn)息肉的生長和腫瘤的發(fā)生。

在與其他突變臨床特征比較時發(fā)現(xiàn)，c.180C>G在性別、家族史、腫瘤史、有無腹部癥狀、手術(shù)史等方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因PJS患者腸梗阻及腸套疊等息肉相關(guān)并發(fā)癥通常發(fā)生于兒童期[4]，故將對并發(fā)癥的研究年齡7歲為界，分為≤7歲(兒童組)和>7歲組。在對不同突變組與首次發(fā)病(腹痛、嘔吐)年齡進(jìn)行比較時發(fā)現(xiàn)，在年齡≤7歲構(gòu)成比方面，c.180C>G突變組明顯高于其他突變組。與此相似，與首次接受手術(shù)年齡的關(guān)系研究中，c.180C>G組在年齡≤7歲的構(gòu)成比也高于其他突變組。所以，c.180C>G突變除有典型的PJS臨床表現(xiàn)外，還有傾向于年齡≤7歲時首次發(fā)生癥狀和首次接受手術(shù)的特點(diǎn)。而這一表現(xiàn)可能與突變所導(dǎo)致的激酶區(qū)域的缺失和C端調(diào)節(jié)區(qū)的完全缺失有關(guān)。在對PJS患者的息肉切除過程中，發(fā)現(xiàn)對于大體積的息肉使用內(nèi)鏡黏膜切除術(shù)可有效地減少術(shù)中及術(shù)后出血量，這一發(fā)現(xiàn)與我國學(xué)者研究結(jié)果類似[17]。

總之，通過對54例患者突變檢測的回顧，發(fā)現(xiàn)疑似高頻突變1例，對其臨床表型進(jìn)行分析，是在基因-表型關(guān)聯(lián)方面的一次有益嘗試，并為臨床早期干預(yù)及治療PJS提供了理論基礎(chǔ)。

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(本文編輯：趙麗潔)

Detection of STK11 gene mutation in Chinese Peutz-Jeghers syndrome patients and high frequency mutation analysis

JIANG Yu-liang1,2, LI Wei-cong3, ZHAO Zi-ye4, LI Bai-rong1, MAO Xu-yan5, NING Shou-bin1*

(1.DepartmentofGastroenterology,AirForceGeneralHospitalofPLA,Beijing100142,China; 2.HebeiNorthUniversityGraduateCollege,HebeiProvince,Zhangjiakou075061,China; 3.TheSecondDepartmentofGeriatrics,AerospaceCentralHospital,Beijing100040,China; 4.TheFirstDepartmentofSurgery,the273rdHospitalofPLA,Korla841007,China; 5.DepartmentofGastroenterology,XinhuaHospital,Beijing101100,China)

Objective To analyze serine/threonine kinase 11 (STK11) gene in patients with Peutz-Jeghers syndrome(PJS), and explore the relationship between different mutations and clinical features. Methods The sequencing of STK11 gene coding region was analyzed from 54 inpatients with PJS. Their clinical manifestations and mutations were analyzed. The clinical characteristics of different mutations were compared. Results Of the 54 patients with PJS, 33 cases were found to have mutations in the coding region of STK11 gene. Among them, 30 cases were probands (the mutation detection rate was 58.8%, 30/51), the mutation detection rate of familial patient was 55.0%(11/20), and the mutation detection rate sporadic patient was 55.9%(19/34). The 5 patients from 3 families had the same point mutation(c.180C>G), which was suspected high frequency mutation. In another family, 2 patients also had the same mutation(c.658C>T). A patient had two mutations; the other 26 patients had a single mutation site. The proportion of patients with c.180C>G in the first onset age and the first surgery age<7 years of age were significantly higher than other mutations, the difference was statistically significant(P<0.05). There were no significant differences in gender, family history, tumor history, abdominal symptoms, and surgical history. Conclusion STK11 gene mutation is the main pathogenicity of PJS. A high frequency mutations were found, patients with this mutation had symptoms and undergo surgery earlier than other patients. We should pay more attention in clinical monitoring and treatment.

Peutz-Jeghers syndrome； p21-activated kinases； genes； mutation

2017-06-14；

2017-07-07

中國人民解放軍空軍總醫(yī)院年度計(jì)劃課題(kz2015026，kz2016021)

蔣宇亮(1986-)，男，內(nèi)蒙古包頭人，河北北方學(xué)院醫(yī)學(xué)碩士研究生，從事消化疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail:ning-shoubin@163.com

R574;R730.269

A

1007-3205(2017)08-0878-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.08.003