P-EGFR、P-ERK和NF-κB在中耳膽脂瘤上皮中的表達(dá)和意義

王曉麗謝淑敏王月輝劉偉殷團(tuán)芳彭安全任基浩

1湖南省婦幼保健院兒童五官科（長沙410008）

2中南大學(xué)湘雅醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（長沙410008）

3河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（洛陽471000）

4中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，中南大學(xué)耳科研究所（長沙410011）

·基礎(chǔ)研究·

P-EGFR、P-ERK和NF-κB在中耳膽脂瘤上皮中的表達(dá)和意義

王曉麗1謝淑敏2王月輝3劉偉4殷團(tuán)芳4彭安全4任基浩4

1湖南省婦幼保健院兒童五官科（長沙410008）

2中南大學(xué)湘雅醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（長沙410008）

3河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（洛陽471000）

4中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，中南大學(xué)耳科研究所（長沙410011）

目的研究磷酸化表皮生長因子受體（P-EGFR）、磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（P-ERK）和細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）在中耳膽脂瘤上皮組織中的表達(dá)情況，探討EGFR/ERK/NF-κB信號通路在中耳膽脂瘤發(fā)病機(jī)制中的作用。方法應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法及Western blot(WB)免疫印跡法檢測30例中耳膽脂瘤標(biāo)本及15例正常外耳道皮膚組織中P-EGFR、P-ERK和NF-κB蛋白的表達(dá)。結(jié)果（1）P-EGFR蛋白陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)和（或）細(xì)胞膜，在膽脂瘤組的陽性表達(dá)率為63%，明顯高于正常外耳道皮膚組的20%（P<0.05）；P-ERK蛋白陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)和（或）細(xì)胞核，在膽脂瘤組的陽性表達(dá)率為70%，明顯高于正常外耳道皮膚組的20%（P<0.05）；NF-κB蛋白陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞核，在膽脂瘤組的陽性表達(dá)率為60%，明顯高于正常耳道皮膚組的13.3%（P< 0.05）。在30例中耳膽脂瘤組織中，P-EGFR、P-ERK和NF-κB兩兩之間呈正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）。（2）Western blot免疫印跡法檢測結(jié)果顯示：中耳膽脂瘤組中P-EGFR、P-ERK和NF-κB的表達(dá)量明顯高于正常外耳道皮膚組的表達(dá)量。結(jié)論P(yáng)-EGFR、P-ERK和NF-κB在中耳膽脂瘤上皮中表達(dá)增強(qiáng)，EGFR/ERK/NF-κB信號通路可能在中耳膽脂瘤組織的形成和發(fā)展過程中起重要作用。

中耳，膽脂瘤，P-EGFR，P-ERK，NF-κB，EGFR/ERK/NF-κB信號通路

Foundation:Nationalnaturalscience foundation of China(NO:81400457)

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中耳膽脂瘤是耳科常見病，雖為良性病變，卻具有侵襲性、破壞性、復(fù)發(fā)性等特征，發(fā)病機(jī)制尚不清楚，可能與膽脂瘤上皮細(xì)胞的過度增殖、凋亡紊亂等有關(guān)[1-3]。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用，細(xì)胞因子在膽脂瘤發(fā)病機(jī)制中的作用逐漸被重視，本文主要探索磷酸化表皮生長因子受體（phospho-epidermal growth factor receptor,P-EG?FR）、磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（phospho-extra?cellular signal-regulated kinase，P-ERK）和細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear transcription factor kappa B, NF-κB）在中耳膽脂瘤上皮組織中的表達(dá)情況，探討EGFR/ERK/NF-κB信號通路在中耳膽脂瘤發(fā)病機(jī)制中的作用。

表皮生長因子受體（epidermalgrowth factor re?ceptor,EGFR）是一種酪氨酸蛋白激酶受體，其細(xì)胞外部分與配體結(jié)合后可形成二聚體自動(dòng)磷酸化為P-EGFR，從而激活下游MEK/ERK信號通路，調(diào)控NF-κB表達(dá)，影響細(xì)胞增殖、凋亡、遷移等[4-5]。我們的前期研究顯示：EGFR在膽脂瘤上皮組織中處于活化狀態(tài)[6-7]，我們推測：在中耳膽脂瘤組織中可能存在EGFR/ERK/NF-κB信號通路的激活，從而促進(jìn)膽脂瘤的發(fā)生及發(fā)展。因此，我們選取該通路的關(guān)鍵因子P-EGFR、P-ERK和NF-κB，運(yùn)用免疫組織化學(xué)SP法及Western blot(WB)檢測其表達(dá)，探討EGFR/ERK/NF-κB信號傳導(dǎo)通路在中耳膽脂瘤發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標(biāo)本

收集2009.08~2011.08期間中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科后天性中耳膽脂瘤標(biāo)本30例為實(shí)驗(yàn)組，外耳道正常皮膚組織標(biāo)本（取自外耳道口正常皮膚組織）15例為對照組。標(biāo)本取出后一半行常規(guī)石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅（HE）染色，另一半立即置入液氮，作為WB的實(shí)驗(yàn)組織標(biāo)本。

1.1.2 主要試劑

兔抗人P-EGFR多克隆抗體、鼠抗人P-ERK單克隆抗體、鼠抗人NF-κB單克隆抗體購于Santa Cruz公司，RIPA裂解液購自北京普利萊，ECL發(fā)光液購自美國Thermo pierce。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)

步驟如下：烤片、脫蠟、水化、滅活內(nèi)源性過氧化物酶后，0.01M枸櫞酸鉀緩沖液高壓下抗原修復(fù)。山羊血清進(jìn)行抗原封閉后，孵育一抗（P-EG?FR濃度1：200，P-ERK濃度1：50，NF-κB濃度1：200），4℃冰箱內(nèi)過夜。第二天復(fù)溫至室溫30min，PBS浸泡后孵育二抗10~15min，PBS沖洗后，室溫孵育辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素10～15min，PBS沖洗。用新鮮配制的二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzi?dine，DAB）顯色，顯微鏡下控制反應(yīng)時(shí)間。沖洗，復(fù)染，脫水，透明，封片。已知的陽性切片作為陽性對照，PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。

陽性標(biāo)準(zhǔn)：P-EGFR細(xì)胞質(zhì)著色為棕黃色者為陽性細(xì)胞，P-ERK細(xì)胞質(zhì)和（或）胞核著色為棕黃色者為陽性細(xì)胞，NF-κB細(xì)胞核著色為棕黃色者為陽性細(xì)胞。先按照染色的強(qiáng)度（無著色、微弱、中度、深度棕黃色）依次計(jì)為0、1、2、3分，然后在400倍顯微鏡下進(jìn)行閱片，根據(jù)陽性細(xì)胞百分比計(jì)分：0%、＜10%、10%~50%、＞50%依次記0、1、2、3分。二者之積：0～2分為陰性（-），≥3分為陽性（+）。

1.2.2 Western blot免疫印跡法

剪取適量組織，用冰預(yù)冷的PBS清洗組織，加入RIPA裂解液（已加入蛋白酶抑制劑及蛋白磷酸酶抑制劑）于勻漿器中反復(fù)研磨組織直至看不見組織塊。置于冰上，蛋白裂解30分鐘。移至離心管，12000rpm,4℃，15min,離心；將離心后的上清液轉(zhuǎn)移、保存?zhèn)溆?。檢測蛋白濃度后，配膠、上樣、電泳，濃縮膠電泳電壓為80V，分離膠電泳電壓為120V，待溴酚藍(lán)電泳至離膠底約1cm時(shí)終止電泳。根據(jù)marker的指示，分別切出所需分子量蛋白的膠：P-EGFR約170KD，P-ERK1/2約42~44KD,NF-κB約65KD，β-actin約42KD。PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完畢后，1*TBST洗膜5min，用麗春紅染膜，檢測蛋白轉(zhuǎn)膜的效率。5%脫脂奶粉封閉1~2小時(shí)后，PBS洗膜3次，每次15min。然后用1*TBST將一抗按照一定比例稀釋（P-EGFR 1：200，P-ERK 1: 1000，NF-κB 1:1000，β-actin 1:4000），孵育一抗，4℃過夜。第二天搖床30min復(fù)溫至室溫。1*TBST洗3次，每次15min。用1*TBST稀釋HRP標(biāo)記的二抗（稀釋比例1：3000），孵育二抗45~60min。孵育結(jié)束后，1*TBST洗3次，每次15min。使用ECL化學(xué)發(fā)光液（Thermo）進(jìn)行顯影，定影液終止顯色。底片曝光后掃描，并用quantity one專業(yè)灰度分析軟件進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，Spearman檢驗(yàn)分析三蛋白之間的相關(guān)性，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)檢測各蛋白的表達(dá)

中耳膽脂瘤組織及外耳道皮膚組織HE染色如圖示（圖1，圖2）。P-EGFR的陽性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)和（或）細(xì)胞膜，著色為棕黃色。實(shí)驗(yàn)組30例膽脂瘤標(biāo)本中共有19例出現(xiàn)陽性染色（圖3），陽性率為63%；對照組15例外耳道上皮組織中有3例染色為微弱棕黃色（圖4），陽性率為20%。兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.515，P=0.006，P<0.05）（見表1）。

P-ERK的陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)，有時(shí)亦伴有細(xì)胞核著色，主要表達(dá)在膽脂瘤上皮和皮膚組織的基底層和基底上細(xì)胞層。實(shí)驗(yàn)組30例膽脂瘤標(biāo)本中有21例出現(xiàn)陽性染色（圖5），陽性率為70%。對照組15例外耳道上皮組織中有3例染色為微弱棕黃色（圖6），陽性率為20%。兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.045，P=0.002，P<0.05）（見表1）。

NF-κB活化后主要位于細(xì)胞核，以細(xì)胞核著棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組30例膽脂瘤組織標(biāo)本中有18例出現(xiàn)胞核著色，主要分布于膽脂瘤上皮基底層和基底上層(圖7)，陽性率為60%。對照組15例外耳道上皮組織中僅有2例染色顆粒位于細(xì)胞核，其余均為胞質(zhì)著色（圖8），為陰性表達(dá)，陽性率為13.3%。兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.820，P=0.003，P<0.05）（見表1）。

表1 中耳膽脂瘤組和正常外耳道皮膚組P-EGFR、P-ERK與NF-κB蛋白表達(dá)情況的比較Table1 Comparison of theexpression of P-EGFR,P-ERK and NF-κB between cholesteatoma inm iddleearand normalcanalskin

表2所示為使用Spearman方法檢驗(yàn)?zāi)懼鼋M中P-EGFR、P-ERK和NF-κB之間的相互關(guān)系的結(jié)果，膽脂瘤組中P-EGFR與P-ERK的表達(dá)存在正相關(guān)（r=0.709,P=0.000,P＜0.05），P-EGFR與NF-κB的表達(dá)存在正相關(guān)（r=0.508，P=0.004，P＜0.05），P-ERK與NF-κB的表達(dá)存在正相關(guān)（r= 0.505，P=0.004，P＜0.05）。

2.2 Western blot免疫印跡法檢測P-EGFR、P-ERK和NF-κB蛋白的相對表達(dá)

將曝光后的底片掃描，并用quantity one專業(yè)灰度分析軟件進(jìn)行分析。結(jié)果顯示：中耳膽脂瘤中P-EGFR、P-ERK和NF-κB蛋白的表達(dá)明顯高于正常皮膚（圖9）。對兩組樣本的相對灰度值進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果示：膽脂瘤組中P-EGFR的相對表達(dá)量為0.8380±0.0431，顯著高于正常皮膚組的0.3900±0.1175（t=-3.580，P=0.016,P＜0.05）；膽脂瘤組中P-ERK的相對表達(dá)量為0.1660±0.0248，顯著高于正常皮膚組的0.0700±0.0138（t=-3.381，P= 0.019,P＜0.05）；膽脂瘤組中NF-κB的相對表達(dá)量為0.8200±0.1309，顯著高于正常皮膚組的0.3860± 0.0706（t=-2.918，P=0.010,P＜0.05）。

圖1 膽脂瘤上皮HE染色（×100）；Fig.1 Hematoxylin-eosin staining of cholesteatoma(×100);

圖2 正常外耳道皮膚HE染色（×100）；Fig.2 Hematoxylin-eosin staing of normalskin(×100);

圖3 P-EGFR在中耳膽脂瘤上皮中的陽性表達(dá)（×200）；Fig.3 The positiveexpression of P-EGFR in cholesteatoma (×200);

圖4 P-EGFR在正常外耳道皮膚中的陰性表達(dá)（×200）；Fig.4 The negative expression of P-EGFR in normal skin(× 200)

圖5 P-ERK在中耳膽脂瘤上皮中的陽性表達(dá)（×200）；Fig.5 The postive expression of P-ERK in cholesteatoma(× 200);

圖6 P-ERK在正常外耳道皮膚中的陰性表達(dá)（×200）；Fig.6 ThenegativeexpressionofP-ERK innormalskin(×200);

圖7 NF-κB在中耳膽脂瘤上皮中的陽性表達(dá)（×200）；Fig.7 The positive expression of NF-κB in cholesteatoma(× 200);

圖8 NF-κB在正常外耳道皮膚中的陰性表達(dá)（×200）Fig.8 ThenegativeexpressionofNF-κB innormalskin(×200)

表2 中耳膽脂瘤組中P-EGFR、P-ERK和NF-κB蛋白表達(dá)之間的關(guān)系Table 2 Relationship of the expression of P-EGFR、P-ERK and NF-κB in cholesteatoma

表3 中耳膽脂瘤組和外耳道皮膚組中P-EGFR、P-ERK和NF-κB蛋白的相對表達(dá)量Table 3 Comparison of the relative expression of P-EGFR,P-ERK and NF-κB between cholesteatoma inm iddle earand normal canalskin

圖9 兩組標(biāo)本的WB灰度分析圖（S：皮膚C：膽脂瘤）Fig.9 Western blotting analysis of P-EGFR,P-ERK,NF-κB between skin and cholesteatoma(S=skin;C=cholesteatoma)

3 討論

EGFR是一個(gè)約170kDa大小、具有酪氨酸蛋白激酶活性的表皮生長因子受體，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)、胞內(nèi)區(qū)3個(gè)部分構(gòu)成。胞外部分與配體結(jié)合后可形成二聚體自動(dòng)磷酸化為P-EGFR，從而激活下游信號通路，發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移及腫瘤細(xì)胞侵襲性等作用[7]。

ERK蛋白屬于絲氨酸-蘇氨酸激酶亞家族，眾多成員中關(guān)于ERK1、ERK2的研究目前最多。ERK1/2是Ras/Raf/MEK/ERK信號通路的重要成分，通過結(jié)合細(xì)胞表面受體轉(zhuǎn)錄因子，由細(xì)胞漿轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，調(diào)控一些重要蛋白的活性，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞的增殖、分化及凋亡等過程[8-10]。

NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，是一種從B淋巴細(xì)胞的細(xì)胞核提取物中發(fā)現(xiàn)的核蛋白。其家族包括五個(gè)成員：p50、p52、p65、c-Rel和RelB，它們可以形成多種同二聚體或者異二聚體復(fù)合體，激活后由胞漿轉(zhuǎn)移到胞核，參與多種基因的調(diào)控、炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)化、抑制凋亡、促進(jìn)腫瘤發(fā)展等[11-12]。

本研究中我們通過免疫組織化學(xué)方法發(fā)現(xiàn)P-EGFR蛋白陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)和（或）細(xì)胞膜，在膽脂瘤組的陽性表達(dá)率為63%，明顯高于正常外耳道皮膚組的20%（P<0.05）；P-ERK蛋白陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)和（或）細(xì)胞核，在膽脂瘤組的陽性表達(dá)率為70%，明顯高于正常外耳道皮膚組的20%（P<0.05）；NF-κB蛋白陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞核，在膽脂瘤組的陽性表達(dá)率為60%，明顯高于正常耳道皮膚組的13.3%（P<0.05）。Spear?man檢驗(yàn)結(jié)果顯示：中耳膽脂瘤中P-EGFR、P-ERK、NF-κB三者的陽性表達(dá)兩兩之間均呈顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）。WB免疫印跡檢測從蛋白半定量角度也印證了：中耳膽脂瘤中P-EGFR、P-ERK和NF-κB的表達(dá)明顯高于外耳道正常皮膚，且兩組間有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。EG?FR與配體發(fā)生特異性結(jié)合之后，自身磷酸化轉(zhuǎn)變?yōu)镻-EGFR而激活，繼而激活下游EGFR/ERK/ NF-κB信號通路，發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化、遷移、侵襲的作用。我們的前期研究證實(shí)EGFR在膽脂瘤上皮組織中處于活化狀態(tài)[6-7]。Huisman等[13-15]發(fā)現(xiàn)P-ERK1/2在膽脂瘤上皮組織中的表達(dá)較耳后皮膚明顯增強(qiáng)，表達(dá)部位主要位于膽脂瘤組織全層細(xì)胞核，作者推測膽脂瘤上皮中終末分化紊亂，晚期終末分化停止，角質(zhì)形成細(xì)胞滯留在早期終末分化階段，導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖、凋亡抑制，角質(zhì)堆積。Liu等[16]通過免疫組織化學(xué)及WB方法發(fā)現(xiàn)膽脂瘤組織中P-ERK的表達(dá)較正常皮膚增強(qiáng)，主要位于膽脂瘤上皮全層細(xì)胞核。我們通過本研究也再次證實(shí)了中耳膽脂瘤組織中P-ERK1/2顯著增強(qiáng)，此外，陽性細(xì)胞不僅表達(dá)在細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)中也有P-ERK1/2的陽性表達(dá)。

Miyao等[17]發(fā)現(xiàn)在膽脂瘤上皮全層均有NF-κB表達(dá)，主要位于細(xì)胞核周圍，細(xì)胞核內(nèi)卻無表達(dá)，他們推測：膽脂瘤組織中NF-κB失活、其抗凋亡機(jī)制失活，聯(lián)合caspase-3、caspase-8的促凋亡作用，導(dǎo)致角蛋白堆積，膽脂瘤形成。廖軍等[18]發(fā)現(xiàn)膽脂瘤上皮組織中上皮全層均有NF-κβ表達(dá)，23例均有胞漿染色，且8例胞核亦染色，表達(dá)強(qiáng)度顯著高于正常外耳道皮膚組織，推測炎癥反應(yīng)在中耳膽脂瘤發(fā)病機(jī)制中起重要作用，提出抗炎治療、調(diào)控NF-κβ的表達(dá)可能作為膽脂瘤非手術(shù)治療的方案。我們通過本研究也證實(shí)了中耳膽脂瘤組織中NF-κβ的表達(dá)較正常皮膚顯著增強(qiáng)，且主要表達(dá)在細(xì)胞核，我們推測：激活的NF-κβ進(jìn)入細(xì)胞核后與相應(yīng)的靶基因結(jié)合，啟動(dòng)了靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而在膽脂瘤的形成和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

我們知道：P-ERK是EGFR的下游靶因子，NF-κB是P-ERK的下游靶因子，膽脂瘤角質(zhì)形成細(xì)胞所處微環(huán)境中存在大量的表皮生長因子（epi?dermal growth factor,EGF）、轉(zhuǎn)化生長因子α（trans?forming growth factor alpha,TGF-α）及雙調(diào)蛋白（amphiregulin,AR）等炎癥細(xì)胞因子，當(dāng)它們與EG?FR特異性結(jié)合之后使后者自身磷酸化為P-EGFR而被激活，然后激活下游靶因子ERK，繼而NF-κB被激活，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)部一系列信號級聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞增殖、角質(zhì)碎屑堆積，從而促進(jìn)中耳膽脂瘤的發(fā)生及發(fā)展。由此我們推測：EGFR/ERK/ NF-κB信號通路可能在膽脂瘤組織中處于激活狀態(tài)，在膽脂瘤的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。

綜上所述，P-EGFR、P-ERK、NF-κB在中耳膽脂瘤上皮中的表達(dá)顯著高于外耳道正常皮膚組，EG?FR/ERK/NF-κB信號通路可能參與了膽脂瘤組織的形成和發(fā)展，在膽脂瘤的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。

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Expression and Significanceof P-EGFR,P-ERK and NF-κB in M idd le Ear Cholesteatoma Epithelium

WANGXiali1,XIEShumin2,WANGYuehui3,LIUWei4,YINTuanfang4,PENGAnquan4,REN Jihao4
1Hunan ProvincialMaternaland Child Health CareHospital,Departmentof PediatricOphthalmology and Otorhinolaryngology,Changsha,Hunan Province,China(410008).
2DepartmentofOtolaryngology-Head and Neck Surgery,TheXiangya Hospital,CentralSouth University,Changsha, Hunan Province,China(410008).
3 DepartmentofOtolaryngology-Head and Neck Surgery,FirstAffiliated HospitalofHenan University of Scienceand Technology,Luoyang,Henan Province,China(471000).
4DepartmentofOtolaryngology-Head and Neck Surgery,The Second Xiangya Hospital,Central South University,Otology Research InstituteofCentral South University,Changsha,Hunan Province,China(410011).

LIUWei Email:lw-007@163.com

ObjectiveTo study the expression of P-EGFR,P-ERK and NF-κB inm iddle ear cholesteatoma epithelium,and explore the potential roles of EGFR/ERK/NF-κB signaling transduction pathway in m iddle ear cholesteatomaepithelialhyperplasia.Methods SP immunohistochem icalassay and Western blotwere used to detect the expression and significance of P-EGFR,P-ERK and NF-κB in 30 casesofm iddle ear cholesteatoma tissue samples and 15 casesof normal ear skin specimens.Results(1)Immunohistochem istry showed P-EGFR was expressed in the cytoplasm and/or membrane of epithelialcells.P-EGFRwas positive in 19 of the 30m iddleear cholesteatoma specimens(63%),compared to 3 of the15 specimens(20%)in the controlgroup(P<0.05).P-ERK expression in cholesteatomawasdetected ata higher rate(21/30,70%)than normalexternalear canalskin(3/15,20%）(P<0.05).NF-κB immunoreactivity was detected in thenucleiofepithelialcellsatahigher rate in cholesteatoma(18/30,60%)than the controlgroup(2/15,13.3%)(P<0.05).Inmiddle ear cholesteatoma epithelium,there was a positive correlation between expression of P-EGFR,P-ERK and NF-κB(P<0.05).(2)Western blotdiscovered that the expression of P-EGFR,P-ERK and NF-κB in cholesteatomawas significantlymore than theamountof expression in skin.ConclusionsTheexpression of P-EGFR,P-ERK and NF-κB in m iddleear cholesteatomawassignificantly higher than normalskin.Activation of EGFR/ERK/NF-κB signaling transduction pathwaymay be involved in the information and developmentofmiddleearcholesteatoma.

Cholesteatoma;M iddle Ear;P-EGFR;P-ERK;NF-κB;EGFR/ERK/NF-κB Signaling Transduction Pathway

R764

A

1672-2922（2017）03-339-6

2017-01-09審核人：翟所強(qiáng)）

10.3969/j.issn.1672-2922.2017.03.013

國家自然科學(xué)基金（項(xiàng)目批準(zhǔn)號：81400457）

王曉麗，碩士研究生，研究方向:耳科學(xué)

劉偉，Email:lw-007@163.com