纖維素酶/稀酸處理法分離毛竹木質(zhì)素

王 健，張秀梅，周亞男

(浙江理工大學(xué), a.材料與紡織學(xué)院；b.生態(tài)染整技術(shù)教育部工程研究中心, 杭州 310018)

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纖維素酶/稀酸處理法分離毛竹木質(zhì)素

王 健，張秀梅，周亞男

(浙江理工大學(xué), a.材料與紡織學(xué)院；b.生態(tài)染整技術(shù)教育部工程研究中心, 杭州 310018)

采用纖維素酶/稀酸處理法從浙江產(chǎn)天然毛竹中分離木質(zhì)素。優(yōu)化毛竹酶解的反應(yīng)條件，并考察不同pH值對(duì)木質(zhì)素產(chǎn)率的影響，確定分離木質(zhì)素的最佳反應(yīng)條件。最佳反應(yīng)條件為：酶解反應(yīng)時(shí)，控制酶/底物比1∶8，底物濃度為0.025 g/mL，反應(yīng)溫度50 ℃下反應(yīng)48 h；稀酸處理時(shí)，pH值為0.82。用紅外光譜(Fourier Transform Infrared Spectroscopy, FT-IR)和核磁共振氫譜(1H Nuclear Magnetic Resonance Spectra,1H-NMR)對(duì)優(yōu)化條件下分離的精煉木質(zhì)素樣品進(jìn)行表征分析，結(jié)果表明：精煉木質(zhì)素具有典型的紫丁香基和愈創(chuàng)木基特征峰，而纖維素、半纖維素及碳水化合物的特征峰含量很小。精煉木質(zhì)素進(jìn)行了化學(xué)成分分析的結(jié)果表明：纖維素酶/稀酸處理法分離的木質(zhì)素與傳統(tǒng)的磨木木質(zhì)素法相比方法相比，純度和產(chǎn)率具有較大提升。

毛竹；木質(zhì)素；酶解；溫和酸解

0 引 言

木質(zhì)素是纖維原料中的主要成分之一，在自然界中含量?jī)H少于纖維素；木質(zhì)素雖然具有儲(chǔ)量高、純天然和可再生等優(yōu)點(diǎn)，但絕大多數(shù)未被充分利用，因此研究木質(zhì)素的化學(xué)組成與結(jié)構(gòu)有利于木質(zhì)素資源的合理開(kāi)發(fā)與利用。木質(zhì)素資源的利用需要原料中的木質(zhì)素高產(chǎn)率、高純度地分離出來(lái)，同時(shí)不破壞木質(zhì)素的原始結(jié)構(gòu)，然而到目前為止，絕大多數(shù)方法都無(wú)法在高產(chǎn)率的基礎(chǔ)上保持結(jié)構(gòu)完整的木質(zhì)素。

縱觀木質(zhì)素分離技術(shù)的發(fā)展歷史，目前常用的方法主要有以下幾種︰克拉森法、堿法、有機(jī)溶劑法、磨木木質(zhì)素法和纖維素酶解法等[1-2]。其中克拉森法、堿法以及多數(shù)有機(jī)溶劑法均在一定程度導(dǎo)致木質(zhì)素結(jié)構(gòu)變化，只能用于對(duì)底物中的木質(zhì)素做定量分析。Holtman[3]發(fā)現(xiàn)磨木木質(zhì)素法大多只能獲得來(lái)自植物包間層的木質(zhì)素產(chǎn)物，因此只能部分代表木質(zhì)素的原始結(jié)構(gòu)，且其產(chǎn)物中往往含有一些碳水化合物雜質(zhì)。酶解木質(zhì)素雖然較好地保留木質(zhì)素的原始結(jié)構(gòu)，但其產(chǎn)物中往往含有一些其他纖維化合物和糖類化合物雜質(zhì)[4]。Luca等[5]采用酶解/溫和酸解的方法得到高純度和高產(chǎn)率的木質(zhì)素產(chǎn)品，得到較高的產(chǎn)率，且去除了產(chǎn)物中大多數(shù)纖維素和糖類化合物雜質(zhì)。

本文參考文獻(xiàn)[6]中的方法，采用纖維素酶/稀酸處理法，探索用該方法從浙江產(chǎn)天然毛竹中分離木質(zhì)素的最佳反應(yīng)方案；分析毛竹粉經(jīng)纖維素酶處理的最佳反應(yīng)條件，優(yōu)化酶解后的毛竹原料被稀酸處理的反應(yīng)條件；進(jìn)一步用FT-IR和1H-NMR對(duì)最終產(chǎn)物木質(zhì)素樣品進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征分析。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

原料：浙江產(chǎn)天然毛竹。

試劑：纖維素酶(參考文獻(xiàn)[7]測(cè)定酶活為6827.53 U/g)，麥克林試劑有限公司；1,4二氧六環(huán)(分析純)、冰醋酸(分析純)、醋酸鈉(分析純)、正己烷(色譜級(jí))，杭州米克化工有限公司。

儀器：行星式球磨機(jī)(QM-QX型，南京萊步科技實(shí)業(yè)有限公司)，熱點(diǎn)式恒溫?fù)u床(YS-100B型，上海姚氏儀器設(shè)備廠)，集熱式恒溫加熱攪拌器(DF-101S型，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RF-02型，上海普渡生化科技有限公司)，傅立葉紅外光譜儀(Nicolet 5700型，美國(guó)熱電公司) ，核磁共振波譜儀(AVANCE AV400MH型，瑞士BRUKER公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 毛竹原料預(yù)處理

將毛竹原料切成小段并去節(jié)，經(jīng)植物粉碎機(jī)粉碎至40目以下后，將樣品經(jīng)丙酮溶劑抽提除去其中的脂肪族化合物，具體方法參考文獻(xiàn)[7]。抽提6 h后，再用行星式球磨機(jī)球磨72 h備用。

1.2.2 纖維素酶酶解

使用纖維素酶在一定條件下處理1.2.1制得的毛竹樣品，改變酶與毛竹原料的質(zhì)量比，加入不同pH值醋酸鹽緩沖溶液，放入恒溫?fù)u床，恒溫反應(yīng)一段時(shí)間。分析不同原料/酶配比、反應(yīng)時(shí)間及反應(yīng)溫度等對(duì)酶解效率的影響。酶水解處理后，用砂芯過(guò)濾器過(guò)濾得到酶解后的產(chǎn)物，用經(jīng)鹽酸調(diào)節(jié)的pH值為2的酸性水溶液洗滌酶解后的毛竹樣品2～3次。然后冷凍干燥36 h，即制備得到酶解處理后的產(chǎn)物。通過(guò)計(jì)算反應(yīng)前后毛竹樣品的質(zhì)量比，計(jì)算酶解率。

1.2.3 溫和稀酸水解

稱取5 g的酶解處理后產(chǎn)物并置于150 mL三口燒瓶中，加入100 mL體積比為4∶1的二氧六環(huán)/蒸餾溶液，采用6 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)將酶解產(chǎn)物至不同pH值，并用含鹽酸的酸性二氧六環(huán)/蒸餾溶液對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行溫和酸處理。反應(yīng)時(shí)整個(gè)裝置置于封閉的充滿氮?dú)獾沫h(huán)境下，在油浴鍋中91 ℃反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后，反復(fù)過(guò)濾反應(yīng)殘?jiān)敝翞V液澄清，收集濾液用碳酸氫鈉調(diào)節(jié)至中性，并將濾液轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，蒸發(fā)溶劑至5 mL后將剩余液體放入2 L pH值為2的酸性蒸餾水溶液。酸析約10 h后，經(jīng)離心、過(guò)濾后，收集木質(zhì)素殘?jiān)?，冷凍干燥，既得最終的纖維素酶/稀酸處理法分離木質(zhì)素。

1.2.4 紅外光譜(FTIR)分析

由于酶解木質(zhì)素和最終的精煉木質(zhì)素均以固體粉末的形式存在，因此針對(duì)酶解木質(zhì)素和精煉木質(zhì)素的紅外光譜分析均采用KBr壓片法進(jìn)行制樣，測(cè)試時(shí)選用儀器為NICOLET5700傅式紅外光譜分析儀，儀器分辨率為0.09 cm-1，取450～3500 cm-1為譜圖的掃描范圍。

1.2.5 核磁氫譜(1H-NMR)分析

測(cè)試選用經(jīng)優(yōu)化后的酶解/溫和酸解法分離的精煉木質(zhì)素進(jìn)行核磁氫譜分析(1H-NMR)。測(cè)試前，將50 mg樣品溶于0.5 mL 氘代二甲基亞砜(DMSO-d6)中，測(cè)試時(shí)用到的儀器是AVANCE AV400MH型核磁共振波譜儀，測(cè)試條件為掃描頻率為400 Hz，氘代二甲基亞砜(DMSO-d6)作為溶劑，四甲基硅烷(TMS)為外表物，整個(gè)測(cè)試在室溫下進(jìn)行。

1.2.6 精煉木質(zhì)素的化學(xué)成分分析

酸不溶木素(克拉森木素)含量的測(cè)定參考GB/T 2677.8-1994。酸溶木素的測(cè)定參考GB/T 10337-1989。而酸溶木質(zhì)素和酸不溶木質(zhì)素的質(zhì)量和與精煉木質(zhì)素的質(zhì)量比即為所得木質(zhì)素的純度。用型號(hào)為Vario MICRO Cube型的有機(jī)元素分析儀對(duì)精煉木質(zhì)素進(jìn)行元素分析，測(cè)試前將精煉木質(zhì)素真空干燥，用電子天平爭(zhēng)取約5 mg的樣品在錫箔紙上進(jìn)行有機(jī)元素分析測(cè)試，統(tǒng)計(jì)C、H、S、N元素含量百分比。測(cè)試時(shí)選用氧氣為燃?xì)?，氦氣為載氣，流速分別控制在25 mL/min和200 mL/min。測(cè)試溫度為1100℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)條件優(yōu)化及產(chǎn)率分析

2.1.1 纖維素酶處理毛竹的反應(yīng)條件優(yōu)化

2.1.1.1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶解效率的影響

表1為底物濃度0.025 g/mL、酶/底物比1∶8、反應(yīng)溫度50 ℃時(shí)不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶解率的影響。表1數(shù)據(jù)表明，隨時(shí)間增加酶解率增加；當(dāng)時(shí)間超過(guò)2 d后，酶解率變化不大，說(shuō)明反應(yīng)2 d后，基本達(dá)到最佳的酶解效果。以下實(shí)驗(yàn)均在酶解時(shí)間2 d條件下進(jìn)行，進(jìn)一步分析其它反應(yīng)條件對(duì)酶解效率的影響。

表1 反應(yīng)時(shí)間酶處理效率的影響

2.1.1.2 酶/底物比對(duì)酶解效率的影響

圖1為底物濃度0.025 g/mL、反應(yīng)時(shí)間2 d、反應(yīng)溫度50 ℃下不同酶/底物比對(duì)酶解率的影響。由圖1可以看出，隨著酶用量的增加，酶解率呈上升趨勢(shì)，但進(jìn)一步增加酶用量，酶解率開(kāi)始降低，其原因可能是反應(yīng)后未被降解的產(chǎn)物附著在原料表面，使酶和原料中的纖維素?zé)o法接觸反應(yīng)而造成的[8]，因此較佳的酶用量為酶/底物比1∶8。

圖1 不同酶 /底物質(zhì)量比對(duì)酶解率的影響

2.1.1.3 溫度及底物濃度對(duì)酶解效率的影響

圖2為底物濃度0.025 g/mL、反應(yīng)時(shí)間2 d、酶/底物比1∶10條件下，不同反應(yīng)溫度對(duì)酶解率的影響。由圖2可以看出，在低于50 ℃時(shí)，隨反應(yīng)溫度增加，酶解率略有波動(dòng)但當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃左右時(shí)酶解率達(dá)到最高，這表明50 ℃是該酶在反應(yīng)體系中活性最高。圖3為反應(yīng)時(shí)間2 d、酶/底物比1∶10、反應(yīng)溫度50 ℃下不同底物濃度對(duì)酶解率的影響。由圖3可以看出，反應(yīng)物濃度達(dá)到0.025 g/mL左右時(shí)酶解率最高，但進(jìn)一步增加反應(yīng)物濃度酶解率沒(méi)有增加，反而有所下降。上述結(jié)果表明，底物濃度需要控制在0.026 g/mL以下，才能得到較高的產(chǎn)率。

圖2 酶解率在不同溫度下的變化趨勢(shì)

圖3 酶解率隨底物濃度的變化趨勢(shì)

通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明毛竹原料酶解的最佳條件為：毛竹原料和酶的質(zhì)量比8∶1,底物濃度為0.025 g/mL，反應(yīng)溫度 50 ℃，時(shí)間控制在48 h。

2.1.2 稀酸處理酶解后的毛竹樣品的反應(yīng)條件優(yōu)化

采用上述最佳酶解條件所獲得酶解木質(zhì)素進(jìn)行溫和酸解實(shí)驗(yàn)，探究酸解過(guò)程中pH值對(duì)木質(zhì)素得率的影響，確定最佳反應(yīng)pH值。圖4是pH值對(duì)得到的產(chǎn)物木質(zhì)素得率的關(guān)系曲線。從圖4中可以看出，隨著pH值降低，產(chǎn)物得率有所提高，最佳pH值為0.82，此條件下木質(zhì)素得率最高(26.64%)。但隨著pH值降低，產(chǎn)物得率下降，其原因可能是在強(qiáng)酸性的條件下，有木質(zhì)素衍生物生成，但在后續(xù)的過(guò)濾、旋轉(zhuǎn)蒸法及提純過(guò)程木質(zhì)素衍生物無(wú)法保留在產(chǎn)物中[9]。

圖4 pH值對(duì)稀酸處理后分離得到的木質(zhì)素得率的影響

2.2 產(chǎn)物表征與分析

2.2.1 FT-IR法對(duì)酶解及酸解后的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)分析

分別對(duì)酶解后的毛竹樣品和稀酸處理后得到的木質(zhì)素樣品進(jìn)行紅外光譜分析，獲得兩種產(chǎn)物的紅外吸收光譜圖(圖5)。酶解處理后的毛竹樣品有芳香環(huán)骨架的特征峰(1613.4、506.4 cm-1)，甲基、亞甲基和次甲基 C-H 伸縮振動(dòng)的特征峰(2920.4 cm-1)，羥基O-H的伸縮振動(dòng)峰(3405.7 cm-1)，紫丁香基環(huán)中 C=O 伸縮振動(dòng)(1327.5 cm-1)。與酶解處理后的毛竹樣品相比，纖維素酶/稀酸處理法得到的木質(zhì)素樣品除具有芳香環(huán)骨架的特征峰1599.2、1508.6 cm-1和1262.0 cm-1，羥基O-H的伸縮振動(dòng)峰3425.2 cm-1，甲基、亞甲基和次甲基 C-H 伸縮振動(dòng)的特征峰2930.9 cm-1和2849.4 cm-1，紫丁香基中 C=O 伸縮振動(dòng)峰(1329.4 cm-1)和共軛羰基中 C-H 變形振動(dòng)峰(1123.0 cm-1)，以及愈創(chuàng)木基特征峰1329.4、1033.5、832.1 cm-1[10]，從圖5中看出，較強(qiáng)的紫丁香基和愈創(chuàng)木基結(jié)構(gòu)單元的特征吸收峰。上述結(jié)果顯示本纖維素酶/稀酸處理法獲得木質(zhì)素樣品較好地保留毛竹原料的原始結(jié)構(gòu)。

a.酶解后毛竹樣品； b.酸處理后的精煉木質(zhì)素圖5 經(jīng)酶解及稀酸處理后樣品的紅外光譜圖

2.2.21H-NMR法對(duì)稀酸處理后木質(zhì)素產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的分析

纖維素酶/稀酸處理法得到的木質(zhì)素樣品的1H-NMR譜圖如圖6所示，圖中，δ=2.5 ppm為溶劑(DMSO-d6)的溶劑峰，δ=0.7～1.8 ppm為脂肪族質(zhì)子峰，δ=3.71 ppm為甲氧基的質(zhì)子峰，脂肪族質(zhì)子和質(zhì)子譜峰最大，其在整個(gè)分離的木質(zhì)素中含量最高。愈瘡木基單元和紫丁香基單元苯環(huán)上質(zhì)子的吸收峰分別體現(xiàn)在圖6中δ=6.92 ppm和δ=7.75 ppm處，這表明木質(zhì)素主要以甲氧基和愈瘡木基組成，同時(shí)含有紫丁香基結(jié)構(gòu)單元，木質(zhì)素結(jié)構(gòu)得到很好的保留。而δ=0.98 ppm為纖維素和半纖維素及一些碳水化合物的特征峰，其峰面積很小，因此該方法分離的木質(zhì)素純度很高。

圖6 精煉木質(zhì)素的1H-NMR譜圖

2.2.3 精煉木質(zhì)素的化學(xué)成分分析

將精制木質(zhì)素的純度和元素分析結(jié)果與常用的磨木木質(zhì)素的相應(yīng)成分進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，用纖維素酶/稀酸處理法所得的精煉木質(zhì)素純度和得率均有較大提高，其原因?yàn)橛迷摲椒ǚ蛛x的木質(zhì)素，既可以在保證整個(gè)實(shí)驗(yàn)條件溫和的條件下不破壞木質(zhì)素的原始結(jié)構(gòu)，又可以通過(guò)纖維素酶處理有效的去除木質(zhì)素與纖維素、半纖維素和碳水化合物的結(jié)構(gòu)連接，進(jìn)而提高木質(zhì)素的純度和產(chǎn)率。元素分析可以顯示：用纖維素酶/稀酸處理法所得的精煉木質(zhì)素的氮含量相對(duì)較高，但含量保持在0.5 %以下，并不會(huì)影響對(duì)其化學(xué)結(jié)構(gòu)的分析。

表2 精煉木質(zhì)素的化學(xué)成分 %

3 結(jié) 論

a)在選用酶活為6827.53 U/g的纖維素酶作為酶解劑、pH值為4.5的醋酸鹽緩沖液的條件下，酶和原料竹粉的質(zhì)量比為1∶8，底物濃度為0.025 g/mL，在50 ℃下恒溫?fù)u床中反應(yīng)48 h，此時(shí)的酶解率最高，為27.94 %。

b)在對(duì)酶解木質(zhì)素進(jìn)行溫和酸解的過(guò)程中，反應(yīng)最佳pH值為0.82，此條件下木質(zhì)素得率最高，為26.64 %。

c)對(duì)精煉木質(zhì)素進(jìn)行FT-IR和1H-NMR分析，發(fā)現(xiàn)該毛竹木質(zhì)素具有典型的紫丁香基和愈創(chuàng)木基，甲氧基等木質(zhì)素結(jié)構(gòu)中的特征峰，纖維素，半纖維素及碳水化合物的含量很少，說(shuō)明用本試驗(yàn)方法分離的毛竹精煉木質(zhì)素較好地保持原有毛竹原料的原始結(jié)構(gòu)。

d)對(duì)精煉木質(zhì)素進(jìn)行化學(xué)成分分析，發(fā)現(xiàn)相較于傳統(tǒng)的磨木木質(zhì)素，纖維素酶/稀酸處理法所得的精煉木質(zhì)素純度和得率均有較大提高。雖然元素分析顯示精煉木質(zhì)素中的氮含量相對(duì)較高，但并不會(huì)影響對(duì)其化學(xué)結(jié)構(gòu)的分析。

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(責(zé)任編輯： 廖乾生)

Isolation of Lignin from Bamboo by the Method of Cellulase/Hydrolysis-Mild Acidolysis

WANGJian,ZHANGXiume,ZHOUYanan

(a. College of Materials and Textiles; b. Engineering Research Center for Eco-Dyeing & Finishing of Textiles,Ministry of Education, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China)

Lignin from Zhejiang bamboo was isolated by the method of cellulose/hydrolysis-mild acidolysis. The reaction conditions of enzymatic hydrolysis process were optimized, and the effect of different pH on the lignin yield was also investigated. Finally, the best experiment condition was acquired, namely reaction temperature 50℃, the ratio of enzyme to substrate 1:8, substrate concentration 0.025 g/mL, reaction time 48h, pH 0.82. The lignin samples were characterized by FT-IR spectroscopy and1H-NMR analysis. The results show that bamboo lignin contained has typical characteristic peaks of syringyl and guaiacyl, while the characteristic peaks of cellulose, hemicellulose and carbohydrates are seldom seen. The chemical constituents of lignin separated by this method were analyzed. The results show that compared with traditional method MWL (milled wood lignin), the lignin isolated by the method of cellulose/hydrolysis-mild acidolysis has higher purity and yield.

bamboo; lignin; enzymatic hydrolysis; mild acidolysis

10.3969/j.issn.1673-3851.2017.05.011

2016-09-27 網(wǎng)絡(luò)出版日期： 2017-03-28

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(LY14C16004)

王 健(1990-)，黑龍江鶴崗人，男，碩士研究生，主要從事木質(zhì)素的分離、降解及其結(jié)構(gòu)方面的研究。

張秀梅，E-mail：xiumei@zstu.edu.cn

O636.2

A

1673- 3851 (2017) 03- 0371- 05