荷丹片對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化ApoE（-/-）小鼠血清IL-1β和TNF-α表達(dá)的影響*

孫龍飛徐風(fēng)燕葛振嶸沈祥禮安冬青

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000；2.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊830000；3.新疆名醫(yī)名方與特色方劑學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830000）

·研究報(bào)告·

荷丹片對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化ApoE（-/-）小鼠血清IL-1β和TNF-α表達(dá)的影響*

孫龍飛1，2徐風(fēng)燕1葛振嶸1沈祥禮1安冬青2，3△

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000；2.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊830000；3.新疆名醫(yī)名方與特色方劑學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830000）

目的觀察荷丹片對(duì)載脂蛋白E基因敲除［ApoE（-/-）］小鼠血清中白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達(dá)的影響，探討荷丹片防治動(dòng)脈粥樣硬化（AS）的可能機(jī)制。方法48只8周齡ApoE（-/-）小鼠分為正常對(duì)照組（12只，給予普通飼料室溫飼養(yǎng)），高脂飼料復(fù)合氣候箱干預(yù)組（36只）。喂養(yǎng)12周后，成功復(fù)制ApoE（-/-）小鼠動(dòng)脈粥樣硬化穢濁痰阻證模型后，分為3組：模型組、荷丹片組、阿托伐他汀組。12周后處死各組小鼠，采集標(biāo)本，HE染色光鏡下觀察主動(dòng)脈病理學(xué)變化，并測(cè)定斑塊面積（PA）與管腔面積（LA）之比；酶聯(lián)免疫雙抗夾心（ELISA）法檢測(cè)血清中IL-1β和TNF-α含量。結(jié)果模型組主動(dòng)脈PA/LA比值大于正常對(duì)照組（P<0.01），荷丹片組、阿托伐他汀組PA/LA比值則小于模型組（均P<0.01），荷丹片與阿托伐他汀組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。模型組血清中IL-1β和TNF-α表達(dá)水平均高于正常對(duì)照組（均P<0.01），荷丹片組、阿托伐他汀組血清中IL-1β和TNF-α表達(dá)水平均低于模型組（均P<0.01），荷丹片組與阿托伐他汀組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05）。結(jié)論荷丹片具有防治AS的作用，其機(jī)制可能與其降低炎癥因子IL-1β和TNF-α的表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。

荷丹片 動(dòng)脈粥樣硬化 白細(xì)胞介素-1β 腫瘤壞死因子-α

荷丹片是傳統(tǒng)調(diào)脂中成藥，由荷葉、丹參、補(bǔ)骨脂、山楂及番瀉葉組方而成，具有升清降濁、化痰祛瘀、補(bǔ)益肝腎之功效，已在臨床應(yīng)用多年，取得了良好的臨床療效。近年來(lái)研究表明荷丹片能夠減少動(dòng)脈粥樣硬化（AS）的發(fā)生率，但其防治AS的機(jī)制目前尚不完全明確。課題組在對(duì)新疆動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的研究過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)荷丹片對(duì)新疆特殊的動(dòng)脈粥樣硬化穢濁痰阻證療效顯著，課題組在成功建立動(dòng)脈粥樣硬化穢濁痰阻證動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究荷丹片防治AS的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

48只健康雄性，8周齡，體質(zhì)量16～20 g，C57BL/6J品系，無(wú)特定病原體的ApoE（-/-）小鼠，購(gòu)于北大醫(yī)學(xué)部，許可證號(hào)：SCXK（京）2011-0012。飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心 （已通過(guò)《AAALAC International》《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證管理辦法》和《美國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量管理辦法》認(rèn)證），本實(shí)驗(yàn)通過(guò)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 藥物與試劑

荷丹片由南昌濟(jì)順制藥有限公司生產(chǎn) （批號(hào)：20091210），阿托伐他汀片由輝瑞公司生產(chǎn) （批號(hào)：03171，規(guī)格20 mg/片），蘇木素伊紅（HE）染液由新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科提供；膽固醇 （美國(guó)AMRESCO公司）；豬膽鹽（上海藍(lán)季科技發(fā)展公司）；丙硫氧嘧啶片（RIEMSER Arzneimittel AG公司）；小鼠白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒（eBioscience，美國(guó)）。

1.3 主要儀器

MIC400人工氣候箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；石蠟溶蠟箱，型號(hào)PM-401（SAKURA，日本）；組織包埋機(jī)，型號(hào)5235（SAKURA，日本）；LKB-V切片機(jī)（瑞典LKB公司）；自動(dòng)控溫拷片爐（德國(guó)萊卡公司）；病理圖像分析軟件Image-Pro Plus Version 6.0（Ipp6.0）；光學(xué)顯微鏡（LEICA DM 2500德國(guó)）；低溫高速離心機(jī) （Eppendrof，德國(guó)）；多功能酶標(biāo)儀（Type：1500，Thermo美國(guó)）；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠）。

1.4 分組與造模

將48只8周齡ApoE（-/-）小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，分為正常對(duì)照組（12只，給予普通飼料室溫飼養(yǎng)，溫度20～24℃，相對(duì)濕度40%～70%），余下36只ApoE（-/-）小鼠給予高脂飼料并放在人工氣候箱中飼養(yǎng)［高脂飼料飼養(yǎng)和人工氣候箱干預(yù)以模擬新疆特殊的飲食習(xí)慣及氣候特征，將ApoE（-/-）小鼠每天上午10：00時(shí)定時(shí)放入人工氣候箱，晚上21：00時(shí)取出放回室溫環(huán)境］，建立AS穢濁痰阻證模型［1］，喂養(yǎng)12周后，隨機(jī)從正常對(duì)照組抽取2只、造模組抽取6只ApoE（-/-）小鼠，處死，取主動(dòng)脈根部，HE染色光鏡下觀察，造模組可見(jiàn)主動(dòng)脈內(nèi)膜中膜增厚，平滑肌細(xì)胞增生排列紊亂，大量泡沫細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、膽固醇結(jié)晶及粥樣斑塊形成，管腔明顯狹窄，ApoE（-/-）小鼠活動(dòng)明顯減弱，對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍，喜靜少動(dòng)，倦怠嗜睡，皮毛干枯無(wú)光澤，飲食飲水較正常對(duì)照組明顯減少，體質(zhì)量增加不明顯，大便呈條形而黏膩，舌質(zhì)青紫有瘀斑，舌苔厚而濁膩，證實(shí)造模組ApoE（-/-）小鼠AS穢濁痰阻證模型已制備成功。將正常對(duì)照組剩余的10只ApoE（-/-）小鼠仍作為正常對(duì)照組，造模組剩余30只ApoE（-/-）小鼠隨機(jī)分為模型組、荷丹片組［0.67g/（kg·d）］及阿托伐他汀組［6.1mg/（kg·d）］，每組10只。

1.5 給藥方法

藥物劑量均根據(jù)成人臨床常規(guī)用量等效換算，小鼠實(shí)驗(yàn)用藥量 ［g/（kg·d）］=9.1×成人臨床用藥量［g/（kg·d）］［2］，將藥物溶于蒸餾水，灌胃給藥，每日1次，每周按體質(zhì)量調(diào)整給藥量。正常對(duì)照組和模型組均給予蒸餾水灌胃0.2mL/d，各組小鼠均自由飲水飲食，不限制活動(dòng)。正常對(duì)照組繼續(xù)置于室溫，給予普通飼料喂養(yǎng)；模型組、荷丹片組和阿托伐他汀組繼續(xù)人工氣候箱干預(yù)及給予高脂飲食（高脂飼料配方：基礎(chǔ)飼料72.5%，豬油10%，分析純10%，豬膽鹽0.2%，膽固醇2%，丙硫氧嘧啶片劑0.12%，雞蛋黃5%，21金維他片劑0.1%）。人工氣候箱系統(tǒng)溫度設(shè)定為（6±2）℃，相對(duì)濕度控制在25%～32.8%［3］。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè)

各組ApoE（-/-）小鼠于灌胃第12周末禁食不禁水12 h后，進(jìn)行以下操作：1）麻醉后摘眼球取血，將置于EP管中，3000 g，4℃，離心10min，分離血清，-80℃保存?zhèn)錂z測(cè)。2）打開胸腹腔，無(wú)菌條件下取主動(dòng)脈根部至髂腎動(dòng)脈分支處動(dòng)脈組織，生理鹽水沖洗，在主動(dòng)脈根部取一段長(zhǎng)約0.5 cm，用10%甲醛固定，用于HE染色及斑塊面積分析。

1.6.1 HE染色及斑塊面積分析 甲醛固定的主動(dòng)脈組織經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋后，進(jìn)行切片，每個(gè)組織連續(xù)切片5μm，40張每間5張取1張，共取8張切片；HE染色后在光鏡下觀察主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)變化，用Image G多功能圖像分析軟件進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)測(cè)量分析。計(jì)算主動(dòng)脈斑塊面積 （PA）和主動(dòng)脈管腔面積（LA），測(cè)各組ApoE（-/-）小鼠主動(dòng)脈PA/LA，取PA/LA均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.6.2 血清中IL-1β、TNF-α水平測(cè)定 采用ELISA法檢測(cè)血清中IL-1β、TNF-α濃度，實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒說(shuō)明書操作。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度值，以濃度值為橫坐標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出相應(yīng)的濃度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組ApoE（-/-）小鼠主動(dòng)脈病理形態(tài)學(xué)的變化

見(jiàn)圖1。1）正常對(duì)照組主動(dòng)脈內(nèi)膜中膜見(jiàn)少量平滑肌細(xì)胞增生，排列整齊，無(wú)泡沫細(xì)胞、巨噬細(xì)胞形成，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)不明顯，膽固醇結(jié)晶形成不明顯，管壁幾乎無(wú)脂質(zhì)沉積，管腔無(wú)明顯狹窄。2）模型組主動(dòng)脈內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞增生，排列紊亂，大量泡沫細(xì)胞及巨噬細(xì)胞形成，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，大量膽固醇結(jié)晶形成，管壁有脂質(zhì)沉積，管腔明顯狹窄甚至閉塞，斑塊與管壁黏附不緊密，有脫落與破裂的斑塊。3）荷丹片組主動(dòng)脈內(nèi)膜中膜見(jiàn)平滑肌細(xì)胞增生，排列紊亂，巨噬細(xì)胞形成，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，膽固醇結(jié)晶形成，管壁脂質(zhì)沉積，管腔局部狹窄，未見(jiàn)閉塞，病變程度較模型組減輕，斑塊與管壁粘附緊密，未見(jiàn)斑塊脫落與破裂。4）阿托伐他汀組可見(jiàn)主動(dòng)脈管壁厚薄不均，中膜、內(nèi)膜增厚，平滑肌細(xì)胞增生，排列紊亂，同樣可見(jiàn)有巨噬細(xì)胞形成、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、膽固醇結(jié)晶、脂質(zhì)沉積，斑塊形成，管腔狹窄，未見(jiàn)閉塞，斑塊與粘附于管壁，未見(jiàn)斑塊脫落與破裂。

圖1 各組ApoE（-/-）小鼠主動(dòng)脈病理形態(tài)學(xué)變化（HE染色）

2.2 各組ApoE（-/-）小鼠主動(dòng)脈管腔狹窄程度的比較 見(jiàn)表1。與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠主動(dòng)脈PA/LA比值上升（P<0.01），與模型組比較，荷丹片組、阿托伐他汀組的小鼠主動(dòng)脈PA/LA比值減小 （P< 0.01），荷丹片組與阿托伐他汀組比較，PA/LA比值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表1 各組ApoE（-/-）小鼠主動(dòng)脈根部斑塊面積/管腔面積比值比較（%，±s）

表1 各組ApoE（-/-）小鼠主動(dòng)脈根部斑塊面積/管腔面積比值比較（%，±s）

與正常對(duì)照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01。下同。

組別 n PA/LA正常對(duì)照組 8 0.02±0.01模型組 8 0.67±0.19*荷丹片組 8 0.25±0.1阿托伐他汀組 8 0.26±0.15△

2.3 各組ApoE（-/-）小鼠血清IL-1β和TNF-α表達(dá)水平比較

見(jiàn)表2。與正常對(duì)照組相比較，模型組IL-1β、TNF-α水平均高于正常對(duì)照組（均P<0.01）；與模型組相比較，荷丹片組、阿托伐他汀組IL-1β、TNF-α水平均低于模型組（均P<0.01）；荷丹片組和阿托伐他汀組相比較，荷丹片組IL-1β、TNF-α水平略高于阿托伐他汀組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05）。

表2 各組ApoE（-/-）小鼠血清中IL-1β、TNF-α水平比較（pg/m，±s）

表2 各組ApoE（-/-）小鼠血清中IL-1β、TNF-α水平比較（pg/m，±s）

組別 n IL-1β TNF-α正常對(duì)照組 8 12.33±2.09 8.26±5.04模型組 8 35.39±1.56*61.74±8.06*荷丹片組 8 25.14±1.91△28.14±6.74△阿托伐他汀組 8 24.60±1.29△24.24±6.74△

3 討 論

2015年中國(guó)心血管病報(bào)告顯示［4］，心血管疾病占居民疾病死亡構(gòu)成的40%以上，為我國(guó)居民的首位死因，且患病率及死亡率仍處于上升階段，成為嚴(yán)重危害人類健康的主要疾病之一。AS是其主要的病理基礎(chǔ)，在AS的發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中始終存在炎癥反應(yīng)，而炎性因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是AS病理形成過(guò)程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一［5］。早在20世紀(jì)末，Ross教授提出了“AS是一種慢性炎癥性疾病”的概念［6］。各種炎性細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)參與AS的形成與發(fā)展［7-8］。白細(xì)胞介素-1（IL-1）主要由活化的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是一個(gè)非常重要的前炎癥因子，在炎癥免疫損傷機(jī)制中起著主要的調(diào)節(jié)作用［9］，IL-1主要以IL-1α和IL-1β兩種不同的分子形式存在，其中IL-1β參與AS的形成和發(fā)展［10］。TNF-α具有廣泛的生物學(xué)活性，是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)的重要的前炎癥因子，能夠調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，并刺激自身及IL-l、IL-6、細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，發(fā)揮促炎作用［11-12］，加速AS的形成和發(fā)展，在AS病理變化中起到重要作用。因此，通過(guò)降低炎性因子表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)是防治AS的基本機(jī)制之一。

新疆地區(qū)動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的發(fā)病率較我國(guó)其他省區(qū)偏高，這主要與當(dāng)?shù)氐赜驓夂颦h(huán)境以及居民生活飲食習(xí)慣密切相關(guān)［13］。本文作者、著名中西醫(yī)結(jié)合心血管專家安冬青教授從上世紀(jì)90年代始，針對(duì)新疆特殊地域氣候環(huán)境和居民飲食特點(diǎn)，開展大樣本、多中心流行病學(xué)調(diào)查，運(yùn)用循證醫(yī)學(xué)的研究方法，總結(jié)出穢濁痰阻證是新疆地區(qū)動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的的主要證型。安冬青教授認(rèn)為新疆地處我國(guó)西北，氣候干燥寒冷，居民喜食肥甘厚膩、辛辣烤炙之品。此類食品易使脾胃運(yùn)化失常，脾虛濕盛，燥傷津液，煉液成痰；痰邪凝結(jié)成塊，壅滯脈絡(luò)；寒邪入侵，氣機(jī)閉塞，則血運(yùn)不暢，瘀血內(nèi)生，演變成以脾虛為本，痰瘀濕濁為標(biāo)的穢濁痰阻證［14］。本研究利用氣候箱和高脂飼料干預(yù)并成功建立了動(dòng)脈粥樣硬化穢濁痰阻證ApoE（-/-）小鼠動(dòng)物模型［2］。ApoE（-/-）小鼠由于ApoE基因敲除后，造成血漿含膽固醇豐富的殘粒清除受阻，可出現(xiàn)高膽固醇血癥，并自發(fā)地形成纖維斑塊和復(fù)合斑塊，是進(jìn)行AS發(fā)病機(jī)制和防治研究可靠的動(dòng)物模型。有研究結(jié)果顯示荷丹片能夠治療動(dòng)脈粥樣硬化性疾病［15-16］。

本研究通過(guò)建立動(dòng)脈粥樣硬化穢濁痰阻證動(dòng)物模型，給予不同干預(yù)，研究表明荷丹片能夠抑制泡沫細(xì)胞及巨噬細(xì)胞形成，減輕炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，抑制斑塊形成，減輕管腔狹窄程度，降低血清中炎性因子IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平，提示荷丹片防治AS機(jī)制與其能夠調(diào)節(jié)炎性因子表達(dá)，控制炎癥反應(yīng)有關(guān)。

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The Effect of Hedan Decoction on the Expression of Interleukin-1βand Tumor Necrosis Factor-αof Atherosclerotic in ApoE（-/-）M ice

SUN Longfei，XU Fengyan，GE Zhenrong，et al. Coronary Care Unit，Af-filiated Hospital of Traditional Chinese Medicine，Xinjiang Medical University，Xinjiang，Urumqi830000，China.

Objective：To observe the effect of Hedan Decoction on the expression of Interleukin-1β（IL-1β）and Tumor necrosis factor-α（TNF-α）in serum in apolipoprotein E gene knock-out［ApoE（-/-）mice］，and to explore the possiblemechanism of Hedan Decoction in the prevention and treatment of atherosclerosis.M ethods：48 ApoE（-/-）mice of 8 weeks’old were divided into two groups：12 ApoE（-/-）mice in the normal control group fed with normal diet，and 36 in the intervention group with high fat diet in artificial climate box.36 ApoE（-/-）mice were fed for 12 weeks to duplicate themodel of atherosclerosis huizhuotanzu syndrome.Thereafter，they were randomized into three groups：themodel group，HDP group and Atorvastatin group.After 12 weeks，themice were killed and the samples were collected.The pathological changes of aorta were observed under lightmicroscope with HE staining，and the ratio of plaque area and lumen area were measured.Serum IL-1βand TNF-α levels were measured by enzyme-linked immunosorbent assay.Results：The ratio of aortic plaque area/lumen area in themodel group was higher than that in the normal control group（P<0.01）.Compared with themodel group，the ratio of aortic plaque area/lumen area in HDP group and atorvastatin group were decreased（P<0.01）；there was no statistically significant difference between HDP group and atorvastatin group（P>0.05）.Levels of serum IL-1βand TNF-αin themodel group were significantly higher than those of the normal control group（P< 0.01）.Compared with model group，serum IL-1βand TNF-αlevels in HDP group and Atorvastatin group reduced obviously（P<0.01）；there was no statistically significant difference between HDP group and atorvastatin group（P>0.05）.Conclusion：Hedan Decoction can prevent atherosclerosis，whosemechanism may be related to the reduction of inflammatory factor IL-1βand TNF-α，so as to reduce the inflammatory response.

Hedan Decoction；Atherosclerosis；Interleukin-1β；Tumor necrosis factor-α

R285.5

A

1004-745X（2017）07-1137-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.07.003

2017-04-15）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助課題（81160428）

△通信作者（電子郵箱：326468701@qq.com）