基因組學(xué)研究Csu基因簇在生物被膜生成過(guò)程中的作用

李海濤，張魯濤，李 帥，王伯麗，齊天杰，李宏林

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院呼吸內(nèi)一科，河北 石家莊 050000)

·論 著·

基因組學(xué)研究Csu基因簇在生物被膜生成過(guò)程中的作用

李海濤，張魯濤，李 帥，王伯麗，齊天杰，李宏林

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院呼吸內(nèi)一科，河北 石家莊 050000)

目的探討基因組學(xué)研究Csu基因簇在多藥耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌生物被膜生成過(guò)程中的作用。方法選取我院臨床檢驗(yàn)科細(xì)菌室分離篩選的多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌菌株，取該菌株致病力最強(qiáng)的快速生長(zhǎng)期和生物被膜期，提取2個(gè)不同時(shí)期的mRNA進(jìn)行基因組比對(duì)研究。將樣本的基因序列與公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，進(jìn)行功能注釋。結(jié)果同一菌株在菌體快速生長(zhǎng)期和生物被膜期2種狀態(tài)下基因表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。生物被膜狀態(tài)的菌體較快速生長(zhǎng)期的菌體有106個(gè)基因的表達(dá)上調(diào)，其中CsuA/B/C/D基因簇表達(dá)呈顯著升高，92個(gè)基因出現(xiàn)了表達(dá)的下調(diào)。結(jié)論CsuA/B/C/D基因簇在生物被膜生成和形態(tài)維持中發(fā)揮著極其重要的作用。細(xì)菌生物被膜形成過(guò)程中，菌體的初始黏附依賴(lài)于CsuA/B/C/D基因的顯著表達(dá)。CsuA/B/C/D基因簇介導(dǎo)菌毛的生物合成，還介導(dǎo)菌體分泌表面活性物質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)，這些是生物被膜形成早期階段所必需的。

鮑氏不動(dòng)桿菌；抗藥性，多藥；基因檢測(cè)

目前最具威脅的院內(nèi)感染致病菌包括屎腸球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌和腸桿菌屬，這些超級(jí)細(xì)菌對(duì)目前大多數(shù)可用的抗生素均耐藥[1]。多藥耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌目前已經(jīng)成為醫(yī)院院內(nèi)感染的重要病原菌，常常會(huì)引起廣泛的院內(nèi)感染[2-3]。鮑曼不動(dòng)桿菌可以長(zhǎng)期存活，造成慢性定植和感染的反復(fù)發(fā)生，主要是由于細(xì)菌菌體生物被膜的形成。本研究應(yīng)用高通量轉(zhuǎn)錄組基因測(cè)序方法，檢測(cè)相關(guān)調(diào)控因子在生物被膜生成中的影響，探討生物被膜獨(dú)特的生長(zhǎng)方式以及細(xì)菌菌體長(zhǎng)期定植造成反復(fù)感染的機(jī)制，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 收集和篩選菌株 菌株來(lái)自河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院臨床檢驗(yàn)科細(xì)菌室，對(duì)收集的菌株進(jìn)行篩選和藥敏檢測(cè)，剔除非鮑曼不動(dòng)桿菌及非多藥耐藥菌株，收集多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌菌株。多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌是指對(duì)5類(lèi)目前應(yīng)用的抗生素有3類(lèi)或者3類(lèi)以上耐藥。

1.2 樣本的制備 試驗(yàn)菌株選取分離篩選的多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌菌株中數(shù)量最多的優(yōu)勢(shì)菌株Acinetobacter baumannii BJAB0868進(jìn)行研究。取該菌株致病力最強(qiáng)的快速生長(zhǎng)期和生物被膜期，提取2個(gè)不同時(shí)期的mRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組基因比對(duì)研究。將多重耐藥Acinetobacter baumannii BJAB0868接種于無(wú)菌血培養(yǎng)皿生長(zhǎng)8 h，酶標(biāo)儀測(cè)定600 nm吸光度值(檢測(cè)OD600=0.4)，獲得快速生長(zhǎng)期菌株。以無(wú)菌肉湯配制濃度為0.7 Mac的菌懸液，生長(zhǎng)在50 mL微發(fā)酵罐中，持續(xù)在37 ℃恒溫?zé)o菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)96 h，使得生物被膜均勻生長(zhǎng)在微發(fā)酵罐下層表面。每個(gè)微發(fā)酵罐加入1%結(jié)晶紫2 mL，染色30 min。再用PBS清洗3次，無(wú)菌環(huán)境中常溫風(fēng)干，再加入2 mL 95%的乙醇，脫色15 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定600 nm吸光度值。均值為空白對(duì)照的2倍以上者為生物膜形成陽(yáng)性。然后電子顯微鏡鏡下觀察生物被膜生長(zhǎng)情況。

1.3 樣本mRNA的提純和提取 選取多重耐藥Acinetobacter baumannii BJAB0868進(jìn)行研究。取該菌株快速生長(zhǎng)期和生物被膜期，提取2個(gè)不同時(shí)期的mRNA。應(yīng)用RNAprotect Bacteria Reagent和RNeasy Mini Kit試劑盒。取2個(gè)樣本的懸浮菌液，離心，收集菌體。用溶菌酶消化菌體，再加入裂解液，反復(fù)收集，提純，剔除菌體中DNA和蛋白質(zhì)。得到菌體總RNA，進(jìn)一步提純mRNA。樣本RNA≥1 μg，應(yīng)用Life-tech Ribominus系列試劑盒提取。

1.4 樣本基因結(jié)果注釋 將樣本的基因序列與公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，通過(guò)基因的相似性進(jìn)行功能注釋?；蛳嗨菩员葘?duì)主要基于局部序列排比檢索基本工具(Basic Local Alignment Search Tool,BLAST)算法。BLAST能夠?qū)崿F(xiàn)比較兩段核酸或者蛋白序列之間的相似性的功能。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用R version 3.3.0軟件處理數(shù)據(jù)， 組間基因表達(dá)的比較采用Fisher精確檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 樣本RNA數(shù)據(jù)的質(zhì)控檢測(cè) 對(duì)高通量測(cè)序所使用的mRNA數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估：①污染評(píng)估，對(duì)比鮑曼不動(dòng)桿菌公共數(shù)據(jù)庫(kù)，是否污染其他物質(zhì)RNA；②純度評(píng)估，結(jié)果樣本RNA純度高，可進(jìn)行后續(xù)研究。樣本測(cè)序序列無(wú)明顯污染其他物種序列(圖1)，其中橫坐標(biāo)表示測(cè)序位置，縱坐標(biāo)為測(cè)序質(zhì)量值，圖中紅色表示中位數(shù)，黃色是25%～75%區(qū)間，觸須是10%～90%區(qū)間，藍(lán)線是平均數(shù)。測(cè)序是雙端測(cè)序，每條 read 長(zhǎng)度 125 bp。隨著測(cè)序的進(jìn)行，酶的活性會(huì)逐步下降，因此到達(dá)一定測(cè)序長(zhǎng)度后，堿基質(zhì)量值也會(huì)隨之下降。中位值均在 Q20 以上，因此該文庫(kù)堿基質(zhì)量良好，可用于后續(xù)分析。

圖1 樣本堿基質(zhì)量分布圖

Figure 1 The sample base mass distribution

2.2 2組樣本基因表達(dá)比較 2種狀態(tài)的菌體有198個(gè)基因表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。生物被膜狀態(tài)的菌體有106個(gè)基因較快速生長(zhǎng)期菌體的基因表達(dá)上調(diào)，其中又有53個(gè)基因表達(dá)呈顯著升高，但在快速生長(zhǎng)期菌體的表達(dá)極少，甚至表達(dá)被完全抑制。此外，有92個(gè)基因出現(xiàn)了表達(dá)的下調(diào)(圖2)，CsuA/B/C/D基因表達(dá)是顯著升高的。見(jiàn)表1。

在圖2中，每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)基因，橫縱坐標(biāo)分別表示log2(FPKM)值。其中紅色表示上調(diào)基因，綠色表示下調(diào)基因，藍(lán)色表示表達(dá)的基因差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 基因表達(dá)量散點(diǎn)圖

Figure 2 The difference in basic table scattering amount scattering

表1 表達(dá)顯著升高的基因列表Table 1 The list of highly expressed genes

注：Fisher精確檢驗(yàn)

3 討 論

生物被膜是細(xì)菌微生物的聚合體，它可以不可逆地黏附在醫(yī)療器械或者人體組織的表面，包埋入自身分泌產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)中。主要包括細(xì)胞外多糖、蛋白質(zhì)、細(xì)胞外核酸以及其他基質(zhì)[4]。對(duì)于鮑曼不動(dòng)桿菌來(lái)說(shuō)，常常會(huì)形成難以清除的生物被膜，這是其慢性長(zhǎng)期定植于人體組織和持續(xù)存在于各類(lèi)患者體內(nèi)置管中的重要原因[5]。此外，生物被膜還與菌株多藥耐藥特性有關(guān)，生物被膜內(nèi)的菌體更耐不利的外環(huán)境和各種抗生素[6]。鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)抗生素耐藥主要是由于菌體生物被膜的生成[7]。

生物被膜的生成，主要經(jīng)歷3個(gè)階段：初始黏附、細(xì)胞外基質(zhì)分泌結(jié)構(gòu)形成及生物被膜成熟[8]。此外，細(xì)菌生物被膜的形成需要復(fù)雜的信號(hào)因子調(diào)控以及多種蛋白參與其中[9]。生物被膜初始黏附，起始步驟就是需要黏附于一個(gè)生物或者非生物的表面，這是細(xì)菌侵犯機(jī)體造成感染的先決條件，也是細(xì)菌生物被膜形成的先決條件。細(xì)菌菌體的黏附主要靠蛋白和菌毛的介導(dǎo)，通過(guò)非特異電引力或者疏水作用促進(jìn)細(xì)菌的黏附，此階段是可逆的黏附[10]。隨后，細(xì)菌分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)及信號(hào)調(diào)控因子，促使細(xì)菌與黏附表面之間形成不可逆的牢固結(jié)合[11]。在隨后的生物被膜生長(zhǎng)和形態(tài)維持過(guò)程中，信號(hào)因子的調(diào)控起著十分重要的作用，如群體感應(yīng)系統(tǒng)會(huì)感應(yīng)被膜內(nèi)細(xì)菌釋放的特定信號(hào)因子，這些信號(hào)因子及其特異的感應(yīng)受體在菌體內(nèi)部和菌落細(xì)菌之間進(jìn)行信號(hào)交流，調(diào)控生物被膜菌落的基因和蛋白表達(dá)。在細(xì)菌啟動(dòng)初始黏附階段，需要CsuA/B/C/D家族的顯著表達(dá)，幫助促進(jìn)菌體的初始黏附。此外，這些基因還會(huì)作為特殊的信號(hào)系統(tǒng)，調(diào)控細(xì)菌生物被膜的生長(zhǎng)和形態(tài)維持。目前，多藥耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌以生物被膜形式廣泛存在，難以清除；但是有關(guān)生物被膜形成能力與被膜維持所需相關(guān)基因調(diào)控仍不明確[12]。

細(xì)菌生物被膜的形成，使得菌體可以在不利的環(huán)境下長(zhǎng)期存活，造成了鮑曼不動(dòng)桿菌在人體組織慢性定植和感染反復(fù)發(fā)生。細(xì)菌的生物被膜狀態(tài)，不單單只是細(xì)菌在不同生長(zhǎng)階段的簡(jiǎn)單混合物，而是具有自己獨(dú)特蛋白質(zhì)表型和特殊的生物學(xué)特性。生物被膜的生成、形態(tài)維持是通過(guò)特殊通路和信號(hào)因子啟動(dòng)以及復(fù)雜信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的。細(xì)菌從浮游狀態(tài)到生物被膜內(nèi)菌株固著狀態(tài)是一系列復(fù)雜的過(guò)程，需要啟動(dòng)狀態(tài)轉(zhuǎn)換，形成足夠密度的菌落、適宜的陽(yáng)離子濃度、特殊的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，啟動(dòng)其轉(zhuǎn)換模式。但大多機(jī)制不明。

本研究結(jié)果顯示，生物被膜狀態(tài)下，CsuA/B/C/D基因表達(dá)是顯著升高的。說(shuō)明其在生物被膜生成和形態(tài)維持中發(fā)揮著極其重要的作用。細(xì)菌生物被膜形成中，菌體的初始黏附需要依賴(lài)CsuA/B/C/D基因的顯著表達(dá)[13]。生物被膜在形成過(guò)程中，初始黏附以及隨后發(fā)生的基質(zhì)分泌、被膜逐漸成熟、形成不可逆黏附均需要復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，且這些基因表達(dá)需要時(shí)序性調(diào)控，其中CsuA/B/C/D基因會(huì)介導(dǎo)菌毛產(chǎn)生增加，幫助生物被膜黏附和成熟[14]。菌毛是細(xì)菌菌體表面類(lèi)毛發(fā)樣物質(zhì)，它可以幫助菌體識(shí)別非生物表面、宿主黏膜受體及其他黏附表面[15-16]。若是使上述基因鈍化或者失活，就會(huì)出現(xiàn)菌毛缺失、細(xì)菌生物被膜生成受限、菌體黏附受到抑制[17]。因此，CsuA/B/C/D基因的顯著表達(dá)啟動(dòng)了菌體生物被膜形成的初始黏附，使得菌體可以不可逆地黏附于生物表面或醫(yī)療器械的表面，這是生物被膜生成的決定性因素，也是鮑曼不動(dòng)桿菌長(zhǎng)期存活、廣泛傳播的決定性因素。CsuA/B/C/D基因是菌毛生成增加的開(kāi)啟操縱子。

細(xì)菌生物被膜的生成依賴(lài)于菌毛的生物合成，需要CsuA/B/C/D基因介導(dǎo)，CsuA/B/C/D基因還介導(dǎo)菌體分泌表面活性物質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)，這些是生物被膜形成早期階段所必需的[18]。此外，Csu基因簇還與鮑曼不動(dòng)桿菌致病力和毒力相關(guān)[19]。相比于浮游狀態(tài)的細(xì)菌，生物被膜固著狀態(tài)的菌株更加耐藥，具有更強(qiáng)的致病力[15]。由于生物被膜的生成，被膜內(nèi)菌落間、菌落內(nèi)細(xì)菌間聯(lián)系和信號(hào)交換更加頻繁，細(xì)胞外DNA及基質(zhì)間物質(zhì)交換，使得生物被膜內(nèi)的菌落更容易發(fā)生質(zhì)?；蚰退幓虻霓D(zhuǎn)移，生物被膜內(nèi)的菌體耐藥性更強(qiáng)[20-21]。因此，生物被膜使得鮑曼不動(dòng)桿菌更加耐藥，具有更強(qiáng)的致病力，能夠生成更長(zhǎng)時(shí)間，導(dǎo)致院內(nèi)感染反復(fù)發(fā)生[22-24]。進(jìn)一步地深入研究Csu基因簇在生物被膜形成和形態(tài)維持中的作用和機(jī)制，可以為今后治療多耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌定植提供新的方向。

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(本文編輯：許卓文)

Genomics studies the role of the Csu cluster in the biofilm formation

LI Hai-tao, ZHANG Lu-tao, LI Shuai, WANG Bo-li, QI Tian-jie, LI Hong-lin

(TheFirstDepartmentofRespiratoryMedicine,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China)

Objective To study the role of Csu cluster in the biofilm formation of the multidrug resistant Acinetobacter baumannii by genomics. Methods The bacteria were selected from the clinical laboratory of our hospital. The rapidly growth period and biofilm stage were obtained. The mRNA of the two different stages were extracted and sequenced. Compared the gene sequence with the public database, we found the differences in gene expression. Results There were significant differences in the expression of genes between the two strains in the rapid growth phase and biofilm stage of the same strain. In the biofilm state, the expression of 106 genes was up-regulated in the cells with rapid growth phase, in which the expression of CsuA/B/C/D gene cluster was significantly increased, and the expression of 92 genes was down regulated. Conclusion The Csu cluster played an important role in biofilm formation and maintenance. In the formation of biofilm, the initial adhesion of the cells required significant expression of the Csu A/B/C/D. The Csu cluster mediated the biosynthesis of pili and the secretion of extracellular matrix, which were necessary for the early stages of the biofilm formation.

Acinetobacter baumannii; drug resistance, multiple; genetic testing

2017-04-07；

2017-05-05

河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題(ZL20140206，20130503)

李海濤(1983-)，男，河北南宮人，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事呼吸疾病診治研究。

R378.79

A

1007-3205(2017)08-0869-04

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.08.001