酪氨酸激酶3對赫賽汀耐藥的卵巢癌細胞株SKOV3/H增殖和成瘤能力的影響

耿介

（鄭州大學第二附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科，河南 鄭州 450014）

酪氨酸激酶3對赫賽汀耐藥的卵巢癌細胞株SKOV3/H增殖和成瘤能力的影響

耿介

（鄭州大學第二附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科，河南 鄭州 450014）

目的探索erb-b2受體酪氨酸激酶3（HER-3）對卵巢癌耐藥細胞株SKOV3/H的體外增殖和體內(nèi)成瘤能力的影響。方法采用赫賽汀濃度遞增法構建SKOV3耐藥細胞株（赫賽汀起始濃度為5 mg/L，經(jīng)5～8次濃度遞增，每次提高50%）。實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測HER-3在15對非耐藥卵巢癌組織和耐藥卵巢癌組織中的表達（SKOV3和SKOV3/H細胞中的表達）。MTT實驗驗證分別轉染sh-HER-3及其對照質(zhì)粒vector對SKOV3/H細胞增殖能力的影響。將包含sh-HER-3的重組慢病毒質(zhì)粒及其陰性對照慢病毒空載體質(zhì)粒vector（均帶egfp熒光標簽）分別以病毒/細胞數(shù)量=15的比例感染SKOV3/H細胞，加入2.0 μg/ml的嘌呤霉素篩選，構建穩(wěn)定轉染sh-HER-3或vector的SKOV3/H細胞，將2株細胞分別注射到裸鼠皮下，復制卵巢癌裸鼠移植瘤模型，觀察體內(nèi)成瘤情況。結果成功構建卵巢癌SKOV3耐赫賽汀細胞株SKOV3/H，且SKOV3/H的群體倍增時間為SKOV3細胞的1.4～1.9倍。HER-3在耐藥卵巢癌組織中的表達水平高于非耐藥癌組織（P<0.05），且HER-3在耐藥細胞株SKOV3/H中的表達水平也高于非耐藥卵巢癌細胞株SKOV3（P<0.05）。轉染sh-HER-3后，SKOV3/H細胞的增殖能力低于陰性對照組（P<0.05）。轉染sh-HER-3后，耐藥細胞株SKOV3/H的裸鼠體內(nèi)成瘤能力降低（P<0.05）。結論HER-3參與卵巢癌的赫賽汀耐藥，并正向影響耐藥細胞株SKOV3/H的增殖和體內(nèi)成瘤能力。

卵巢癌；赫賽汀耐藥；HER-3；增殖；體內(nèi)成瘤

Abstract:ObjectiveTo explore the role of HER-3 in ovarian cancer and Herceptin resistant ovarian cancer,and the effect of HER-3 on the proliferation abilities in vitro and tumorigenicity abilities in vivo of Herceptin-resistant ovarian cancer cell SKOV3/H.MethodsHerceptin concentration was gradually increased to construct resistant cell lines (C0=5 mg/L,increased 5 to 8 times,each time increased by 50%).qRT-PCR was used to detect the expression of HER-3 in 15 pairs of ovarian cancer tissues which were non-resistant or resistant to Herceptin,and the expression of HER-3 in SKOV3 and SKOV3/H cells.MTT experiment was used to detect the proliferation of SKOV3/H after infected with sh-HER-3 or vector.KOV3/H cells infected with sh-HER-3 or vector were subcutaneously injected into nude mice to build the ovarian cancer xenografts.Tumor formation was observed in vivo situation.ResultsSuccessfully constructed the Herceptin-resistant ovarian cancer cell line SKOV3/H,the Td of SKOV3/H was 1.4 to 1.9 times of SKOV3.The expression levels of HER-3 was significantly higher in Herceptin resistant ovarian cancer tissues(P<0.05),and HER-3 expression levels were also significantly higher in SKOV3/H cells (P<0.05).After transfected with sh-HER-3,theproliferation and tumorigenicity abilities of SKOV3/H were significantly lower than vector group(P<0.05).The tumorigenicity ability of SKOV3/H in mice was significantly reduced (P<0.05).ConclusionsHER-3 is involved in the Herceptin resistant of ovarian cancer and affects the proliferation and in vivo tumorigenicity of SKOV3/H.

Keywords:ovarian cancer;herceptin resistant;HER-3;proliferation;tumorigenesis in vivo

卵巢癌是嚴重影響女性生殖健康的常見惡性腫瘤之一，其致死率長期處于女性惡性腫瘤的首位，其中約90%的卵巢癌為上皮性卵巢癌，由于其發(fā)病癥狀不明顯，大多數(shù)患者被確診時已屬于晚期卵巢癌，易復發(fā)轉移，治療預后差，5年生存率低[1]。

目前，臨床用于治療卵巢癌的藥物主要有化療藥物鉑類（如順鉑、卡鉑），紫杉醇等，靶向藥物吉非替尼、西妥昔單抗、貝伐單抗、曲貝替定及曲妥珠單抗等[2]。其中曲妥珠單抗又稱赫賽汀，為表皮生長因子受體家族成員（human epidermal growth factor receptor，EGFR）抑制劑[3]，主要作用靶點為細胞膜（erb-b2）受體酪氨酸激酶2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）。人表皮生長因子受體家族主要包括EGFR、HER-2、HER-3和HER-4 4個成員[4]。EGFR家族的異常表達與許多人類惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關，例如乳腺癌、卵巢癌和胃癌等[5-7]。在卵巢癌中，赫賽汀可用于HER2過表達型卵巢癌的治療[8]。研究表明，許多卵巢癌患者在赫賽汀初始治療時即可出現(xiàn)耐藥，也有患者在赫賽汀治療1年后出現(xiàn)獲得性耐藥[9]，而目前的卵巢癌治療中，赫賽汀靶向HER-2的耐藥機制尚不明確，作為HER-2同家族的HER-3，近年來常有研究報道顯示，HER-3與HER-2共表達，乳腺癌中HER3的表達與赫賽汀的耐藥密切相關[10]。因此，本研究擬從HER-3的角度，探究HER-3在卵巢癌中的作用，HER-3在卵巢癌赫賽汀耐藥中的作用，HER-3對卵巢癌耐藥細胞株（SKOV3/H）的增殖和體內(nèi)成瘤能力的影響。以期望為卵巢癌患者的早期診斷和治療提供更加完善、精準的治療方案，改善卵巢癌患者的預后及生存。

1 材料與方法

1.1 主要材料

LipofectamineTM2000和Trizol試劑（購于美國Invitrogen公司），核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）抽提試劑盒（購買于美國Applied Biosystems公司），Taq Man逆轉錄試劑盒（英國Life Technologies公司），qSYBR-Green-containing PCR kit（美國Qiagen公司），赫賽?。绹鳪h公司）。血細胞計數(shù)板（16×25格），Thermo Multiskan Ascent酶標儀，型號 413 MBY042078（美國薩默飛世爾公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)

SKOV3細胞（來源于中國科學院上海生命科學院生化細胞所），細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（美國 Gibco公司）和 100 u/ml青霉素和0.1 mg/ml鏈霉素（美國Invitrogen公司）雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Sigma公司）中，細胞放置于37℃、含5%二氧化碳CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。建立卵巢癌耐藥細胞株SKOV3/H：用含10%胎牛血清和雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)卵巢癌細胞SKOV3，0.5%胰蛋白酶消化傳代。在細胞生長密度達80%～90%時，加入赫賽汀5 mg/L，作用1 h后更換培養(yǎng)基，第2天約50%左右的細胞死亡。細胞逐漸恢復且生長密度達80%～90%時，繼續(xù)重復該步驟5～8次，逐步提高赫賽汀濃度，每次提高50%。直到某一濃度時，細胞基本無死亡、耐藥指數(shù)（resistant index，RI）>3.0、能保持傳代3個月仍維持類似耐藥性。此時即成功建立卵巢癌耐藥細胞株SKOV3/H。

1.3 穩(wěn)定表達sh-HER-3重組慢病毒質(zhì)粒及其對照質(zhì)粒載體細胞株的建立

包含sh-HER-3的重組慢病毒質(zhì)粒及其陰性對照慢病毒空載體質(zhì)粒載體（均帶egfp的熒光標簽）（美國Gene Copoeia公司構建），將2種質(zhì)粒分別以病毒/細胞數(shù)量=15的比例感染SKOV3/H細胞，感染3 d后觀察熒光的表達量，并加入2.0 μg/ml的嘌呤霉素，繼續(xù)培養(yǎng)，直到所有細胞均可觀察到熒光的表達。此時即構建了穩(wěn)定表達sh-HER-3的細胞株及其陰性對照。

1.4 臨床樣本及RNA提取

選取2013年6月-2015年6月本院病理科確診并進行手術切除的赫賽汀耐藥卵巢癌組織15例，與赫賽汀耐藥組的患者對應年齡、性別及病理狀態(tài)的非耐藥卵巢癌組織15例。其中兩組患者的平均年齡分別為（40±16.03）和（39.98±16.00）歲，兩組均為已婚9例，未婚6例，絕經(jīng)8例，未絕經(jīng)7例?；颊叩乃信R床病理學數(shù)據(jù)均被妥善保存且可隨時查閱。實驗的所有過程遵從赫爾辛基宣言，該研究得到我院倫理委員會的支持，且與所有患者簽署了知情同意書，研究方案經(jīng)我院倫理委員會批準。該15例赫賽汀耐藥卵巢癌組織和非耐藥卵巢癌組織均保存于液氮中用于提取RNA。

取液氮保存的耐藥卵巢癌組織和非耐藥卵巢癌組織各100 mg，各加入700 ml Trizol試劑，充分研磨（SKOV3和SKOV3/H細胞系總RNA提取則6孔板中各加入100μl Trizol，其他試劑按比例遞減）。室溫放置5min，加入140ml氯仿，劇烈震蕩15 s。室溫放置 5min，12000r/min，4℃離心 15min。吸取上層液體到另一干凈離心管，按0.5 ml異丙醇 Trizol的比例加入異丙醇，混勻，室溫放置10 min，離心去除上清液。加入1 ml 75%乙醇洗滌沉淀，7 500 r/min，4℃離心5 min，棄上清液，室溫干燥，加入30 μl無核糖核酸酶水溶解，取1μl測RNA濃度和純度，剩余RNA立即放入-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 實時熒光定量聚合酶連反應檢測

以1.4中提取的組織和細胞總RNA為模板，按逆轉錄試劑盒說明書進行操作，逆轉錄生成互補脫氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA），以cDNA為模板，按 qSYBR-Green-containing PCR kit說明書進行操作，Bio Rad IQTM5 Multicolor實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）系統(tǒng)檢測（美國伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品公司）。HER-3引物由（美國Invitrogen公司）合成，正向引物：5'-AGGCACGAGGAA CAAGCTCAC-3'；反向引物：5'-ATGAGGACATAACC AGCCACC-3'。β-actin為內(nèi)參，正向引物：5'-CTCC ATCCTGGCCTCGCTGT-3'，反向引物：5'-GCTGTCAC CTTCACCGTTCC-3'。2-ΔΔCT用于計算相對表達量，ΔΔCT=（CTmiRNA-CTβ-actin）target-（CTmiRNA CTβ-actin）control。反應體系為 20 μl，每組實驗設置3個復孔。

1.6 細胞生長曲線繪制

將SKOV3和SKOV3/H細胞0.25%胰酶消化后調(diào)整細胞密度至1×103個/ml，接種至24孔板，每孔600 μl，細胞計數(shù)（血細胞計數(shù)板讀出細胞數(shù)，16×25格血球計數(shù)板計算公式：1 ml細胞數(shù)=每小格細胞數(shù)×400×104×稀釋倍數(shù)），4 d/次，連續(xù) 28 d，并取其對數(shù)值-3，繪制細胞生長曲線，Patterson公式計算細胞在對數(shù)生長期的群體倍增時間（Td）=T[lg2/lg（N/N0）]（T=天數(shù)，N=實際細胞數(shù)，N0=初始細胞數(shù)）。

1.7 MTT實驗

將實驗分成sh-HER-3組和陰性對照組。將穩(wěn)定轉染的sh-HER-3和陰性對照組的SKOV3/H細胞接種到96孔板，每組設置5個復孔，細胞匯合度接近90%時，在每孔加入滅菌MTT液30 μl（其濃度為5 mg/ml）。37℃孵育4 h后向每孔中加入150 μl DMSO，低速振蕩10 min，隨后選擇570 nm波長，酶標儀（Thermo Multiskan Ascent酶標儀，型號413MB Y042078）測定各孔的吸光值并記錄結果，每組實驗重復3次。

1.8 裸鼠移植瘤模型

將裸鼠分兩組，每組3只，將構建的穩(wěn)定轉染sh-HER-3及其陰性對照的SKOV3/H細胞分別皮下注射到裸鼠體內(nèi)，注射量為每只6×106個/ml，共100 μl。每4天觀測1次裸鼠體內(nèi)瘤體的體積與大小，裸鼠體內(nèi)瘤體的體積（V）=（長徑×短徑2）/2，4周后處死小鼠并解剖，取出瘤體，所有操作均符合動物倫理學。

1.9 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組資料取正態(tài)分布的總體，并滿足方差齊性，兩組數(shù)據(jù)比較t檢驗，多組比較用單因素方差分析，多時點觀測資料則用重復測量方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 赫賽汀誘導卵巢癌細胞株生長情況

短梭形SKOV3細胞在赫賽汀誘導后，細胞形態(tài)改變且體積變大，邊緣有樹突狀分支且呈星型，胞漿內(nèi)形成空泡和顆粒，該現(xiàn)象在給藥1 d時最明顯，5 d后恢復最初狀態(tài)，此時SKOV3和SKOV3/H形態(tài)差異無統(tǒng)計學意義（見圖1A）。SKOV3/H生長速度低于SKOV3，根據(jù)Patterson公式計算細胞在對數(shù)生長期的群體倍增時間（Td）=T[lg2/lg（N/N0）]（T=天數(shù)，N=實際細胞數(shù)，N0=初始細胞數(shù)），其中SKOV3/H細胞的群體倍增時間為（28.33±2.12）h，SKOV3細胞的Td值為（46.52±2.71）h，SKOV3/H細胞的Td為SKOV3細胞的1.4～1.9倍，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖 1B。

2.2 HER-3在卵巢癌耐藥組織和細胞系中的表達

qRT-PCR檢測了HER-3在15例卵巢癌耐藥和非耐藥癌組織中的表達，與非耐藥癌組織比較，HER-3在耐藥癌組織中表達上調(diào)[（0.773±0.235）vs（1.358±0.464）]，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（見圖2A）。隨后分別檢測HER-3在非耐藥細胞株SKOV3和耐藥細胞株SKOV3/H中的表達，與SKOV3細胞比較，耐藥細胞株SKOV3/H中HER-3的表達上調(diào)[（1.037±0.119）vs（1.540±0.089）]，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（見圖 2B）。

2.3 靶向HER-3抑制卵巢癌細胞株SKOV3/H的增殖能力

分別轉染HER-3的shRNA和陰性對照到SKOV3/H細胞中，qRT-PCR結果顯示，轉染sh-HER-3后，SKOV3/H細胞中HER-3的mRNA表達水平較陰性對照組降低（陰性對照組：1.032±0.013，sh-HER-3 組：0.346±0.004）（P<0.05）（見圖 3A），即轉染成功。

MTT實驗共分兩組，分別轉染sh-HER-3和陰性對照到SKOV3/H細胞中。轉染48 h后，與陰性對照轉染組比較，sh-HER-3轉染組SKOV3/H細胞的增殖能力被抑制 [抑制率的數(shù)值陰性對照組：（97.67±2.08）%，sh-HER-3 組：（45.00±15.00）%]，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖3B。

2.4 靶向HER-3抑制卵巢癌細胞株SKOV3/H的體內(nèi)成瘤能力

為評估HER-3對卵巢癌耐藥細胞株SKOV3/H體內(nèi)成瘤能力的影響，將復制的穩(wěn)定轉染sh-HER-3和陰性對照SKOV3/H細胞株，皮下注射到裸鼠體內(nèi)（每組3只），復制裸鼠荷人卵巢癌移植瘤模型，4周后處死裸鼠并取出瘤體組織，結果顯示sh-HER-3組裸鼠成瘤體積小于陰性對照組（P<0.05）（見圖4）。

圖1 卵巢癌耐藥細胞株SKOV3/H的檢測結果

圖2 HER-3在卵巢癌耐藥和非耐藥組織及細胞系中的表達水平

圖3 抑制HER-3對SKOV3和SKOV3/H細胞增殖能力的影響

圖4 抑制HER-3對SKOV3/H裸鼠體內(nèi)成瘤能力的影響

3 討論

卵巢癌是臨床上常見的女性惡性腫瘤之一，其致死率居于女性惡性腫瘤的首位，其中尤以上皮性卵巢癌的致死率最高[11]。目前卵巢癌的主要治療方案有手術治療、一線化療、腹腔化療、新輔助化療、靶向治療、基因治療、免疫治療、內(nèi)分泌治療和中醫(yī)治療等[12]。其中靶向治療是一種以標準化生物標志物識別是否存在某種疾病特定的控制腫瘤生長的基因或基因譜，以確定針對特異性靶點的治療方法，又被稱為“生物導彈”，可靶向腫瘤特異性組織，而不對正常組織造成損傷，因此其在卵巢癌治療中運用較為廣泛[13]。

EGFR是與卵巢癌靶向治療密切相關的重要受體，其在多種惡性腫瘤中均存在過表達的現(xiàn)象[14]。EGFR家族包括erbB1/HER-1/EGFR，erbB2/HER-2、erbB3/HER-3和erbB4/HER-4共4個成員，目前針對HER-2的研究較多，但與HER-3相關的研究卻較少，并且觀點并不統(tǒng)一，有學者認為HER-3在癌中高表達，與患者的生存無關；有學者認為，HER-3和HER-2的過度表達高度相關，且HER-3陽性與陰性患者OS差異有統(tǒng)計學意義[15]。目前以EGFR家族為主要靶點的藥物研發(fā)已成為近年來靶向藥物研發(fā)的重點，臨床常用的卵巢癌靶向治療藥物以EGFR抑制劑為主，包括吉非替尼（作用靶點EGFR）、西妥昔單抗（作用靶點EGFR）和曲妥珠單抗（赫賽汀，作用靶點 HER-2）等[16]。

藥物耐藥是導致腫瘤治療轉移和復發(fā)，并最終導致治療失敗的主要原因之一。研究表明，HER-2陽性的卵巢癌患者在接受赫賽汀治療后，仍然有約60%的患者產(chǎn)生藥物抵抗或復發(fā)轉移，最終導致治療失敗[17]。目前，針對卵巢癌的赫賽汀耐藥尚無有效的預防及改善措施，因此尋找卵巢癌患者赫賽汀耐藥的內(nèi)在機制，減少或逆轉赫賽汀的耐藥，將為卵巢癌的治療和預防帶來較大的益處。

本研究成功構建對赫賽汀耐藥的卵巢癌耐藥細胞株SKOV3/H，檢測SKOV3/H和SKOV3細胞、赫賽汀耐藥和非耐藥的卵巢癌組織中HER-3的表達水平，筆者發(fā)現(xiàn)HER-3在卵巢癌的赫賽汀耐藥細胞株和組織中均存在過表達的現(xiàn)象，本研究結果與HER-3在多種癌組織中存在過表達的現(xiàn)象相一致，如HER-3在低分化的乳腺癌中高表達[18]。由于HER-3的過表達可促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，使腫瘤細胞具有更強的侵襲性和轉移性[19]，抑制HER-3的表達，可抑制胃癌細胞的增殖、遷移和存活能力[20]，因此推測在赫賽汀耐藥的SKOV3/H細胞中抑制HER-3的表達，將可能降低SKOV3/H細胞的惡性程度。

筆者轉染sh-HER-3及其對照質(zhì)粒到耐藥細胞株SKOV3/H中，采用MTT和體內(nèi)成瘤實驗來驗證猜想，結果與猜想一致，即抑制耐藥細胞株SKOV3/H中HER-3的表達，可抑制SKOV3/H細胞的體外增殖和體內(nèi)成瘤能力。而關于該抑制作用的實現(xiàn)過程，研究顯示HER-3可先通過HER-2介導而發(fā)生磷酸化，并與磷脂酰肌醇-3-激酶（PI-3K）結合，隨后激活與細胞的增殖、生長和遷移等密切相關的PI-3K通路，從而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[21]。另外，PI-3K/Akt信號通路還與表皮生長因子受體（EGFR、HER-2）的靶向藥物耐藥相關，該過程可經(jīng)HER-3激活[22]。關于HER-3對EGFR或HER-2靶向藥物產(chǎn)生耐藥性的內(nèi)在機制，有研究認為與HER-3的過表達密切相關[23]，而筆者在卵巢癌的赫賽汀耐藥細胞株和組織中觀察到該現(xiàn)象，研究顯示臨床常用的EGFR家族的分子靶向藥物吉非替尼或赫賽汀，對HER-2陽性患者產(chǎn)生耐藥性的原因可能是HER-3在組織和細胞內(nèi)存在重排的現(xiàn)象[24]，可用于解釋HER-3在卵巢癌的赫賽汀耐藥細胞株和組織中存在過表達現(xiàn)象的原因。

綜上所述，HER-3與卵巢癌治療中的赫賽汀耐藥密切相關，靶向抑制HER-3可抑制赫賽汀耐藥細胞株的增殖和體內(nèi)成瘤能力，研發(fā)靶向HER-3的藥物將大大提高赫賽汀在卵巢癌臨床治療和和預防中的作用。

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Effect of HER-3 on proliferation and tumorigenicity abilities of Herceptin-resistant ovarian cancer cell line SKOV3/H

Jie Geng
(Department of Gynecology,the Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou,Henan 450014,China)

R737.31

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.15.005

1005-8982（2017）15-0022-07

2016-12-26