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    加味大承氣湯對急性胰腺炎模型大鼠血清炎癥因子及細(xì)胞凋亡的影響*

    2017-08-16 05:57:38郇義超趙
    中國中醫(yī)急癥 2017年7期
    關(guān)鍵詞:承氣湯空白對照胰腺炎

    郇義超趙 佳

    (1.遼寧省沈陽市骨科醫(yī)院,遼寧 沈陽 110044;2.遼寧電力中心醫(yī)院,遼寧 沈陽 110006)

    ·研究報(bào)告·

    加味大承氣湯對急性胰腺炎模型大鼠血清炎癥因子及細(xì)胞凋亡的影響*

    郇義超1趙 佳2

    (1.遼寧省沈陽市骨科醫(yī)院,遼寧 沈陽 110044;2.遼寧電力中心醫(yī)院,遼寧 沈陽 110006)

    目的觀察加味大承氣湯對急性胰腺炎模型大鼠血清炎癥因子及細(xì)胞凋亡的影響。方法50只SD大鼠隨機(jī)分為5組,每組10只,分別為空白對照組、模型對照組、加味大承氣湯低、中、高劑量組,經(jīng)胰膽管逆行注射?;悄懰徕c建立急性胰腺炎大鼠模型。空白對照組和模型對照組給予蒸餾水灌胃,加味大承氣湯低中高劑量組給予相應(yīng)劑量中藥煎煮液灌胃。灌胃24 h后觀察胰腺組織病理學(xué)變化,比較大鼠小腸黏膜厚度、絨毛高度和上皮損傷指數(shù),血清炎癥因子白介素-1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平,大鼠腹水量、血清淀粉酶和脂肪酶含量,苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣模式識別受體(NLRP3)和凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)表達(dá)和胰腺細(xì)胞凋亡指數(shù)。結(jié)果與空白對照組比較,模型組大鼠胰腺組織充血、水腫、壞死及出血,中性粒細(xì)胞浸潤,腺泡結(jié)構(gòu)不完整,與模型組比較,加味大承氣湯組大鼠損傷胰腺組織均減輕。加味大承氣湯組小腸黏膜厚度和絨毛高度顯著升高,上皮損傷指數(shù)顯著降低,且有明顯的量效關(guān)系,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);加味大承氣湯組血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著降低,有明顯的量效關(guān)系,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);加味大承氣湯組大鼠腹水量、血清淀粉酶和脂肪酶含量均降低,有明顯的量效關(guān)系,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);加味大承氣湯組大鼠NLRP3和ASC表達(dá)均顯著降低,而胰腺細(xì)胞凋亡指數(shù)升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論加味大承氣湯可減輕急性胰腺炎模型大鼠胰腺組織損傷,保護(hù)腸道屏障功能,減少血清炎癥因子,改善微循環(huán),促進(jìn)胰腺腺泡細(xì)胞凋亡。

    加味大承氣湯 急性胰腺炎 炎癥因子 腸道屏障 細(xì)胞凋亡

    急性胰腺炎是一種病情急、死亡率高的急腹癥,伴有其他器官壞死、膿腫或假性囊腫等并發(fā)癥,是臨床常見危急重癥,嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量甚至威脅生命[1-2]。腸道是急性胰腺炎發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)的中心器官,胰腺炎發(fā)病與全身炎癥反應(yīng)綜合征密切相關(guān),缺氧性病理生理改變可導(dǎo)致炎癥因子升高,胰腺微環(huán)境障礙,加劇細(xì)胞凋亡[3-4]。加味大承氣湯可減輕急性胰腺炎患者的腹痛程度、縮短腸道恢復(fù)時(shí)間,對急性重癥胰腺炎有較好治療作用,但其作用機(jī)制尚不明確[5-6]。因此,本研究以胰膽管逆行注射?;悄懰徕c法建立急性胰腺炎大鼠模型,旨在探討加味大承氣湯對急性胰腺炎模型大鼠血清炎癥因子及細(xì)胞凋亡的影響,為臨床治療提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動物 50只健康清潔級SD大鼠由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供 [許可證號:SCXK(京)2011-0011],雌雄各半,體質(zhì)量(250±20)g。自然光線,以標(biāo)準(zhǔn)飼料和無菌蒸餾水喂養(yǎng)。

    1.2 藥物與試劑 加味大承氣湯:生大黃6 g,芒硝9 g,厚樸15 g,枳實(shí)15 g,丹參10 g,川芎10 g,赤芍10 g,甘草10 g。藥材均由本院中藥房提供,加水煎煮,濃縮為質(zhì)量濃度1 g/mL,4℃冰箱保存?zhèn)溆?。戊巴比妥(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),?;悄懰徕c(美國Sigma公司),白介素-1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)試劑盒(上海生工技術(shù)有限公司),血清淀粉酶和脂肪酶 (蘭州碩達(dá)生物技術(shù)有限公司),血清淀粉酶試劑盒和脂肪酸試劑盒 (武漢博士德公司),苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣模式識別受體(NLRP3)和凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)抗體(美國Santa Cruz公司),凋亡試劑盒 (北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

    1.3 主要儀器 13R離心機(jī)[力康集團(tuán)力新儀器(上海)有限公司],Biotek aQuant型酶標(biāo)儀(上海坤肯生物化工有限公司),OLYMPUSAU5400全自動生化分析儀(日本奧林巴斯有限公司),NI500顯微鏡 (日本尼康公司)。

    1.4 造模與給藥 50只SD大鼠,隨機(jī)取10只為空白對照組,剩余40只SD大鼠3%戊巴比妥麻醉后,開腹行胃造瘺術(shù),經(jīng)胃造口置入內(nèi)徑1.0 mm硅膠管于空腸上段2.0 cm處,關(guān)腹。向胰周被膜內(nèi)勻速注射3.5%?;悄懰徕c1mL,整個(gè)胰腺均勻隆起。術(shù)后20min限制飲水,籠中自由活動。成模大鼠再隨機(jī)分為模型對照組、加味大承氣湯低、中、高劑量組,每組10只。術(shù)后2 h,空白對照組和模型對照組給予蒸餾水灌胃,加味大承氣湯低、中、高劑量組分別給予0.50、1.00、2.00 mL/kg的加味大承氣湯灌胃。

    1.5 標(biāo)本采集與檢測 灌胃給藥24 h后,處死各組大鼠,切取胰腺標(biāo)本,甲醛固定,24 h后,經(jīng)酒精脫水和二甲苯透明后,石蠟包埋,連續(xù)切片,切片間距5mm,HE染色,樹膠封片后,光學(xué)顯微鏡觀察視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)。取幽門10 cm處小腸,甲醛固定后進(jìn)行光鏡檢查,測定小腸絨毛高度、黏膜厚度和上皮損傷指數(shù)。取血液2mL,自然凝固后,3000 r/min離心10 min,分離血清,采用ELISA法檢測血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平,試劑盒購于上海生工技術(shù)有限公司,嚴(yán)格按說明書操作。棉球吸附大鼠腹水,計(jì)算腹水量。血清淀粉酶試劑盒和脂肪酶試劑盒檢測血清淀粉酶和脂肪酶含量,嚴(yán)格按照說明書操作。采用免疫熒光法檢測大鼠NLRP3和ASC表達(dá),嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。取8個(gè)切片,每切取 8個(gè)陽性細(xì)胞數(shù)最多的高倍視野,每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞和凋亡細(xì)胞,凋亡指數(shù)=陽性細(xì)胞數(shù)/ 800×100%。

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以(±s)表示,采用t檢驗(yàn)比較組內(nèi)和組間差異,計(jì)數(shù)資料以n(%)表示,應(yīng)用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 各組大鼠胰腺組織病理學(xué)變化 見圖1??瞻讓φ战M胰腺組織結(jié)構(gòu)清晰,偶見少量炎細(xì)胞浸潤;模型對照組大鼠胰腺組織充血、水腫、壞死及出血,中性粒細(xì)胞浸潤,腺泡結(jié)構(gòu)不完整;加味大承氣湯低劑量組胰腺組織充血、水腫、壞死及出血減輕,炎細(xì)胞浸潤減少,腺泡結(jié)構(gòu)不完整;加味大承氣湯中劑量組胰腺組織充血、水腫、壞死及出血明顯減輕,可見炎細(xì)胞浸潤和不完整腺泡結(jié)構(gòu);加味大承氣湯高劑量組胰腺組織充血、水腫、壞死及出血顯著改善,偶見炎細(xì)胞浸潤,腺泡結(jié)構(gòu)相對完整。

    2.2 各組小腸黏膜厚度、絨毛高度和上皮損傷指數(shù)比較 見表1。與空白對照組比較,模型對照組大鼠小腸黏膜厚度、絨毛高度顯著降低,上皮損傷指數(shù)顯著升高;與模型對照組比較,加味大承氣湯組大鼠加味大承氣湯組小腸黏膜厚度和絨毛高度顯著升高,上皮損傷指數(shù)顯著降低,且有明顯的量效關(guān)系,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    圖1 各組大鼠胰腺組織病理學(xué)變化(HE染色,400倍)

    表1 各組大鼠小腸黏膜厚度、絨毛高度和上皮損傷指數(shù)比較(±s)

    表1 各組大鼠小腸黏膜厚度、絨毛高度和上皮損傷指數(shù)比較(±s)

    與空白對照組比較,*P<0.05;與模型對照組比較,△P<0.05;與加味大承氣湯低劑量組比較,#P<0.05;與加味大承氣湯中劑量組比較,◇P<0.05。下同。

    組別 n 上皮損傷指數(shù)空白對照組 10 0.81±0.15模型對照組 10 6.82±0.26*加味大承氣湯低劑量組10 6.04±0.23△小腸黏膜厚度(μm)絨毛高度(μm)656.38±22.37 436.79±25.12 286.32±14.86*181.39±23.03*327.81±16.12*△243.52±22.75*△加味大承氣湯中劑量組10 5.11±0.22*△#394.56±18.63*△#291.57±23.86*△#加味大承氣湯高劑量組 10 524.47±21.75△#◇361.59±24.13△#◇3.89±0.21△#◇

    2.3 各組大鼠血清炎癥因子水平比較 見表2。與空白對照組比較,模型對照組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著升高;與模型對照組比較,加味大承氣湯組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著降低,有明顯的量效關(guān)系,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    表2 各組大鼠血清炎癥因子水平比較(pg/mL,±s)

    表2 各組大鼠血清炎癥因子水平比較(pg/mL,±s)

    組別 n TNF-α空白對照組 10 65.38±13.07模型對照組 10 273.35±18.81*加味大承氣湯低劑量組 10 215.26±16.56*△IL-1β IL-6 46.12±6.24 143.27±12.33 175.14±15.37*376.15±23.17*135.62±12.45*△311.78±21.34*△加味大承氣湯中劑量組 10 143.66±15.60*△#98.74±9.67*△#251.07±17.47*△#加味大承氣湯高劑量組 10 62.71±8.21△#◇201.35±15.65△#◇101.44±14.61△#◇

    2.4 各組大鼠腹水量、血清淀粉酶和脂肪酶含量比較見表3。與空白對照組比較,模型對照組大鼠腹水量、血清淀粉酶和脂肪酶含量均顯著升高;與模型對照組比較,加味大承氣湯組大鼠腹水量、血清淀粉酶和脂肪酶含量均降低,有明顯的量效關(guān)系,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    表3 各組大鼠腹水量、血清淀粉酶和脂肪酶含量比較(±s)

    表3 各組大鼠腹水量、血清淀粉酶和脂肪酶含量比較(±s)

    組別 n 脂肪酶(U/mL)空白對照組 10 6.11±0.54模型對照組 10 12.32±0.53*加味大承氣湯低劑量組 10 11.05±0.57*△腹水量(mL) 淀粉酶(U/mL)0.84±0.51 2.42±0.12 2.41±0.62*6.86±0.34*2.01±0.59*△5.79±0.31*△加味大承氣湯中劑量組 10 9.68±0.61*△#1.64±0.57*△#4.71±0.26*△#加味大承氣湯高劑量組 10 1.21±0.55△#◇3.42±0.24△#◇7.98±0.57△#◇

    2.5 各組大鼠NLRP3、ASC表達(dá)和胰腺細(xì)胞凋亡指數(shù)比較 見表4。與空白對照組比較,模型對照組大鼠NLRP3和ASC表達(dá)和胰腺細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著升高;與模型對照組比較,加味大承氣湯組大鼠NLRP3和ASC表達(dá)均顯著降低,而胰腺細(xì)胞凋亡指數(shù)升高,劑量密切相關(guān),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    表4 各組大鼠NLRP3、ASC表達(dá)和胰腺細(xì)胞凋亡指數(shù)比較(%,±s)

    表4 各組大鼠NLRP3、ASC表達(dá)和胰腺細(xì)胞凋亡指數(shù)比較(%,±s)

    組別 n 胰腺細(xì)胞凋亡指數(shù)空白對照組 10 0.81±0.14模型對照組 10 3.12±0.81*加味大承氣湯低劑量組 10 5.71±0.95*△NLRP3 ASC 6.34±2.18 7.97±2.17 87.46±9.32*112.61±12.24*71.75±8.27*△82.09±9.22*△加味大承氣湯中劑量組 10 7.82±1.077*△#47.64±7.25*△#51.60±7.21*△#加味大承氣湯高劑量組 10 18.81±5.217△#◇13.23±4.197△#◇8.67±1.577△#◇

    3 討 論

    急性胰腺炎是外科急癥之一,可不同程度累及胰腺周圍組織和全身相關(guān)臟器系統(tǒng),胰腺腺泡及組織廣泛壞死,出血自溶,并發(fā)癥多,常并發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征和多器官功能障礙綜合征[7-8]。急性胰腺炎發(fā)病機(jī)制與微循環(huán)紊亂、炎癥反應(yīng)、胰腺細(xì)胞缺氧、代謝障礙等密切相關(guān),改善胰腺血流灌注,減輕炎癥反應(yīng)是治療的目的[9]。急性胰腺炎屬中醫(yī)學(xué)“腹痛”“膈痛”“胃脘痛”等范疇,以氣滯血瘀、毒瘀互結(jié)為病理特點(diǎn),免疫細(xì)胞過度激活-炎性因子過度釋放是其發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[10-11]。中醫(yī)治療急性胰腺炎具有優(yōu)勢,具有通里攻下、清熱解毒、活血化瘀功效的加味大承氣湯,對急性重癥胰腺炎有較好治療作用,但其作用機(jī)制尚不明確。

    本研究發(fā)現(xiàn),加味大承氣湯組大鼠損傷胰腺組織均減輕,加味大承氣湯組小腸黏膜厚度和絨毛高度顯著升高,上皮損傷指數(shù)顯著降低,且有明顯的量效關(guān)系,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明加味大承氣湯可減輕急性胰腺炎模型大鼠胰腺組織損傷,保護(hù)腸道屏障功能。加味大承氣湯中生大黃、芒硝共奏泄熱通腑,厚樸、枳實(shí)行下氣通滯除滿,消癌除脹,川芎、丹參、赤芍活血祛瘀、清熱涼血散瘀,防止實(shí)熱進(jìn)入血分,阻止血熱互結(jié)有關(guān)[12]。加味大承氣湯組血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著降低,有明顯的量效關(guān)系,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明加味大承氣湯可減輕急性胰腺炎模型大鼠血清炎癥因子。大黃蒽醌清熱解毒、抗菌消炎等作用,保護(hù)胃腸黏膜機(jī)械屏障、增加腸蠕動,減少腸道內(nèi)細(xì)菌及內(nèi)毒素的易位;芒硝增強(qiáng)大黃瀉下導(dǎo)滯之效,抑菌,利于腸道的恢復(fù),且能減少細(xì)菌移位,減輕炎癥級聯(lián)反應(yīng)有關(guān)[13-14]。加味大承氣湯組大鼠腹水量、血清淀粉酶和脂肪酶含量均降低,有明顯的量效關(guān)系。說明加味大承氣湯可改善急性胰腺炎模型大鼠微循環(huán)。厚樸調(diào)整胃腸道運(yùn)動功能,松弛血管平滑?。昏讓?shí)調(diào)節(jié)胃腸平滑肌活動,緩解小腸痙攣,抗變態(tài)反應(yīng);丹參改善血液流變性,抑制血管內(nèi)凝血、激活纖溶、促進(jìn)纖維蛋白降解,改善微循環(huán)等作用密切相關(guān),加味大承氣湯改善胰腺毛細(xì)血管灌注,減輕胰腺水腫或缺血,有改善急性胰腺炎大鼠胰腺微循環(huán)的作用[15-16]。加味大承氣湯組大鼠NLRP3和ASC表達(dá)均顯著降低,而胰腺細(xì)胞凋亡指數(shù)升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明加味大承氣湯可促進(jìn)急性胰腺炎模型大鼠胰腺腺泡細(xì)胞凋亡。NLRP3為固有免疫的重要組成部分,主要存在于細(xì)胞內(nèi),ASC是NLRP3與Caspase-1的橋梁,參與Caspase-1的活化,將IL-1β的前體裂解為IL-1β,與IL-1受體結(jié)合引起炎癥反應(yīng),大黃蒽醌抑制急性胰腺炎模型大鼠早期過激的免疫反應(yīng)發(fā)揮作用,減輕多器官功能損傷,川芎嗪解除血管痙攣,降低血管阻力,增加血流量,改善氧供,減少血循疲滯狀態(tài);赤芍抑制血小板聚集作用,抗炎止痛作用有關(guān)[17-18]。

    綜上所述,加味大承氣湯可減輕急性胰腺炎模型大鼠胰腺組織損傷,保護(hù)腸道屏障功能,減少血清炎癥因子,改善微循環(huán),促進(jìn)胰腺腺泡細(xì)胞凋亡。

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    E ffect of Modified Dachengqi Decoction on Serum Inflammatory Factors and Cell Apoptosis in Rats w ith Acute Pancreatitis

    XUN Yichao,ZHAO Jia.Shenyang Orthopedic Hospital,Liaoning,Shenyang 110044,China.

    Objective:To study the effect of Modified Dachengqi Decoction on serum inflammatory factors and cell apoptosis in rats with acute pancreatitis.M ethods:50 SD rats were random ly divided into 5 groups,10 in each,namely the blank control group,themodel control group,low dose group of Modified Dachengqi Decoction,middle dose group of Modified Dachengqi Decoction and high dose group of Modified Dachengqi Decoction,respectively.Ratmodel of acute pancreatitiswas established by retrograde injection of sodium taurocholate into the pancreatic duct.The blank control group and model control group were given distilled water to the stomach;the Modified Dachengqi Decoction groups were given traditional Chinese medicine decoction lavage.After 24 h,the pathology of pancreatic tissue was observed;intestinalmucosal thickness of rats,the villus height and epithelial damage index were compared;the levels of IL-1β,IL-6 and TNF-α,the abdominal water,expression of NLRP3,ASC and pancreatic cell apoptosis index were also compared.Results:Compared with the blank control group,congestion,there was edema and necrosis and hemorrhage,neutrophil infiltration,and gland bubble structure was not complete in pancreatic tissue in the model group.Compared with the model group,the injury of pancreatic tissue were relieved in Modified Dachengqi Decoction groups.The small intestinalmucosa thickness and villus heightwere significantly increased,and the epithelial injury index decreased significantly in Modified Dachengqi Decoction groups,and there was a significant dose effect;the differences were statistically significant(P<0.05). The levels of IL-1β,IL-6 and TNF-αwere significantly reduced in Modified Dachengqi Decoction groups,and there was a significant dose effect;the differences were statistical significant(P<0.05).The amount of ascites,serum amylase and lipase decreased in Modified Dachengqi Decoction groups,and there was a significant doseeffect;the differenceswere statistical significant(P<0.05).The expression of NLRP3 and ASC were significantly lower in Modified Dachengqi Decoction groups,and the apoptosis index of pancreas increased;the differences were statistical significant(P<0.05).Conclusion:The Modified Dachengqi Decoction can alleviate pancreatic tissue injury in the rats with acute pancreatitis,protect the intestinal barrier function,reduce serum inflammation factors,improvemicrocirculation,and promote apoptosis of pancreatic acinar cells.

    Modified Dachengqi Decoction;Acute pancreatitis;Inflammation factors;Intestinal barrier;Cell apoptosis

    R285.5

    A

    1004-745X(2017)07-1152-04

    10.3969/j.issn.1004-745X.2017.07.007

    2017-04-19)

    遼寧省科技發(fā)展計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2015225008-9)

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