奶牛乳腺細(xì)胞CXCR1基因在三種菌落刺激下的表達(dá)變化研究

王珍珍，陳仁金，楊章平，毛永江，冀德君

（1.徐州醫(yī)科大學(xué)，徐州 212004；2.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)科學(xué)院，揚(yáng)州 225009）

奶牛乳腺細(xì)胞CXCR1基因在三種菌落刺激下的表達(dá)變化研究

王珍珍1，陳仁金1，楊章平2，毛永江2，冀德君2

（1.徐州醫(yī)科大學(xué)，徐州 212004；2.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)科學(xué)院，揚(yáng)州 225009）

本研究旨在探索在不同菌落刺激下奶牛乳腺上皮細(xì)胞中CXCR1基因的表達(dá)變化。運(yùn)用SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)CXCR1基因mRNA水平進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CXCR1基因在細(xì)胞水平上對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌刺激較敏感，各個(gè)時(shí)段表達(dá)差異達(dá)顯示水平。本研究為今后進(jìn)一步研究CXCR1基因的表達(dá)機(jī)理以及奶牛乳房炎的防治奠定了基礎(chǔ)。

CXCR1基因；實(shí)時(shí)定量PCR；奶牛乳腺上皮細(xì)胞

奶牛乳房炎是危害奶牛養(yǎng)殖的重要疾病。據(jù)報(bào)道美國(guó)每頭奶牛每年因乳房炎造成的花費(fèi)大約是200美元，每年對(duì)奶牛業(yè)造成的損失達(dá)20億美元。我國(guó)每年因乳房炎造成的損失約150億～450億元。導(dǎo)致奶牛乳房炎的因素很多，但病原微生物是主要病因[1]，其中以金黃色葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌為主的病原微生物是導(dǎo)致發(fā)病的主要因素，約占發(fā)病因素的90%[2]。很多研究通過對(duì)不同地區(qū)牛場(chǎng)的奶牛乳房炎進(jìn)行細(xì)菌分離與藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，除以上三種主要病原菌是主要因素外，管理與環(huán)境因素也起到重要作用，并指出通過遺傳育種與生物技術(shù)手段來預(yù)防和控制乳房炎是重要手段之一。

趨化因子及趨化因子受體在炎癥發(fā)生時(shí)發(fā)揮重要作用。CXCR1作為趨化因子之一，在誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞趨化物、白介素-8及生長(zhǎng)相關(guān)基因等趨化物引起的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。研究表明，牛CXCR1是影響奶牛乳腺炎的重要候選基因，并具有豐富的多態(tài)性[3,4]。Legva-Baca等對(duì)CXCR1.5’側(cè)翼區(qū)多態(tài)性進(jìn)行了研究，共發(fā)現(xiàn)了3個(gè)突變位點(diǎn)，其中-1768（T/A）位點(diǎn)與體細(xì)胞評(píng)分達(dá)到極顯著水平[5]。Youngerman等研究了娟珊牛的5個(gè)單核苷酸位點(diǎn)，777（G/C）引起谷氨酸到組氨酸的變化，且GG基因型奶?；茧[性乳房炎的幾率顯著低于CC基因型奶牛[6,7]。

CXCR2主要分布于中性粒細(xì)胞和髓樣前體細(xì)胞系。CXCR1和CXCR2均具有介導(dǎo)活化中性粒細(xì)胞的作用，可促進(jìn)中性粒細(xì)胞脫顆粒、釋放貯存酶，增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的吞噬功能，啟動(dòng)超氧離子釋放，導(dǎo)致機(jī)體局部炎癥反應(yīng)，達(dá)到殺滅病原菌的目的[8,9]。本研究擬在細(xì)胞水平上對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞對(duì)三種菌落（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌）刺激的敏感性進(jìn)行研究，以確定CXCR1的表達(dá)變化，為進(jìn)一步研究CXCR1在奶牛乳房炎中的作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源

奶牛乳腺上皮細(xì)胞系由哈佛大學(xué)孫有平教授惠贈(zèng)。經(jīng)復(fù)蘇、傳代與凍存，保存于本課題組。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)用于熒光定量的目的基因CXCR1基因的mRNA序列（GenBank：.NM_001105038）設(shè)計(jì)引物，內(nèi)參基因β-actin引物亦根據(jù)mRNA序列（GenBank：AY141970）設(shè)計(jì)。引物由上海生工生物工程有限公司合成（具體見表1）。

表1 熒光定量PCR引物

1.3 奶牛乳腺細(xì)胞的感染

當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)密度為60%左右時(shí)，分別加入滅活的三種菌落—大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌，在0h、1h、6h、12h、24h檢測(cè)CXCR1.mRNA水平。

1.4 RT-PCR

反轉(zhuǎn)錄體系為20μL（反應(yīng)液在冰上配制）：在0.2mL的PCR管中加入1μg的總RNA，Oligo.dT.引物. 1μL，5×PrimeScriptTM.Buffer.4μL，隨機(jī)引物.1μL，PrimeScriptTM.RT.Enzyme.Mix.I.1μL，加Rnase.Free. dH2O至總體積為20μL。

將加好試劑的PCR管瞬時(shí)離心后放在PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。反轉(zhuǎn)錄條件如下：37℃、15min（反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)）；85℃、5s（反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)）；所得產(chǎn)物即為cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

表2 CXCR1基因在三種菌種刺激下的相對(duì)定量值

采用SYBR.GreenⅠ染料法進(jìn)行熒光定量，熒光定量PCR體系為20μL：SYBR.Premix.Ex.TaqTM（2×）10μL，上下游引物（10μM）各0.4μL，ROX.Reference. Dye.Ⅱ（50×）0.4μL，cDNA2μL，dH2O.6.8μL，以上步驟均為冰上操作，每個(gè)樣本設(shè)三個(gè)重復(fù)。

熒光定量PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性1min；95℃變性30s，60℃退火15s，72℃延伸34s，40個(gè)循環(huán)；為分析擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，PCR擴(kuò)增結(jié)束后采集多個(gè)信息點(diǎn)進(jìn)行溶解曲線分析，程序?yàn)椋?5℃.15s，60℃. 1min；95℃.15s，60℃.15s。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel、Primer.Premier.5.0、SPSS11.0，軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way.ANOVA），組間兩兩比較采用最小顯著差（LSD）法，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；熒光定量計(jì)算采用2-△△CT方法[10].。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA提取

RNA提取結(jié)果見圖1。由圖1可見，總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢出3條亮帶，從上到下分別為28s、18s和5s，說明提取的RNA完整性良好，無明顯降解，其OD260/OD280在1.8左右，純度較高，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 細(xì)胞中RNA的提取結(jié)果

2.2 CXCR1基因在三種菌落刺激下mRNA的表達(dá)變化

圖2 在3種菌落的刺激下CXCR1基因的表達(dá)量

奶牛乳腺細(xì)胞的CXCR1基因mRNA表達(dá)在大腸桿菌刺激下6h、12h達(dá)到最高；在金黃色葡萄球菌刺激下12h后達(dá)到最高值，在鏈球菌刺激下12h后達(dá)到最高，然后迅速下降（表2，圖2）。

3 討論

病原微生物感染是奶牛乳房炎發(fā)病的主要原因，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌與鏈球菌為主要致病菌。由于地域及氣候的原因，各個(gè)地區(qū)奶牛乳房炎的發(fā)病率不同。然而從分子水平上發(fā)現(xiàn)，很多與奶牛乳房炎相關(guān)的基因與奶牛乳房炎的發(fā)生率密切相關(guān)，并發(fā)揮作用。

研究發(fā)現(xiàn)CXCR1信號(hào)通路在某種程度上可能促進(jìn)炎性細(xì)胞及腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移[11～13]。CXCR1是通過與其配體結(jié)合，激活下游信號(hào)通路來調(diào)控炎性及腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。IL-8是CXCR1/2的一個(gè)重要配體，研究顯示MKN45細(xì)胞能自分泌IL-8。據(jù)報(bào)道，在一些腫瘤中IL-8的表達(dá)量能影響炎性及腫瘤的生長(zhǎng)和侵襲[14,15]。研究顯示在胃炎環(huán)境下，CXCR1及其配體在大多數(shù)的白細(xì)胞及胃黏膜細(xì)胞上均有表達(dá)，幽門螺桿菌（HP）感染會(huì)調(diào)節(jié)CXCR1與CXCR2的表達(dá)[16]。在急性炎癥反應(yīng)過程中，趨化因子在氨基葡聚糖作用下聚集至內(nèi)皮細(xì)胞表面，通過與表達(dá)相應(yīng)趨化因子受體的白細(xì)胞相結(jié)合改變白細(xì)胞表面的β2整合蛋白，與ICAM-1、ICAM-2等親和，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞釋放大量促炎細(xì)胞因子。以往的研究發(fā)現(xiàn)，CXCR1表達(dá)于中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、肥大細(xì)胞、Th1細(xì)胞等，然而在奶牛乳腺上皮細(xì)胞上的表達(dá)尚未發(fā)現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)，奶牛乳腺細(xì)胞在三種菌落感染下，CXCR1.mRNA水平在6h后顯著增加。趨化因子受體CXCR1作為奶牛乳房炎進(jìn)程中的重要參與因素，日益引起重視，然而CXCR1在三種菌落刺激下奶牛乳腺細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控機(jī)理尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

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Differentiation of mRNA Expression of CXCR1 Gene in Bovine Mammary Cells under Three Colonies Stimulation

WANG Zhen-zhen1, CHEN Ren-jin1, YANG Zhang-ping2, MAO Yong-jiang2, JI De-jun2
(1.Xuzhou Medical University, Xuzhou 212004; 2. Animal Science and Technology College, Yangzhou University, Yangzhou 225009)

This study was to explore expression changes of CXCR1 gene in bovine mammary gland cells under different colony stimulation. The mRNA level of CXCR1 gene was measured by SYBR Green Real-time PCR. The results showed that the mRNA expression of CXCR1 were sensitive to E.coli, S.aureus.and Streptoc. at the cellur level, and the expression levels were different in each time period. This study takes a foundation for further research on CXCR1 gene expression mechanism and prevention of mastitis in dairy cows.

CXCR1 gene; Real-time PCR; Bovine mammary epithelial cell

S823.3

A

1004-4264（2017）06-0027-04

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.06.006

2016-12-06

國(guó)家自然科學(xué)基金（31172171，31372286）；江蘇省自然科學(xué)基金（BK20151151）；江蘇省博士后基金；中國(guó)博士后基金（2016M590506）。

王珍珍（1982-），女，漢，碩士，助理實(shí)驗(yàn)師，主要從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)研究。

楊章平，漢，教授，主要從事動(dòng)物遺傳資源評(píng)價(jià)、保護(hù)與利用。