3 種高溫大曲發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)演替規(guī)律

黃魏，李浪金，謝丹，吳成，程平言，張健，尤小龍，胡峰

（貴州習(xí)酒股份有限公司，貴州 習(xí)水 564622）

高溫大曲是醬香白酒的糖化發(fā)酵劑，是保證其質(zhì)量和風(fēng)格的關(guān)鍵，高溫大曲制作過(guò)程采用自然固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵倉(cāng)內(nèi)不同部位溫度、水分等存在差異，導(dǎo)致安曲曲坯在入倉(cāng)發(fā)酵后產(chǎn)生黃曲、白曲、黑曲3 種形態(tài)。入倉(cāng)堆積于中層，溶氧較好易形成黃曲；入倉(cāng)堆積于中下層，溶氧少，濕氣重，水分大，熱曲時(shí)間長(zhǎng)則易形成黑曲；入倉(cāng)堆積于上層，水分揮發(fā)快，熱曲時(shí)間短則易形成白曲[1]，3 種大曲在生產(chǎn)中自然形成的比例約為黃曲88%，白曲9%，黑曲3%[2]，3 種大曲發(fā)酵過(guò)程動(dòng)態(tài)變化如圖1 所示。

圖1 黃曲、白曲、黑曲發(fā)酵過(guò)程動(dòng)態(tài)變化Fig.1 Characteraction during fermentation process of yellow Daqu，white Daqu and black Daqu

近年來(lái)，針對(duì)3 種高溫大曲的差異研究陸續(xù)見(jiàn)報(bào)道，班世棟等[3]研究了不同顏色大曲酶活差異，發(fā)現(xiàn)白曲的液化酶、糖化酶、酸性蛋白酶和脂肪酶活力相對(duì)較高，黑曲的中性和堿性蛋白酶、纖維素酶和果膠酶活力較高，黃曲酶活力介于兩者之間。Deng 等[4]研究了不同顏色高溫大曲的差異：白曲表現(xiàn)出更高的蛋白酶活性和更低的酸度，黃曲糖化率最高，酯化率最低；功能預(yù)測(cè)表明，白曲和黃曲中編碼細(xì)菌酶的基因豐度較高，與白曲（59%）和黃曲（87%）中Kroppenstedtia 豐度較高有關(guān)，黑曲Thermomyces 豐度最高（80%）導(dǎo)致編碼真菌酶的基因豐度最高。張巧玲等[5]基于18 種游離氨基酸建立拆倉(cāng)的白曲、黃曲、黑曲判別模型，提供了新的醬香型大曲類(lèi)型判別方法。陳良強(qiáng)等[6]研究了出倉(cāng)白曲（20 個(gè)）、出倉(cāng)黃曲（21 個(gè)）、成品曲（113 個(gè)），結(jié)果表明微生物群落結(jié)構(gòu)信息與3 種典型曲種具有強(qiáng)關(guān)聯(lián)性并以此為依據(jù)建立了高溫大曲類(lèi)別判別模型。柳習(xí)月等[7]利用多組學(xué)技術(shù)對(duì)黃曲、白曲、黑曲進(jìn)行解析，明確了不同曲種中微生物、代謝物的組成及差異，揭示了微生物以及代謝物之間的關(guān)聯(lián)性。Gan 等[8]對(duì)半成品曲（黃曲、白曲）微生物組成進(jìn)行研究，填補(bǔ)了成熟大曲微生物群中間階段的研究空白，同時(shí)對(duì)比分析了半成品曲和成品曲在微生物組成和功能方面的差異，揭示了茅臺(tái)大曲微生物群落與功能特性關(guān)系。

3 種高溫大曲具備不同功能，對(duì)醬香白酒生產(chǎn)都有重要意義，目前業(yè)界對(duì)3 種高溫大曲的研究主要集中在其發(fā)酵結(jié)束階段，即半成品曲之間的差異，但由于3 種大曲在發(fā)酵之初就已形成差異，因此，本研究首次采用可培養(yǎng)結(jié)合未培養(yǎng)方法，深入解析黃曲、白曲、黑曲細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)演替規(guī)律，同時(shí)探究物種相關(guān)性和理化因子對(duì)菌群結(jié)構(gòu)多樣性的貢獻(xiàn)，從內(nèi)在和外在初步揭示細(xì)菌菌群演替的驅(qū)動(dòng)因素和調(diào)控機(jī)制，為保障3種高溫大曲產(chǎn)量連續(xù)性，提高制曲優(yōu)質(zhì)品率提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品的采集與保存

樣品采集自貴州習(xí)酒股份有限公司制曲車(chē)間，壓制成型的曲坯作為安曲樣品（發(fā)酵第0 天，直接取500 g作為一個(gè)樣品），分別于一次翻曲（發(fā)酵第8 天）、二次翻曲（發(fā)酵第14 天）、拆曲（發(fā)酵第39 天）各采集3 塊黃曲，粉碎混勻后取500 g，白曲、黑曲樣品采集方式參照黃曲，同時(shí)對(duì)樣品進(jìn)行編號(hào)：AQ 代表安曲；YF-Y 代表一次翻曲黃曲，EF-Y 代表二次翻曲黃曲，CQ-Y 代表拆曲黃曲；YF-W 代表一次翻曲白曲，EF-W 代表二次翻曲白曲，CQ-W 代表拆曲白曲；YF-B 代表一次翻曲黑曲，EF-B 代表二次翻曲黑曲，CQ-B 代表拆曲黑曲，以上共計(jì)10 個(gè)樣品，于-80 ℃冰箱中密封保存、備用。

1.1.2 試劑

孟加拉紅培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；WL 培養(yǎng)基：上海博微生物科技有限公司；E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit 試劑盒：美國(guó)OMEGA BioTek 公司；Qubit3.0 DNA 檢測(cè)試劑盒：美國(guó)Life Invitrogen 公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物：上海翌圣生物科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

無(wú)菌操作臺(tái)（SW-CJ-2F）：蘇州凈化設(shè)備有限公司；自動(dòng)蒸汽滅菌器（KG-AP32L）：日本ALP 公司；電泳儀（DYCZ-21）：北京市六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng)（FR-1000）：上海復(fù)日科技有限公司；Qubit3.0 熒光定量?jī)x：美國(guó)Life Invitrogen 公司；PCR 儀（ETC811）：北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 可培養(yǎng)細(xì)菌分離篩選、鑒定

稱(chēng)取10 g 樣品于90 mL 無(wú)菌水中，150 r/min 振蕩30 min 得到10-1原液，然后吸取1 mL 加入9 mL 無(wú)菌水中得到10-2樣液，進(jìn)一步梯度稀釋為10-3、10-4，取10-2、10-3、10-4涂布，每個(gè)梯度3 個(gè)平行，37 ℃靜置培養(yǎng)2 d，挑取每個(gè)培養(yǎng)皿上不同形態(tài)的菌落劃線(xiàn)分離，得到純種菌株，每種形態(tài)采用甘油管平行保藏3 株，選取代表菌株送生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行分子鑒定，測(cè)序結(jié)果運(yùn)用美國(guó)生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI） 數(shù)據(jù)庫(kù)的堿基局部對(duì)準(zhǔn)檢索工具（Basic Local Alignment Search Tool，BLAST）進(jìn)行序列比對(duì)。

1.3.2 樣品DNA 提取、測(cè)序及生物信息學(xué)分析

總DNA 提取及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）：采用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit試劑盒提取樣本總DNA，具體操作流程見(jiàn)試劑盒說(shuō)明。引物341F （5＇-CCTACGGGMSGCAGCAG-3＇）和805R（5＇-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3＇），PCR 擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性20 s；55 ℃退火20 s；72 ℃延伸30 s；25 次循環(huán)；72 ℃終延伸5 min 降至4 ℃。PCR 反應(yīng)體系：2×HieffR Robust PCR Master Mix 15 μL，正向及反向引物各1 μL，DNA 模板20～30 ng，使用ddH2O 補(bǔ)齊體系至30 μL。

測(cè)序：使用Illumina MiseqTM測(cè)序平臺(tái)，分別對(duì)細(xì)菌16S rRNA 基因V3～V4 區(qū)進(jìn)行高通量測(cè)序。

物種注釋?zhuān)合聶C(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)預(yù)處理得到有效序列，按照97%相似性對(duì)非重復(fù)序列（不含單序列）進(jìn)行操作分類(lèi)單元（Operational Taxonomic Units，OTU）聚類(lèi)，在聚類(lèi)過(guò)程中去除嵌合體，得到OTU 代表序列，采用核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)（ribosomal database project，RDP）完成比對(duì)。

多樣性分析：用chao1 算法估計(jì)群落中含OTU 數(shù)目的指數(shù)；用Shannon、Simpson 指數(shù)估算樣品中微生物多樣性。用Coverage 表征各樣品文庫(kù)覆蓋率，反映測(cè)序結(jié)果是否代表樣本的真實(shí)情況[9]。

1.3.3 理化指標(biāo)檢測(cè)

大曲溫度測(cè)量方式為取樣時(shí)將特制溫度計(jì)插入曲坯中心，待溫度穩(wěn)定后讀取、記錄數(shù)據(jù)；還原糖采用斐林法[10]測(cè)定；酸度、水分、糖化力參考QB/T 4257—2011《釀酒通用大曲分析方法》進(jìn)行測(cè)定[11]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.1 物種間相關(guān)性分析

選取所有樣品中屬水平相對(duì)豐度≥1 %的物種，采用SPSS24.0 軟件計(jì)算Spearman 相關(guān)性系數(shù)，選擇顯著性p＜0.05 的物種，采用Cytoscape5.0 軟件繪制相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4.2 冗余分析（redundancy analysis，RDA）

采用理化指標(biāo)與所有樣品中屬水平相對(duì)豐度排名前10 的優(yōu)勢(shì)物種豐度數(shù)據(jù)，使用Canoco5.0 軟件進(jìn)行RDA 分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 3 種高溫大曲發(fā)酵過(guò)程可培養(yǎng)細(xì)菌差異性

3 個(gè)曲種發(fā)酵過(guò)程共分離篩選到8 個(gè)屬的12 種細(xì)菌，共保藏132 株，其中，發(fā)酵初始階段即安曲樣品共分離篩選到4 種細(xì)菌，黃曲發(fā)酵過(guò)程共分離篩選到7 種細(xì)菌，白曲發(fā)酵過(guò)程共分離篩選到6 種細(xì)菌，黑曲發(fā)酵過(guò)程共分離篩選到8 種細(xì)菌，見(jiàn)表1。

表1 可培養(yǎng)細(xì)菌來(lái)源及形態(tài)Table 1 Source and morphology of culture-dependent bacteria

由表1 可知，分布頻率較高的菌種有Bacillus amyloliquefaciens、Bacilluslicheniformis、Virgibacillusnecropolis、Kroppenstedtiasp.，尤其是Bacillusamyloliquefaciens，在所有曲種每個(gè)發(fā)酵階段均有檢出，Bacillus屬細(xì)菌可以產(chǎn)生淀粉酶、糖化酶以及吡嗪等風(fēng)味物質(zhì)[12-14]。僅在安曲樣品篩選到的可培養(yǎng)細(xì)菌有Staphylococcus gallinarum、Weissella confusa，僅在黃曲發(fā)酵過(guò)程篩選到的菌有Bacillus subtilis，研究報(bào)道黃曲糖化率高[4]，可能與Bacillus subtilis 產(chǎn)淀粉酶和糖化酶有關(guān)，僅在黑曲發(fā)酵過(guò)程篩選到的有Staphylococcus saprophyticus、Micrococcus sp.，Staphylococcus 作為大曲樣品中的可培養(yǎng)核心細(xì)菌，具有可耐受高酸、高乙醇等特性[15]，而白曲發(fā)酵過(guò)程未分離篩選到特有菌種，整體而言，黃曲和黑曲發(fā)酵過(guò)程的可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性高于白曲。

2.2 3 種高溫大曲發(fā)酵過(guò)程未培養(yǎng)細(xì)菌差異性

2.2.1 α 多樣性

本次測(cè)序共檢出307 869 條有效序列，共檢出15 個(gè)門(mén)、44 個(gè)綱、84 個(gè)目、157 個(gè)科、276 個(gè)屬、404 個(gè)種的細(xì)菌，α 多樣性指數(shù)見(jiàn)表2。

樣品文庫(kù)的覆蓋率均達(dá)到99.8%以上，表明此次測(cè)序結(jié)果足以代表樣本真實(shí)情況。由表2 可知，白曲Chao1 指數(shù)低于黃曲和黑曲，說(shuō)明白曲物種豐富度低于黃曲和黑曲。黃曲和黑曲Simpson 指數(shù)和Shannon指數(shù)呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化，說(shuō)明黃曲和黑曲發(fā)酵過(guò)程中其微生物多樣性發(fā)生了較大的演變。白曲Simpson 指數(shù)呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，Shannon 指數(shù)呈現(xiàn)減少趨勢(shì)，說(shuō)明隨著發(fā)酵進(jìn)行白曲細(xì)菌多樣性不斷減少。AQ 樣品Shannon 指數(shù)最低，Simpson 指數(shù)最高，其微生物多樣性最低。

2.2.2 細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)多樣性

屬水平相對(duì)豐度見(jiàn)圖2。

圖2 屬水平相對(duì)豐度圖Fig.2 Plot of relative abundance at genus level

安曲曲坯微生物主要來(lái)源于母曲、原料等[16]，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌有Weissella （93.06%）、Kroppenstedtia （2.17%）、Enterobacter（2.00%），其中，Weissella 是絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌，周天慈等[17]研究中高溫大曲微生物來(lái)源時(shí)也發(fā)現(xiàn)，該曲種在發(fā)酵開(kāi)始階段Weissella 是主要細(xì)菌，并且初步探明了在該生產(chǎn)工藝下，Weissella 主要來(lái)源于室內(nèi)草席，值得一提的是，Weissella 在黃曲和黑曲后續(xù)發(fā)酵階段均未呈現(xiàn)優(yōu)勢(shì)，表明Weissella 菌屬可能并非這兩種曲形成的關(guān)鍵微生物。

黃曲發(fā)酵前期的優(yōu)勢(shì)菌屬主要為Kroppenstedtia、Arthrobacter、Bacillus、Thermoactinomyces、Saccharopolyspora 以及Virgibacillus，發(fā)酵中期由Saccharopolyspora、Bacillus、norank_Bacteria、Pantoea、Kroppenstedtia、Thermoactinomyces 替代，發(fā)酵后期的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬為Kroppenstedtia，豐度達(dá)到90%以上，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，Kroppenstedtia 菌屬耐熱能力強(qiáng)，在高溫大曲中經(jīng)常被檢測(cè)到，但針對(duì)其發(fā)酵特性研究較少，需進(jìn)一步揭示[18]，而Saccharopolyspora 在黃酒麥曲中作為優(yōu)勢(shì)菌屬被報(bào)道，麥曲發(fā)酵最高溫度能達(dá)到50 ℃～60 ℃，表明該菌屬能在極端環(huán)境下以芽孢的方式生存[19]。白曲發(fā)酵初期 以 Bacillus、Saccharopolyspora、Lactobacillus、Weissella、Thermoactinomyces、Kroppenstedtia 為主，發(fā)酵中期演替為Bacillus、Saccharopolyspora、Weissella、Lactobacillus、Thermoactinomyces、Pantoea、Kroppenstedtia，而其發(fā)酵后期則由Thermoactinomyces、Bacillus、Psychrobacter、Acinetobacter 主導(dǎo)，Thermoactinomyces 菌屬的微生物具有較好的耐高溫特性，常在高溫大曲中檢出，如Thermoactinomyces daqus 分泌的高溫蛋白酶對(duì)大曲原料降解及大曲特征風(fēng)味前體物質(zhì)的形成具有潛在價(jià)值[20-21]。黑曲發(fā)酵過(guò)程中，norank_Bacteria、Arthrobacter、Kroppenstedtia、Bacillus 是發(fā)酵初期的優(yōu)勢(shì)微生物，發(fā)酵中期優(yōu)勢(shì)菌群為Saccharopolyspora、Bacillus，而發(fā)酵后期Thermoactinomyces、Arthrobacter、Acinetobacter 成為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，Li 等[22]研究茅臺(tái)大曲中心黑色部分的細(xì)菌結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，排名前三的種分別是Bacillus sp.（45%）、Thermoactinomyces sp.（24%） 以及Saccharopolyspora sp.（21%），在本研究中，這3 個(gè)屬的微生物豐度也占了相當(dāng)大一部分比例，與該研究相似。

2.3 可培養(yǎng)與未培養(yǎng)方法結(jié)果比較

未培養(yǎng)測(cè)序技術(shù)具有快速分析鑒定樣本中微生物群落組成的能力，特別是小類(lèi)菌群的組成，可培養(yǎng)方法能夠獲得實(shí)體菌株，其可作為后續(xù)研究的物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究通過(guò)未培養(yǎng)方法檢測(cè)到的豐度排名前十的菌屬為Kroppenstedtia、Weissella、Saccharopolyspora、Thermoactinomyces、Bacillus、Arthrobacter、norank_Bacteria、Lact-obacillus、Psychrobacter、Pantoea，可培養(yǎng)方法分離篩選到的優(yōu)勢(shì)菌屬有Kroppenstedtia、Weissella、Bacillus、Staphylococcus、Pseudomonas、Virgibacillus、Caldibacill-us、Micrococcus，兩種方法均檢測(cè)到了Kroppenstedtia、Weissella、Bacillus，但是可培養(yǎng)方法并未篩選得到未培養(yǎng)檢測(cè)到的其他優(yōu)勢(shì)菌屬，是由于可培養(yǎng)方法存在工作量大、篩選不徹底等局限性，但就目前而言，可培養(yǎng)方法依然是獲得實(shí)體菌株并研究其生長(zhǎng)代謝特征不可或缺的手段，兩種方法聯(lián)用能夠優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，更全面解析菌群結(jié)構(gòu)多樣性及其功能。

2.4 優(yōu)勢(shì)物種相關(guān)性

細(xì)菌屬水平相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖見(jiàn)圖3。

圖3 細(xì)菌屬水平相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Horizontal correlation map of bacteria at genus level

由圖3 可知，24 個(gè)菌屬間存在74 個(gè)正相關(guān)，9 個(gè)負(fù)相關(guān)關(guān)系，絕大多數(shù)細(xì)菌為正相關(guān)關(guān)系。其中，Weissella、Pediococcus 與其他菌屬間只存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，尤其是Weissella，與Arthrobacter 呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，Arthrobacter 在黃曲（23.58%）和黑曲（10.27%）發(fā)酵初始階段均作為優(yōu)勢(shì)菌存在，但在白曲發(fā)酵初期其豐度接近于零，這可能是Weissella 生長(zhǎng)受到Arthrobacter 的抑制，并未在黃曲和黑曲發(fā)酵過(guò)程保持其生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的原因。

Psychrobacter 與Thermoactinomyces 為正相關(guān)關(guān)系，兩者在白曲發(fā)酵過(guò)程中，豐度均呈現(xiàn)逐漸增長(zhǎng)的趨勢(shì)，最終形成了以這兩種菌屬為優(yōu)勢(shì)的白曲菌群結(jié)構(gòu)（豐度之和達(dá)到65.11%）；黑曲發(fā)酵過(guò)程中，Arthrobacter與Thermoactinomyces 間的顯著正相關(guān)關(guān)系，可能驅(qū)動(dòng)黑曲最終形成以Arthrobacter 與Thermoactinomyces 為主導(dǎo)（豐度之和達(dá)到73.67%）的菌群結(jié)構(gòu)，而黃曲發(fā)酵過(guò)程的優(yōu)勢(shì)菌屬Kroppenstedtia 與任何一種細(xì)菌間無(wú)顯著相關(guān)性，可能是由于黃曲發(fā)酵的環(huán)境因子更適合該菌屬的生長(zhǎng)，最終黃曲形成以該菌做為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌的菌群結(jié)構(gòu)。

2.5 優(yōu)勢(shì)物種與理化指標(biāo)RDA 分析

理化指標(biāo)結(jié)果見(jiàn)表3。優(yōu)勢(shì)物種與理化因子RDA分析圖見(jiàn)圖4。

表3 理化指標(biāo)Table 3 Physicochemical index

圖4 優(yōu)勢(shì)物種與理化因子RDA 分析圖Fig.4 RDA analysis diagram of dominant genus and physicochemical factors

利用冗余分析（RDA）探究理化因子對(duì)優(yōu)勢(shì)物種的影響，結(jié)果表明，Kroppenstedtia 與水分呈顯著負(fù)相關(guān)，較低的水分含量有利于該菌生長(zhǎng)，結(jié)合黃曲發(fā)酵過(guò)程來(lái)看，隨著發(fā)酵進(jìn)行水分逐漸降低，Kroppenstedtia 豐度逐漸升高，最終成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌；Saccharopolyspora、Bacillus 與溫度和糖化力呈正相關(guān)，該研究結(jié)論與左乾程等[23]研究機(jī)械化制曲過(guò)程中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)演替的結(jié)論一致，大曲淀粉轉(zhuǎn)化力通常用糖化力和液化力來(lái)衡量，Bacillus、Saccharopolyspora 與糖化力的正相關(guān)關(guān)系暗示了這兩種微生物能產(chǎn)生糖化酶，而B(niǎo)acillus 在白曲發(fā)酵前期、中期作為優(yōu)勢(shì)菌存在，這可能是白曲糖化力要高于黃曲和黑曲的主要原因[24]；Thermoactinomyces 與酸度呈顯著正相關(guān)，與水分含量呈負(fù)相關(guān)，結(jié)合理化指標(biāo)來(lái)看，黑曲在發(fā)酵前期和中期酸度高于其余兩種大曲，相對(duì)較高的酸度為該菌屬提供了適宜的生長(zhǎng)環(huán)境，這可能是該菌屬最終在黑曲發(fā)酵結(jié)束形成優(yōu)勢(shì)的原因。Weissella 與酸度呈顯著負(fù)相關(guān)，表明酸度過(guò)大會(huì)抑制其生長(zhǎng)，這就解釋了Weissella 在安曲階段是優(yōu)勢(shì)菌，但是隨著發(fā)酵進(jìn)行，曲坯酸度上升，該菌屬相對(duì)豐度銳減。

3 討論與結(jié)論

高溫大曲生產(chǎn)采用開(kāi)放式自然發(fā)酵，許多不可控的內(nèi)生環(huán)境因子會(huì)影響其微生物菌群結(jié)構(gòu)[25]，而不同的微生物菌群結(jié)構(gòu)代謝特征差異大，因此采用可培養(yǎng)結(jié)合未培養(yǎng)方法，具有很好的互補(bǔ)性，兩種技術(shù)聯(lián)用解析菌群結(jié)構(gòu)與功能特性更全面[26]。本研究中，可培養(yǎng)及未培養(yǎng)結(jié)果均表明，相對(duì)于黃曲和黑曲而言，白曲細(xì)菌多樣性低，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性高，這與Wang 等[27]研究不同類(lèi)型成品曲的細(xì)菌結(jié)構(gòu)得出的結(jié)論一致。

值得一提的是，在本研究中，一是無(wú)論是可培養(yǎng)還是未培養(yǎng)方法檢測(cè)到的初始階段的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌Weissella，在后續(xù)發(fā)酵過(guò)程并未一直延續(xù)其生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，而未培養(yǎng)方法檢測(cè)到部分初始豐度極低的細(xì)菌反而隨著發(fā)酵進(jìn)程不斷富集，在發(fā)酵結(jié)束成為了主導(dǎo)微生物，例如黃曲中的Kroppenstedtia；白曲中的Thermoactinomyces、Psychrobacter；黑曲中的Thermoactinomyces、Arthrobacter，上述特征性差異為3 種高溫大曲的最終判別提供了新的借鑒。二是某些細(xì)菌在安曲環(huán)節(jié)并未檢出但在后續(xù)發(fā)酵過(guò)程中檢出，例如可培養(yǎng)細(xì)菌Bacillus subtilis，Virgibacillus necropolis 等，未培養(yǎng)檢測(cè)中安曲階段豐度為零，但在后續(xù)發(fā)酵過(guò)程檢出，有的甚至在某一階段形成絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，例如Psychrobacter 在白曲拆曲，norank_Bacteria 在黑曲一次翻曲，這部分細(xì)菌的來(lái)源及其作用，有進(jìn)一步研究的價(jià)值。

物種相關(guān)性分析結(jié)果表明，大部分細(xì)菌之間存在正相關(guān)關(guān)系，少部分細(xì)菌之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，發(fā)酵過(guò)程中微生物間存在的共生、競(jìng)爭(zhēng)及拮抗等關(guān)系，形成了復(fù)雜的相互調(diào)控機(jī)制控制著微生物間的此消彼長(zhǎng)，而冗余分析則進(jìn)一步揭示了理化因子對(duì)不同大曲細(xì)菌結(jié)構(gòu)的重要影響：黃曲發(fā)酵結(jié)束時(shí)的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌Kroppenstedtia 與水分呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)；Bacillus 在白曲前兩個(gè)發(fā)酵階段都作為優(yōu)勢(shì)菌存在，該菌與糖化力呈正相關(guān)，這可能是導(dǎo)致白曲糖化力較高的原因；而黑曲發(fā)酵后期的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌Thermoactinomyces 則與酸度呈正相關(guān)，與水分呈負(fù)相關(guān)。最新研究表明，理化性質(zhì)和代謝圖譜可明確區(qū)分3 種不同類(lèi)型的高溫大曲[28]，在此基礎(chǔ)上，以該類(lèi)研究為參考，結(jié)合代謝組學(xué)技術(shù)明晰發(fā)酵過(guò)程微生物菌群與發(fā)酵環(huán)境、代謝產(chǎn)物的關(guān)系，進(jìn)一步明晰3 種高溫大曲形成的驅(qū)動(dòng)因素，保證不同曲種的產(chǎn)量和質(zhì)量奠定理論基礎(chǔ)是今后的主要研究方向。