青藤堿對大鼠小腸移植后缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用*

周 利楊莎莎吳勝英

（1.湖北省十堰市太和醫(yī)院，湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院 湖北 十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 十堰 442000）

·研究報告·

青藤堿對大鼠小腸移植后缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用*

周 利1楊莎莎1吳勝英2△

（1.湖北省十堰市太和醫(yī)院，湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院 湖北 十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 十堰 442000）

目的觀察青藤堿對同種異體大鼠小腸移植后缺血/再灌注損傷的影響，研究其保護(hù)機制。方法將小腸移植后的40只受體SD大鼠隨機分為缺血/再灌注組和青藤堿干預(yù)組，另取16只SD大鼠為對照組。術(shù)后青藤堿干預(yù)組用10%青藤堿［10 mL/（kg·d）］灌胃干預(yù)性治療14 d，對照組及缺血/再灌注組按［10 mL/（kg·d）］灌0.9%氯化鈉注射液。采用EnVision二步法檢測小腸黏膜組織CC趨化因子受體5（CCR5）和β-抑制蛋白2（β-arrestin 2）和β-arrestin 2-mRNA的表達(dá)，ELISA試劑盒檢測小腸組織一氧化氮（NO）、一氧化氮合成酶（NOS）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）和丙二醛（MDA）。結(jié)果青藤堿可降低大鼠小腸組織NO和MDA，提高T-SOD，且青藤堿干預(yù)組小腸黏膜β-arrestin 2和β-arrestin 2-mRNA高表達(dá)，CCR5低表達(dá)，與缺血/再灌注組和同組干預(yù)前比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論青藤堿可明顯抑制小腸移植后脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、并通過影響β-arrestin 2和CCR5的表達(dá)來調(diào)節(jié)小腸移植后局部免疫反應(yīng)，對同種異體大鼠小腸移植后缺血/再灌注損傷有保護(hù)作用。

青藤堿 同種異體小腸移植 CC趨化因子受體5 β-抑制蛋白2 缺血/再灌注

氧自由基可誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，其分解產(chǎn)物丙二醛（MDA）對機體產(chǎn)生損害作用，超氧化物歧化酶（SOD）作為特異性抗氧化酶，可清除超氧陰離子，減輕脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA對機體產(chǎn)生損害而起細(xì)胞保護(hù)作用［1］。近年來研究發(fā)現(xiàn)氧自由基及一氧化氮（NO）與腸道炎癥及腫瘤的發(fā)生發(fā)展有一定的相關(guān)性，NO作為神經(jīng)毒性因子，在超氧陰離子存在時會產(chǎn)生毒性作用，加劇缺血/再灌注損傷，一氧化氮合成酶（NOS）是合成NO的酶，與NO呈正相關(guān)［2］。CC趨化因子受體5（CCR5）可誘導(dǎo)白細(xì)胞向腸道組織內(nèi)遷移、聚集、浸潤，導(dǎo)致腸黏膜發(fā)生炎癥性損害［3］。β-抑制蛋白2（β-arrestin 2）為細(xì)胞內(nèi)一種可溶性蛋白質(zhì)，可與磷酸化活化的CCR5結(jié)合，介導(dǎo)CCR5的脫敏與內(nèi)化，參與腸道免疫反應(yīng)過程［4］。β-arrestin 2和CCR5參與小腸腸道免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)過程，有明顯的負(fù)相關(guān)特點，在有炎癥浸潤時，腸道黏膜CCR5高表達(dá)，β-arrestin 2低表達(dá)［5］。本研究先建立同種異體SD大鼠小腸移植模型，觀察青藤堿在移植后對缺血/再灌注損傷的影響，研究其保護(hù)機制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性SD大鼠96只，SPF級，鼠齡8周，體質(zhì)量（165±10）g，實驗動物生產(chǎn)許可證［SCXK（鄂）2013-0008］，實驗動物設(shè)施使用許可證［SYXK（鄂）2013-0031］。

1.2 藥品與試劑 青藤堿 （煙臺魯銀藥業(yè)有限公司，批號2016052320）；肝素鈉（上海第一生化藥業(yè)有限公司，批號1631022051）；水合氯醛（上海展云化工有限公司，批號H0160212）、乳酸林格氏液（杭州民生藥業(yè)有限公司，批號H01633020035）；MDA、NO、NOS及TSOD ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所，編號061125，061127，X061241，X061273）。

1.3 造模與分組 參照文獻(xiàn)［6］，取供體SD大鼠40只，分別稱質(zhì)量，按0.35mL/100 g的劑量，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉。麻醉后仰臥位固定，碘伏消毒備皮，切開腹部皮膚，充分暴露腹腔。自回盲部開始，分別分離結(jié)扎結(jié)腸系膜血管，使結(jié)腸與十二指腸分離。小心分離結(jié)扎腸系膜前動靜脈、淋巴管，理順腸道，切開十二指腸，用0.9%氯化鈉注射液5 mL灌腸，然后沿腹腔干分離門靜脈與腸系膜動脈并結(jié)扎脾靜脈。分離腎下腹主動脈并結(jié)扎腹主動脈，用4℃肝素乳酸林格氏液灌注2～5 min，待腸管變白后剪腹主段小腸約5 cm，置于4℃乳酸林格氏液冰盒備用。取受體SD大鼠40只，受體手術(shù)同供體，但不灌注小腸，在切與供體相同部位的小腸后，在雙目連續(xù)變倍體視顯微鏡下吻合小腸平滑肌、小腸動、靜脈、淋巴管，然后用縫合腹壁肌層各皮膚，消毒，慶大霉素注射液（每次10mg）肌肉注射1周預(yù)防感染。40只SD受體大鼠造模后隨機分為缺血/再灌注組和青藤堿干預(yù)組，每組20只，另取16只大鼠為對照組，對照組不實施移植手術(shù)作為空白對照。

1.4 治療方法 術(shù)后青藤堿干預(yù)組用10%青藤堿［10mL/（kg·d）］灌胃干預(yù)性治療14 d，對照組及缺血/再灌注組按［10mL/（kg·d）］灌0.9%氯化鈉注射液。本實驗在干預(yù)性治療14 d后，缺血/再灌注組大鼠存活14只，青藤堿干預(yù)組大鼠存活18只。

1.5 檢測指標(biāo) 取治療前大鼠8只和干預(yù)14 d時所有存活大鼠，處死，切取小腸組織2 cm，放入濃度為1 mmoL/L的HCL液100 mL中研磨混勻，制小腸組織勻漿液，4℃低溫離心10min（3000 r／min）。取上清液于-70℃液氮中保存待檢。測定前將標(biāo)本置于冷水中復(fù)融，再次4℃低溫離心10min（3000 r／min），然后取上清液，按試劑盒說明用ELISA試劑盒檢測小腸組織勻漿液中NO、NOS、T-SOD和MDA［7］；采用EnVision二步法檢測小腸β-arrestin 2、β-arrestin 2-mRNA和CCR5的表達(dá)［8］。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量數(shù)據(jù)以（±s）表示，各組指標(biāo)比較采用單因素方差分析，組間和兩樣本兩兩比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠治療前后NO、NOS、T-SOD和MDA水平比較 見表1。對照組大鼠NO、NOS、T-SOD和MDA治療前后無明顯變化，與同組干預(yù)前比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。缺血/再灌注組T-SOD在治療前后保持低水平，NO、NOS和MDA高水平，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。青藤堿干預(yù)組T-SOD明顯升高，NO、NOS和MDA降低，與缺血/再灌注組和同組干預(yù)前比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠治療前后NO、NOS、T-SOD和MDA水平比較（±s）

表1 各組大鼠治療前后NO、NOS、T-SOD和MDA水平比較（±s）

與對照組比較，*P＜0.05，與同組干預(yù)前比較，△P＜0.05，與缺血/再灌注組比較，▲P＜0.05。下同。

NO（μmol/mL）NOS（μmol/mL）T-SOD（μmol/mL）MDA（nM/mL）28.67±3.19 19.59±1.17 108.67±13.19 2.59±0.37 27.63±4.12 20.57±1.76 107.603±11.12 2.07±0.22 44.02±5.57 33.82±4.18 74.71±9.23 21.82±0.98（n＝20） 治療14 d 45.94±2.30*35.70±2.18*69.97±7.31*23.74±2.18*青藤堿干預(yù)組 治療前 43.67±4.40 34.85±3.46 77.64±5.45 2.75±0.24（n＝20） 治療14 d 29.42±3.47△▲19.14±1.42△▲109.42±13.42△▲2.14±0.12△▲組別 時間對照組 治療前（n＝16） 治療14 d缺血/再灌注組 治療前

2.2 各組大鼠治療前后CCR5、β-arrestin 2和β-arrestin 2-mRNA水平比較 見表2。對照組大鼠βarrestin 2和β-arrestin 2-mRNA高表達(dá)、CCR5低表達(dá)，治療前后比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。缺血/再灌注組治療前后均為β-arrestin 2和β-arrestin 2-mRNA低表達(dá)、CCR5高表達(dá)，與對照組和同組干預(yù)前比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。青藤堿干預(yù)組相反，β-arrestin 2和β-arrestin 2-mRNA高表達(dá)，CCR5低表達(dá)，與缺血/再灌注組和同組干預(yù)前比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討 論

在腸移植后，隨著血管吻合再通，常伴隨有缺血/再灌注損傷，研究證實，術(shù)后缺血預(yù)處理可增強TSOD活性，減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA對移植小腸的損害，提高移植小腸存活率［9］。為減輕缺血/再灌注損傷，可在術(shù)后進(jìn)行藥物干預(yù)，促進(jìn)移植腸功能恢復(fù)。青藤堿是單體生物堿，防己科植物青風(fēng)藤中提取［10］。具有鎮(zhèn)痛、抗炎、免疫抑制等作用，臨床用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病，對結(jié)腸癌、肝癌、肺癌、宮頸癌及炎癥性腸?。↖BD）等均有治療作用［11］。

表2 各組大鼠治療前后CCR5、β-arrestin 2和β-arrestin 2-mRNA水平比較（±s）

表2 各組大鼠治療前后CCR5、β-arrestin 2和β-arrestin 2-mRNA水平比較（±s）

組別 時間 β-arrestin 2-mRNA對照組 治療前 19.43±0.92（n＝16） 治療21 d 18.52±2.36缺血/再灌注組治療前 7.82±0.88 CCR5（%） β-arrestin 2（%）8.07±0.49 26.59±1.17 7.63±1.12 27.07±2.19 24.79±2.29 9.87±1.28（n＝20） 治療21 d 9.77±1.52*27.94±2.38*11.74±2.08*青藤堿干預(yù)組 治療前 22.61±2.35 10.80±1.55 8.15±1.12（n＝20） 治療21 d 8.45±0.92△▲28.53±1.92△▲23.75±2.18△▲

T-SOD是機體清除氧自由基的一種重要酶，其活性的高低直接反映機體清除氧自由基的能力，并且間接反應(yīng)組織缺血/再灌注損傷的程度［12-13］。從實驗結(jié)果來看，缺血/再灌注組T-SOD在治療前后保持低水平，MDA高水平，與對照組比較有顯著差異，說明缺血/再灌注組存在氧化代謝方面異常，氧自由基脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強，有嚴(yán)重的組織損害現(xiàn)象。而青藤堿干預(yù)組T-SOD明顯升高，MDA降低，與缺血/再灌注組和同組干預(yù)前有顯著差異，說明青藤堿干預(yù)性治療可提高TSOD的活性，減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA對移植小腸的損害。NO是由NOS催化L-精氨酸后生成，正常生理性刺激可引起小量NO合成而發(fā)揮保護(hù)血管內(nèi)皮、調(diào)節(jié)血壓和傳遞神經(jīng)信息等作用。NOS誘導(dǎo)酶通過催化L-精氨酸后生成NO，參與巨噬細(xì)胞的非特異性免疫，NO過量合成會對組織造成損傷［14-16］。本實驗中，缺血/再灌注組證實了這一現(xiàn)象，NO和NOS高于對照組。青藤堿干預(yù)組NO、NOS和MDA則明顯降低，提示青藤堿可能參與NOS參與催化L-精氨酸后生成NO的過程，青藤堿可能先抑制NOS的活性，間接降低NO合成，降低其對血管內(nèi)皮造成的損傷。研究發(fā)現(xiàn)，CCR5參與腸道免疫反應(yīng)，促進(jìn)腸道Th1細(xì)胞分化增殖、參與腸道炎癥時的免疫應(yīng)答，在大鼠結(jié)腸炎的實驗中，腸黏膜CCR5表達(dá)明顯上調(diào)（陽性表達(dá)率提高），CCR5對單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞可能有趨化作用，參與腸黏膜的炎癥性損傷［17-18］。而β-arrestin 2是CCR5的上游調(diào)控蛋白，可介導(dǎo)受體脫敏與內(nèi)化，調(diào)節(jié)CCR5的內(nèi)化和脫敏過程及蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過負(fù)調(diào)節(jié)來影響免疫細(xì)胞的趨化和免疫應(yīng)答［19-21］。這在本實驗缺血/再灌注組治療前后均CCR5高表達(dá)，β-arrestin 2和β-arrestin 2-mRNA低表達(dá)。青藤堿可使β-arrestin 2和β-arrestin 2-mRNA高表達(dá)，CCR5低表達(dá)，這一現(xiàn)象提示青藤堿通過調(diào)控β-arrestin 2來降低CCR5陽性表達(dá)，減輕腸黏膜的Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，降低免疫性損傷，達(dá)到降低缺血/再灌注后恢復(fù)期炎癥損傷，提高小腸移植存活的作用。

綜上所述，青藤堿可抑制小腸移植后缺血/再灌注時的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA對移植小腸的損傷，并通過提高β-arrestin 2和β-arrestin 2-mRNA來降低CCR5，通過這種負(fù)調(diào)節(jié)機制來降低小腸移植后局部炎癥反應(yīng)，對同種異體大鼠小腸移植后缺血/再灌注損傷起到保護(hù)作用。

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Protective Effects of Sinomenine on Ischem ia/Reperfusion Injury Follow ing Small Bowel Transp lantation in Rats

ZHOU Li，YANG Shasha，WU Shengying. Taihe Hospital of Hubei University of Medical，Hubei，Shiyan442000，China.

Objective：To observe the effectofsinomenine on ischemia/reperfusion injury in rats following intestinal transplantation，and study its protectivemechanism.M ethods：40 receptor SD rats after smallbowel transplantationwere randomly divided into ischemia/reperfusion group and sinomenine intervention group（n=20），the other 16 SD ratsas the controlgroup.Afteroperation，the sinomenine intervention group was treated with 10%sinomenine［10mL/（kg·d）］for 14 days，and the controlgroup and the ischemia/reperfusion group

Sodium Chloride injection［10mL/（kg·d）］.CCR5 and the expression ofβ-arrestin 2 andβ-arrestin 2-mRNA in intestinalmucosa tissuewere detected with EnVision two stepmethod；NO，NOS，T-SOD and MDA in intestinal tissuewere detected with ELISA Kit.Results：Sinomenine could reduce NO and MDA in intestinal tissue of the rat，increase T-SOD.In the invention group，therewas the high expression ofβ-arrestin 2 andβ-arrestin 2-mRNA in intestinalmucosa tissueand the low expression ofCCR5.Compared with the ischemia/reperfusion group and the same group before intervention，the differencewas statistically significant（P<0.05）.Conclusion：Sinomenine can inhibit lipid peroxidation after intestinal transplantation and modulate the local immune response after intestinal transplantation by affecting the expression ofbeta-arrestin 2 and CCR5.Ithas protective effects on ischemia/reperfusion injury after allograft transplantation in rats.

Sinomenine；Colon allograft transplantation；CC chemokine receptor 5；β-arrestin 2；Ischemia/reperfusion

R285.5

A

1004-745X（2017）07-1149-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.07.006

2017-03-20）

湖北省教育指導(dǎo)項目（B2016125）

△通信作者（電子郵箱：huangminjobhm@163.com）