肺癌細(xì)胞株中EPS8表達(dá)下降對順鉑化療敏感性的影響

杜海堅，李偉峰，孫青峰，王元亨，黃文杰

（1.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，廣東 廣州 510010；2.廣東藥科大學(xué)，廣東 廣州 510006；3.中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)，陜西 西安 710000）

肺癌細(xì)胞株中EPS8表達(dá)下降對順鉑化療敏感性的影響

杜海堅1，李偉峰1，孫青峰2，王元亨3，黃文杰1

（1.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，廣東 廣州 510010；2.廣東藥科大學(xué)，廣東 廣州 510006；3.中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)，陜西 西安 710000）

目的探究肺癌細(xì)胞株中表皮生長因子受體通路底物8（EPS8）表達(dá)下降對順鉑化療敏感性的影響。方法脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將EPS8沉默后并通過實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測EPS8在各細(xì)胞系的沉默效率。采用Caspase-3/7細(xì)胞凋亡實驗檢測，5 μmol順鉑對淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系（LCLs）和A549肺癌細(xì)胞凋亡的影響。Alamar Blue細(xì)胞生長抑制實驗中采用0.01 μmol/L光神霉素A作為EPS8抑制劑單用及聯(lián)用不同濃度順鉑，Alamar Blue細(xì)胞生長抑制實驗檢測其對癌和非癌細(xì)胞系生長抑制的影響。結(jié)果與對照組比較，LCLs細(xì)胞系中EPS8的沉默導(dǎo)致順鉑干預(yù)時細(xì)胞存活率升高7.9%，凋亡率下降8.7%。與此相反，順鉑干預(yù)導(dǎo)致肺癌細(xì)胞存活率下降20.6%。光神霉素A在LCLs細(xì)胞系中能夠降低EPS8的表達(dá)，并與對照組比較，非癌細(xì)胞系LCLs在順鉑干預(yù)時具有更低Caspase-3/7活性，凋亡率降低。在5種非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）細(xì)胞系中，光神霉素A同樣能夠?qū)е翬PS8表達(dá)下降。與LCLs細(xì)胞系比較，光神霉素A的干預(yù)能夠使4種NSCLC細(xì)胞和膀胱癌細(xì)胞HTB9對順鉑的敏感性增加（P<0.05），但NSCLC中存在EGFR突變的H1975細(xì)胞對順鉑的敏感性并未出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)改變（P>0.05）。結(jié)論通過核糖核酸（RNA）干擾或者光神霉素A將EPS8表達(dá)抑制后，腫瘤細(xì)胞對順鉑的敏感性升高，而正常細(xì)胞LCLs對其敏感性卻出現(xiàn)下降。對EPS8分子機(jī)制的進(jìn)一步研究有望其成為抗腫瘤治療的新靶點。

順鉑；光神霉素A；敏感性；淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞；非小細(xì)胞肺癌

Abstract:ObjectiveTo evaluate the role of epidermal growth factor receptor pathway substrate 8 (EPS8)in cellular susceptibility to cisplatin in tumor cells and normal cells.MethodsEPS8 RNA interference was used to determine EPS8 silencing efficiency in each cell line by qRT-PCR.Caspase-3/7 was used to detect the apoptosis of lymphoblastoid cell lines(LCLs)and A549 lung cancer cell when treated with 5 μmol/L cisplatin after EPS8 was silenced.In the Alamar Blue cell growth inhibition assay,0.01 μmol/L mycophenolate as anEPS8 inhibitor was used alone or in combination with different concentrations of cisplatin to detected its effect on the growth inhibition of cancer and non-cancer cell lines.ResultsCompared with the control group,the survival rate of EPS8 in LCLs cell line was increased by 7.9%and the apoptosis rate decreased by 8.7%.In contrast,cisplatin intervention resulted in a 20.6%reduction in lung cancer cell survival.The expression of EPS8 was decreased in LCLs cell line,and the Caspase-3/7 activity was lower in the non-cancer cell line LCLs treated by cisplatin compared with the control group,and the apoptosis rate was decreased.In the five kinds of non-small cell lung cancer (NSCLC)cell lines,mithramycin also lead to decreased expression of EPS8.Compared with the LCLs cell line,the sensitivity to cisplatin increased significantly in the four NSCLC cells and the bladder cancer cell HTB9 (P<0.05),but it had no statistically significant in the NSCLC,the EGFR mutated H1975 cells(P>0.05).ConclusionsThere are significantly increased of sensitivity to cisplatin in cancer cells when EPS8 inhibition through the RNA interference or mithramycin treated,while normal cells decrease its sensitivity.

Keywords:cisplatin;mithramycin;sensitivity;lymphoblastoid cells;non-small cell lung cancer

順鉑作為鉑類化療藥中的代表，臨床上主要用于頭頸部癌[1]、卵巢癌[2]、宮頸癌[3]及肺癌[4]治療，效果確切。然而其毒副作用和固有的獲得耐藥性嚴(yán)重影響該藥療效的發(fā)揮[5]。研究化療藥導(dǎo)致嚴(yán)重毒副作用的遺傳和分子機(jī)制，及可能受影響的作用通路，尤其是發(fā)現(xiàn)跟細(xì)胞毒性相關(guān)基因的表達(dá)情況，有利于改善臨床療法，削弱甚至消除化療藥物的毒副作用，提高患者的生活質(zhì)量，延長生存期限。

對于多數(shù)的淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系（lymphoblastoid cell lines，LCLs），藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞生長抑制作用是通過藥理學(xué)表型進(jìn)行檢測。然而這是一種通過細(xì)胞凋亡和非凋亡途徑引起的細(xì)胞死亡，細(xì)胞周期抑制以及受損細(xì)胞的DNA修復(fù)等極為寬泛的表型所導(dǎo)致的細(xì)胞壞死[6]。

一項全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS）揭示[7]，2 449 個單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs） 和 1 629 個SNPs分別與順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞毒性有關(guān)（P=0.000）。在共有的SNPs中，rs4343077作為次要等位基因在順鉑誘導(dǎo)時具有更低的凋亡率（P=0.000）。這個SNP位于表皮生長因子受體通路底物8（epidermal growth factor receptor pathway substrate 8，EPS8）的內(nèi)含子區(qū)域。研究發(fā)現(xiàn)[8]，EPS8確實與順鉑/紫杉醇誘導(dǎo)的藥物反應(yīng)性有關(guān)。當(dāng)EPS8沉默后，宮頸癌細(xì)胞對化療藥物干預(yù)變得更為敏感。惡性膠質(zhì)瘤中EPS8過表達(dá)并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長[9]。此外，多項研究表明，在其他諸如結(jié)直腸癌等實體腫瘤中，EPS8的表達(dá)均升高。因此，筆者猜測EPS8表達(dá)降低可能是通過增強腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性而影響后者的促凋亡能力。

由于EPS8在腫瘤細(xì)胞中對順鉑反應(yīng)的重要性以及前人發(fā)現(xiàn)的EPS8（rs4343077）中SNP與順鉑引起的細(xì)胞毒性和細(xì)胞凋亡均有關(guān)[10]。因此筆者進(jìn)一步探究EPS8與順鉑敏感性的關(guān)聯(lián)。為此，本文利用沉默核糖核酸（silencing ribonucleic acid，siRNA）和已知的EPS8抑制劑——光神霉素A對多種LCLs細(xì)胞及膀胱癌和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞（non-small cell lung cancer，NSCLC）中EPS8進(jìn)行沉默和抑制。探究當(dāng)EPS8表達(dá)降低時，淋巴母細(xì)胞和實體瘤細(xì)胞對順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的改變。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系

各種LCLs（GM6991、GM7348、GM10838、GM11994及GM12239）、膀胱癌細(xì)胞HTB9及人NSCLC細(xì)胞NCI-H2126（購自美國ATCC細(xì)胞庫），保存在含15%胎牛血清（浙江省德清縣天杭生物科技有限公司）和20 μmol/L-谷氨酰胺的RPMI 1640培養(yǎng)基（roswell park memorial institute 1640）中（美國Hyclone公司）；人 NSCLC細(xì)胞系（A549、NCI H1437、NCI-H1563及NCI-H1975）（購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫），所有的細(xì)胞均培養(yǎng)在37℃、5%二氧化碳CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

1.2 藥物

順鉑和光神霉素A（購自美國Sigma公司），分別用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）和磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）稀釋至 20.00和 0.06 μmol/L。

1.3 RNA干擾

沉默實驗旨在驗證較低的EPS8表達(dá)水平對順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性和細(xì)胞凋亡的影響。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，轉(zhuǎn)染前1天將5種LCLs細(xì)胞（GM6991、GM7348、GM10838、GM11994 及 GM12239）和 A549細(xì)胞接種于24孔板中，使其在第2天轉(zhuǎn)染時長至30%～50%融合。吸去培養(yǎng)板中培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞2次后添加無抗生素?zé)o血清高糖培養(yǎng)基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）（美國 Hyclone公司）400 μl/孔，分別用 50 μl無血清 DMEM培養(yǎng)基稀釋20 pmol siRNA（廣州市銳博生物科技有限公司）和1 μl LipofectamineTM2000脂質(zhì)體（美國invitrogen公司），室溫靜置5 min后將兩者混勻繼續(xù)放置20 min形成復(fù)合物。每孔加入100 μl轉(zhuǎn)染復(fù)合液后置于37℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)24和48 h，然后采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測EPS8基因沉默情況。

1.4 qRT-PCR實驗

細(xì)胞于核轉(zhuǎn)染EPS8 siRNA 24和48 h后，采用RNAiso Plus Total RNA提取試劑盒（日本TaKaRa株式會社）提取細(xì)胞RNA，用Prime ScriptTMRT with gDNA Eraser試劑盒（日本TaKaRa株式會社）將信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）逆轉(zhuǎn)錄成互補脫氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA），并調(diào)整其終濃度為25或50 ng/μl，應(yīng)用 Applied Biosystems Step One Plus real-time PCR儀器（美國Thermo Scientific公司）對EPS8的mRNA表達(dá)進(jìn)行相對定量分析。

1.5 Alamar Blue細(xì)胞毒性實驗

采用Alamar Blue細(xì)胞生長抑制實驗檢測順鉑和光神霉素A對細(xì)胞毒性的影響。在EPS8 siRNA實驗中，5 μmol/L順鉑分別處理核轉(zhuǎn)染的LCLs細(xì)胞系（GM6991、GM7348、GM10838、GM11994 及 GM12 239）及A549細(xì)胞24 h，然后加入Alamar Blue孵育24 h后，采用Multiskan MK3型酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）在570 nm波長檢測細(xì)胞存活率。為觀察光神霉素A對EPS8沉默的細(xì)胞毒性影響，細(xì)胞系（GM6991、GM7348、GM10838、GM11994、A549、H1437、H1563、H1975 及 H2126）鋪板后，單用光神霉素 A（0 及 0.01 μmol/L）和單用順鉑（0.0、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0、25.0 及 50.0 μmol/L）以及多種不同濃度的順鉑聯(lián)合0.01 μmol/L光神霉素A進(jìn)行干預(yù)。待鋪板細(xì)胞貼壁后加入光神霉素A，隨后加入順鉑干預(yù)6 h，加入總體積10%的Alamar Blue孵育至24 h，最后用酶標(biāo)儀在570 nm波長處進(jìn)行檢測，每種處理均至少設(shè)置3個復(fù)孔，且實驗至少重復(fù)3次以確保結(jié)果的可靠性。

1.6 細(xì)胞凋亡實驗

采用Caspase-3/7細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（美國Promega公司）檢測順鉑和光神霉素A誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡情況。在EPS8 siRNA實驗中，核轉(zhuǎn)染后細(xì)胞鋪板并加入5 μmol/L的順鉑干預(yù)5 h，并在24 h后檢測細(xì)胞的Caspase-3/7活性。為檢測光神霉素A干預(yù)后細(xì)胞EPS8基因的表達(dá)，細(xì)胞鋪板后加入0.01 μmol/L的光神霉素A，再加入5 μmol/L的順鉑處理24 h。然后檢測細(xì)胞Caspase-3/7活性并與對照組（無藥物干預(yù)）進(jìn)行對比。實驗至少重復(fù)3次以確保結(jié)果的可靠性。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RNA干擾成功沉默EPS8

5種LCLs細(xì)胞系和A549肺癌細(xì)胞用于EPS8沉默的研究。分別轉(zhuǎn)染陰性對照和EPS8 siRNA。與陰性對照組比較，6種細(xì)胞系中EPS8均成功沉默。所有LCLs細(xì)胞系中EPS8在24和48 h分別沉默至（19.01±4.32）%和（40.61±7.29）%。A549細(xì)胞中EPS8 siRNA的沉默效率與陰性對照比較，EPS8 mRNA分別沉默至7.4%和10.5%。見圖1A。

2.2 EPS8的沉默增加A549對順鉑敏感性

EPS8被成功沉默之后，筆者通過細(xì)胞存活率和Caspase-3/7活性來評估細(xì)胞對順鉑敏感性的改變。EPS8的表達(dá)與順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的相關(guān)性表明，在5 μmol/L順鉑干預(yù)時，更高的細(xì)胞存活率與更低的EPS8表達(dá)水平有關(guān)（P=0.047）。當(dāng)順鉑干預(yù)時，EPS8的沉默能將LCLs細(xì)胞系的存活率平均提高7.9%（P=0.019），凋亡率平均降低 8.7%（P=0.004），該結(jié)果表明，低水平的EPS8表達(dá)可以導(dǎo)致LCLs細(xì)胞對順鉑的敏感性降低。因此，LCLs細(xì)胞系中EPS8的表達(dá)降低能夠拮抗順鉑毒性。與此相反，EPS8在A549細(xì)胞表達(dá)下調(diào)時對順鉑有更高的敏感性，細(xì)胞存活率的降幅為20.6%（P=0.000）。見圖1B。

2.3 光神霉素A降低EPS8在癌細(xì)胞和LCLs細(xì)胞系中的表達(dá)

0.01 μmol/L光神霉素A干預(yù)細(xì)胞系6和24h后對EPS8 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測。當(dāng)光神霉素A干預(yù)時，與對照組比較，檢測的4種LCLs細(xì)胞中EPS8 mRNA的表達(dá)在6和24 h時分別降至（74.42±3.46）%和（29.82±3.71）%，相比于沒有藥物干預(yù)的對照組，5種NSCLC細(xì)胞和膀胱癌細(xì)胞在光神霉素A干預(yù)6和24 h時EPS8 mRNA的表達(dá)分別降低至（95.72±3.42）%和（59.91±14.73）%，該檢測結(jié)果證實0.01 μmol/L光神霉素A干預(yù)可以引起肺癌和膀胱癌細(xì)胞以及非癌的LCLs細(xì)胞中EPS8 mRNA表達(dá)降低。見圖2。

2.4 光神霉素A降低LCLs細(xì)胞系對順鉑的敏感性

隨后檢測光神霉素A對LCLs細(xì)胞系中順鉑誘導(dǎo)的Caspase-3/7活化的影響。當(dāng)單用順鉑干預(yù)時，4種LCLs細(xì)胞系的Caspase-3/7活性為（5.94±0.91）。相比之下，順鉑聯(lián)用光神霉素A Caspase-3/7活性減少到（3.38±0.52），4 種 LCLs細(xì)胞系中單用 0.01 μmol/L光神霉素A Caspase-3/7的活性為（3.41±0.44）。雖然光神霉素A和順鉑均能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但與順鉑單用比較，兩者聯(lián)用Caspase-3/7活性降低至（42.72±6.82%，P=0.000）。提示光神霉素A在細(xì)胞凋亡上發(fā)揮保護(hù)作用。見圖3。

2.5 光神霉素A增強腫瘤細(xì)胞對順鉑的敏感性

筆者選用5種不同突變類型的NSCLC細(xì)胞系進(jìn)行研究。單用光神霉素A對該癌細(xì)胞的影響不一，細(xì)胞敏感性從59.7%到92.9%不等，光神霉素A干預(yù)時，隨著順鉑濃度的逐漸增加，發(fā)現(xiàn)5種NSCLC細(xì)胞中有4種存活率較未用光神霉素A下降（P<0.05）。H1975細(xì)胞存在EGFR突變，并未發(fā)現(xiàn)其敏感性有變化。筆者同時發(fā)現(xiàn)，順鉑和光神霉素A對膀胱癌細(xì)胞有影響，較光神霉素A單用，膀胱癌細(xì)胞HTB9對順鉑的敏感性同樣增強（P<0.05）。見附表和圖4。

圖1 5μmol/L順鉑干預(yù)對EPS8沉默后癌細(xì)胞和非癌細(xì)胞存活率及Caspase-3/7活性的影響

圖2 0.01μmol/L光神霉素A對癌細(xì)胞和LDLs細(xì)胞系EPS8 mRNA的影響

圖3 5μmol/L順鉑聯(lián)用0.01μmol/L光神霉素A導(dǎo)致LCLs細(xì)胞系中Caspase-3/7活性下降

附表 光神霉素A對不同突變型NSCLC細(xì)胞系敏感性的影響

圖4 光神霉素A存在和缺乏時，不同濃度順鉑對NSCLC細(xì)胞系和膀胱癌細(xì)胞HTB9存活率的影響

3 討論

在本研究中，筆者評估EPS8作為潛在的靶點用于順鉑藥物的聯(lián)合治療。EPS8的選擇是基于以前的臨床GWAS結(jié)果，使用多種細(xì)胞表型進(jìn)行衡量：Caspase-3/7活性水平代表順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性和細(xì)胞凋亡情況。SNP（EPS8內(nèi)含子），rs4343077與順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性和細(xì)胞凋亡有關(guān)。通過對沉默EPS8的5種LCLs細(xì)胞系進(jìn)行細(xì)胞生長抑制實驗和Caspase-3/7活化實驗，筆者發(fā)現(xiàn)當(dāng)EPS8表達(dá)下降時，LCLs細(xì)胞系對順鉑的化療敏感性下降。筆者的結(jié)果驗證前人的發(fā)現(xiàn)[7]，通過對EPS8基因沉默發(fā)現(xiàn)，肺癌細(xì)胞A549對順鉑的敏感性確實增強。

筆者將研究范圍擴(kuò)展至其他的肺癌細(xì)胞系和膀胱癌細(xì)胞以及LCLs細(xì)胞系。在LCLs細(xì)胞系中沉默EPS8，隨后利用光神霉素A進(jìn)行干預(yù)，與順鉑單用比較，光神霉素A和順鉑聯(lián)用導(dǎo)致細(xì)胞凋亡活性降低。雖然細(xì)胞毒性實驗發(fā)現(xiàn)當(dāng)光神霉素A干預(yù)時，LCLs細(xì)胞系對順鉑的敏感性會有少許的增加，但相反的是，腫瘤細(xì)胞系卻增加得更為顯著。此外，NSCLC細(xì)胞系中存在EGFR突變的H1975細(xì)胞卻是個例外?？傊?，通過siRNA或者使用諸如光神霉素A等特異性抑制劑將EPS8沉默，這或許是提高腫瘤對順鉑敏感性的治療策略。

EPS8是在腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮惡性轉(zhuǎn)化作用的腫瘤相關(guān)蛋白。其是EGFR的底物，通過Rac參與EGFR信號通路[11]。SOS1以及ABI1是溶血磷脂酸誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移和Rac激活的必要組成部分，已被發(fā)現(xiàn)在卵巢癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]。EPS8的表達(dá)水平同樣作為早期宮頸癌患者的預(yù)后指標(biāo)[12]。EPS8高表達(dá)患者往往意味著宮旁浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險的升高和生存率的下降。

光神霉素A原本是一種來源于瘡痂病的抗生素，是EPS8的潛在抑制劑。筆者發(fā)現(xiàn)，光神霉素A可以減少人類大腸腺上皮癌細(xì)胞系和人肺癌上皮細(xì)胞系中EPS8的mRNA和蛋白水平。此外，通過光神霉素A干預(yù)引起的EPS8表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長和遷移能力大幅降低[13]。在美國自1970年起，光神霉素A就已被批準(zhǔn)上市，用于濕疹樣癌、睪丸癌和惡性腫瘤相關(guān)的骨病變中高鈣血癥的臨床治療。然而，多年來由于其嚴(yán)重的副作用和狹窄的治療窗導(dǎo)致臨床應(yīng)用光神霉素A受到極大的局限。患者在接受光神霉素A治療時，會產(chǎn)生肝、腎和骨髓系統(tǒng)毒性，導(dǎo)致惡心、嘔吐和出血的發(fā)生，給患者帶來極大痛苦[14]。盡管副作用嚴(yán)重，但由于其在分子水平上的研究進(jìn)展，導(dǎo)致科學(xué)家對光神霉素A產(chǎn)生新的興趣。

光神霉素A能夠直接通過抑制EPS8的活性增強因子SRC而抑制EPS8的表達(dá)[13]。還能與位于脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）小溝內(nèi)富含GC堿基序列的DNA區(qū)域相互作用，從而阻止轉(zhuǎn)錄因子特異性蛋白 1（specificity protein 1，Sp1）與多種原癌基因的啟動子結(jié)合[15]。然而，Sp1結(jié)合位點與無關(guān)的原癌基因相結(jié)合并不會產(chǎn)生作用，比如啟動子p21cip1/waf1。因此，光神霉素A可能不是針對Sp1的特異性抑制劑，而是靶向于Sp1有相互作用的癌基因的上游。

又有文獻(xiàn)報道，光神霉素A能夠降低c-myc、cmyb、c-src、c-met和 FOXM1 表達(dá)[16]，提高 FOXO3A的表達(dá)水平，后者是一種調(diào)控DNA損傷應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄因子，這或許是因為該基因與光神霉素A作用靶點的通路下游相關(guān)[17]。例如，EPS8也可以上調(diào)FOXM1，后者已被證實直接與Sp1結(jié)合，是在癌癥的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)生關(guān)鍵作用的一種因子[18]，即Sp1和FOXM1通過反式激活促進(jìn)c-myc的協(xié)同作用。

此外，研究發(fā)現(xiàn)EPS8的表達(dá)下降會降低Src、Shc和參與細(xì)胞黏附及遷移相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)絡(luò)氨酸激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）（也稱為 PTK2）的表達(dá)水平[19]。EPS8同樣也可能通過PI3K/AKT/mTOR信號通路或Ras-Raf-MEK-ERK通路調(diào)節(jié)FOXO3A。前人研究順鉑耐藥性發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用光神霉素A進(jìn)行干預(yù)時，順鉑耐藥細(xì)胞因為FOXO3A的改變而出現(xiàn)增敏效果，當(dāng)通過降低AKT信號通路中FOXO3A的活性時，促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[20]。因此，很可能是EPS8表達(dá)水平降低引起AKT減少，進(jìn)而引發(fā)FOXO3A磷酸化而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡，而不是繼續(xù)增殖。

本實驗發(fā)現(xiàn)，NSCLC細(xì)胞系中只有存在EGFR突變的H1975細(xì)胞在光神霉素A干預(yù)時細(xì)胞死亡率沒有增加。H1975肺癌細(xì)胞在21號外顯子上存在1個由亮氨酸到精氨酸的點突變（L858R）以及1種二次突變T790M，改變正常的EGFR活性。EGFR酪氨酸抑制劑通常被用來增加EGFR突變的腫瘤細(xì)胞對鉑劑的敏感性[21]。然而，這些抑制劑對EGFR野生型腫瘤卻往往無效。筆者猜測，光神霉素A可能通過抑制在腫瘤細(xì)胞生長、黏附和遷移過程中發(fā)揮重要作用的EPS8和其下游靶基因，進(jìn)而促進(jìn)EGFR野生型腫瘤細(xì)胞對順鉑增敏的效果。足夠劑量的光神霉素A可以抑制特定的腫瘤基因且不會產(chǎn)生額外的副作用，從而使化療藥對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生更高效的殺傷作用。

綜上所述，筆者的研究結(jié)果驗證EPS8參與細(xì)胞對順鉑的反應(yīng)過程。當(dāng)然不排除筆者使用的光神霉素A可能存在更加特殊的EPS8抑制機(jī)制，而導(dǎo)致其在腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞之間產(chǎn)生不同的作用。與順鉑單用比較，聯(lián)用光神霉素A能夠降低EPS8的表達(dá)，減少LCLs細(xì)胞系凋亡。而且與腫瘤細(xì)胞相比，光神霉素A干預(yù)導(dǎo)致的EPS8表達(dá)下降對正常細(xì)胞LCLs毒性極小。進(jìn)一步證實EPS8在順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性中的作用和以及在臨床提高順鉑療效中作為潛在靶點的重要性。

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Effects of EPS8 expression decreased on cisplatin sensitivity in lung cancer cell

Hai-jian Du1,Wei-feng Li1,Qing-feng Sun2,Yuan-heng Wang3,Wen-jie Huang1
(1.Department of Respiratory,General Hospital of Guangzhou Military Command of PLA,Guangzhou,Guangdong 510010,China;2.Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou,Guangdong 510006,China;3.The Fourth Military Medical University of PLA,Xi'an,Shaanxi 710000,China)

R730.53

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.15.004

1005-8982（2017）15-0015-07

2016-11-19

黃文杰，Tel：13600466358