乳制品中苯甲酸的色譜分析方法研究進(jìn)展

張 強(qiáng)

（四川省輕工業(yè)研究設(shè)計(jì)院，成都 610081）

乳制品中苯甲酸的色譜分析方法研究進(jìn)展

張 強(qiáng)

（四川省輕工業(yè)研究設(shè)計(jì)院，成都 610081）

苯甲酸是常用的食品添加劑，但被禁止應(yīng)用于乳制品。乳制品中苯甲酸的來源可由天然馬尿酸在乳酸菌等作用下轉(zhuǎn)化而來，也可因人為添加而產(chǎn)生。過量苯甲酸可對(duì)人體造成損害。乳制品中苯甲酸的分析方法有高效液相色譜法、氣相色譜法、LC-MS法、GC-MS法等。

苯甲酸；色譜；乳制品；分析方法

苯甲酸（Benzoic.acid）是“國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)”食品法中最早允許添加的化學(xué)防腐劑之一。動(dòng)植物中發(fā)現(xiàn)的天然苯甲酸主要以游離態(tài)（苯甲酸）或者化合態(tài)（苯甲酸酯）的形式存在。工業(yè)上苯甲酸最初是由安息香膠干餾或堿水水解制得，也可由馬尿酸水解制得，現(xiàn)由鈷、錳等催化劑催化氧化甲苯制得或由鄰苯二甲酸酐水解脫羧制得。苯甲酸可穿透細(xì)菌細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)，干擾細(xì)胞膜的通透性，阻礙細(xì)胞膜對(duì)氨基酸的吸收，酸化細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)備堿，進(jìn)而抑制微生物細(xì)胞內(nèi)呼吸酶系活性，阻止乙酰輔酶A縮合反應(yīng)，從而起到防腐作用。它既能抑制廣譜范圍微生物的繁殖，又具有良好的殺菌作用[1]。苯甲酸具有殺菌率高、毒副作用小、化學(xué)性能穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。

但由于過量攝入苯甲酸對(duì)人體有害，所以苯甲酸不能作為日常食品的乳制品添加劑使用，對(duì)此我國《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》（GB2760）有嚴(yán)格規(guī)定。但據(jù)國內(nèi)調(diào)查表明，仍有少數(shù)不法商家向乳制品中添加苯甲酸，使多數(shù)居民對(duì)乳制品質(zhì)量安全堪憂[2～4]。另外，研究證明，乳制品也存在著一定量的天然苯甲酸，由于乳制品中蛋白質(zhì)含量高，機(jī)體復(fù)雜多變，嚴(yán)重干擾苯甲酸的分析檢測(cè)。因此，研究乳制品中苯甲酸的分析方法，是準(zhǔn)確判定該產(chǎn)品是否符合標(biāo)準(zhǔn)的重要手段。本文對(duì)乳制品中苯甲酸的來源及危害、乳制品中苯甲酸分析檢測(cè)方法進(jìn)行了綜述，希望對(duì)乳制品中苯甲酸檢測(cè)方法的發(fā)展有所幫助。

1 乳制品中苯甲酸的來源

1.1 天然來源

天然馬尿酸在乳酸菌等作用下可以轉(zhuǎn)化為苯甲酸，是乳制品中苯甲酸來源的主要途徑（圖1）。據(jù)馬景友等[5]研究證明，鮮牛奶中苯甲酸的含量變化主要是由牛奶后期處理過程中受細(xì)菌污染、大量繁殖的細(xì)菌分解馬尿酸轉(zhuǎn)化成苯甲酸所致，這是天然牛奶中苯甲酸的主要來源。Sieber.等[6]報(bào)道，乳制品的發(fā)酵過程中在乳酸菌作用下，馬尿酸脫甘氨酸生成苯甲酸，從而使酸牛乳中天然苯甲酸含量增加。謝國祥等[7]進(jìn)一步研究證明，牛乳中馬尿酸在乳酸菌存在的條件下3h后基本轉(zhuǎn)化為苯甲酸。另外，乳制品（干酪）中苯甲酸的來源還可由苯甲醛氧化、苯丙氨酸降解、發(fā)酵芳香族氨基等途徑產(chǎn)生[8]。

圖1 馬尿酸轉(zhuǎn)化為苯甲酸

1.2 人為添加

為達(dá)到延長(zhǎng)食品保存時(shí)間，增強(qiáng)感官性質(zhì)，滿足加工工藝過程的要求，國家允許在食品中加入少量合成或天然的化學(xué)物質(zhì)?！妒称诽砑觿┦褂眯l(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》（GB2760）允許苯甲酸及苯甲酸鈉作為果蔬汁(漿)類飲料、蛋白飲料、碳酸飲料、茶等食品的添加劑，但禁止作為乳制品添加劑。由于苯甲酸生產(chǎn)成本低、易獲得，少數(shù)不法商家將其濫用于乳制品，長(zhǎng)期食用就會(huì)攝入過量苯甲酸，對(duì)人體造成危害。

1.3 其他來源

乳制品中苯甲酸來源還與添加劑種類和添加量有關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道，飼料中的苯甲酸鈉也能對(duì)生鮮乳中苯甲酸含量產(chǎn)生影響[9]。

2 攝入過量苯甲酸的危害

2.1 苯甲酸的代謝

2.2 苯甲酸的危害

在規(guī)定使用限量?jī)?nèi)，苯甲酸作為食品添加劑是安全的，但試驗(yàn)表明長(zhǎng)期攝入含有苯中酸的食物會(huì)對(duì)身體產(chǎn)生危害。苯甲酸在肝臟內(nèi)降解，肝功能衰弱的人攝入苯甲酸會(huì)使病情加重；常人攝入過量的苯甲酸會(huì)加重肝臟負(fù)擔(dān)。苯甲酸可損傷線粒體DNA，導(dǎo)致細(xì)胞損傷，引起神經(jīng)系統(tǒng)的癥狀，還可引起哮喘等過敏反應(yīng)[11]。長(zhǎng)期作用還可能引起人慢性苯中毒，產(chǎn)生神經(jīng)衰弱如頭暈、記憶力減退、乏力等癥狀[12,13]。此外，若過量攝取苯甲酸及其鈉鹽，將出現(xiàn)飲食量及體重減少、腸出血、肝臟和腎臟肥大等癥狀，并使肝臟中磷脂減少、骨骼中鈣丟失、死亡率增加等[14]。

2.3 代謝物苯甲酸鈉的危害

人體代謝可將苯甲酸轉(zhuǎn)化為毒性更低的苯甲酸鈉，但研究表明苯甲酸鈉可以致使染色體斷裂而引起癌變；還可能成為血管性水腫和反復(fù)發(fā)作的急性蕁麻疹等疾病的誘因[15,16]。

2.4 與其他添加劑協(xié)同作用產(chǎn)生的危害

食品添加劑協(xié)同作用產(chǎn)生的危害表現(xiàn)為，共同作用致毒或相互反應(yīng)生成新的有害物質(zhì)。苯甲酸可能會(huì)在維生素C和重金屬硫酸鹽存在的條件下，反應(yīng)形成具有致癌性的苯，對(duì)人體的細(xì)胞膜造成損害[17]。付佳[18]對(duì)苯甲酸鈉與糖精鈉、檸檬黃的體外聯(lián)合毒性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，苯甲酸鈉+檸檬黃具有協(xié)同作用，這種效應(yīng)可能與某些食品添加劑影響兒童的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和改變行為有關(guān)；三種受試物單獨(dú)及聯(lián)合作用雖然沒有氧化性損傷作用，但都能引起DNA的斷裂損傷和.DPC增加。施春偉[19]研究證明，阿斯巴甜和苯甲酸鈉聯(lián)合使用會(huì)抑制BRL的細(xì)胞增殖，并使細(xì)胞周期阻滯在S期或者G0/G1期，增加細(xì)胞微核發(fā)生率、細(xì)胞壞死率和細(xì)胞調(diào)亡率；還會(huì)降低小鼠的體重。

3 乳制品中苯甲酸的分析方法

3.1 高效液相（HPLC）法

近幾年，由于高效液相色譜具有靈敏度高、速度快、分辨率高、色譜柱可反復(fù)使用、樣品量少且易回收等特點(diǎn)，逐漸成為乳制品中苯甲酸檢測(cè)技術(shù)的研究熱點(diǎn)，按照樣品前處理技術(shù)的不同可分為以下幾種方法：

3.1.1.沉淀法

該方法是在樣品前處理過程中加入酸堿、重金屬離子、有機(jī)物沉淀蛋白質(zhì)，以排除蛋白質(zhì)對(duì)檢測(cè)的干擾。①酸堿沉淀法..該法依靠酸堿性使樣品中蛋白質(zhì)變性沉淀，達(dá)到消除干擾的目的。由于該方法污染嚴(yán)重、試劑消耗大、分離效果不理想而逐漸被其他方法替代。②無機(jī)重金屬沉淀法..祝偉霞等[20]用醋酸鋅-亞鐵氰化鉀作為沉淀劑，測(cè)定奶粉、酸奶和其他發(fā)酵乳制品的苯甲酸和山梨酸含量，樣品加標(biāo)回收率為87.4%～110.0%，吸收波在227nm時(shí)苯甲酸檢測(cè)限為0.5μg/mL。王淼[21]報(bào)道用亞鐵氰化鉀-乙酸鋅為沉淀劑，建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定乳及乳制品中苯甲酸、山梨酸、安賽蜜和糖精鈉的方法，方法回收率在95.0%～103.0%，精密度(RSD)為1.70%～2.03%，檢出限分別為1.5、1.5、1.5、2.5μg/g。李素琴等[22]建立了乳制品中安賽蜜、糖精鈉、苯甲酸等7種食品添加劑的高效液相色譜分析方法。樣品處理后使用C18反相色譜柱分離，以甲醇-乙酸銨水溶液為流動(dòng)相梯度洗脫，紫外檢測(cè)器檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)230nm下的分離效果較好，回收率高。劉賜等[23]研究用金屬鹽、生物堿、有機(jī)溶劑作乳制品前處理劑，用高效液相色譜法測(cè)定乳制品中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉，結(jié)果進(jìn)一步證明金屬鹽沉淀劑效果好，能獲得滿意效果。③有機(jī)沉淀法..錢聰[24]對(duì)比乙酸鋅-亞鐵氰化鉀沉淀法、乙酸沉淀法、甲醇沉淀法，證明與國標(biāo)法相比，用乙酸和甲醇沉淀蛋白的方法操作簡(jiǎn)單，沉淀效果更好。孫偉等[25]用亞鐵氰化鉀-乙酸鋅溶液、無水乙醇、硫酸銅溶液、硫酸銅-氫氧化鈉溶液、高氯酸溶液處理乳制品樣品，獲得無水乙醇可替代質(zhì)量濃度為106g/L亞鐵氰化鉀溶液和19g/L乙酸鋅溶液的結(jié)論。

亞鐵氰化鉀溶液在使用過程中受熱分解產(chǎn)生的氰化物有劇毒，而金屬沉淀劑中含有大量的金屬離子能影響色譜柱的使用壽命，所以不是最佳的選擇方法，無水有機(jī)試劑作為沉淀劑則優(yōu)于上述試劑，但也會(huì)污染環(huán)境、影響試驗(yàn)人員安全。

3.1.2.萃取法

萃取技術(shù)近年發(fā)展出許多新興技術(shù)，如固相萃取、濁點(diǎn)萃取等，被用于乳制品樣品前處理研究過程中。楊紅梅報(bào)道[26]，使用PEP-SPE.6cc固相小柱吸附目標(biāo)物，建立起固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定牛奶及蛋白類飲料中苯甲酸等10種防腐劑的方法，該方法的檢出限在1.0mg/L～2.0mg/L，線性范圍1.0mg/L～100.0mg/L，牛奶加標(biāo)回收率在93.7%～114.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.59%～4.84%（n=4）。侯文欣等[27]以非離子表面活性劑、聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯(Tween-20)為萃取劑，建立了基于濁點(diǎn)萃取測(cè)定牛奶中苯甲酸的高效液相色譜法，最佳條件下R=0.9998，檢出限為0.025μg/mL，加標(biāo)回收率為98.90%～100.16%，SD為1.2%～2.5%。還有方法研究，用甲醇提取液態(tài)奶中的苯甲酸，用甲醇和三氯乙酸提取奶粉、酸奶中的苯甲酸，后用液相色譜方法分析，獲得較為理想的結(jié)果[28]。

3.2 氣相色譜（GC）法

氣相色譜技術(shù)是目前使用較多、應(yīng)用較早、運(yùn)行簡(jiǎn)單可靠的一種分離分析方法，該技術(shù)能用于氣體、有機(jī)物、部分無機(jī)物的分離分析。因此，也被廣泛用于乳制品中苯甲酸、脫氫乙酸、對(duì)羥基苯甲酸甲酯等食品添加劑含量的分析檢測(cè)中。歐陽懿建立了氣相色譜分析苯甲酸的方法，該方法分離度和重現(xiàn)性均較好[29]。.張紅霞等[30]應(yīng)用氣相色譜技術(shù)，建立了液體乳及乳粉中山梨酸、苯甲酸、脫氫乙酸、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯和對(duì)羥基苯甲酸丁酯共7種防腐劑的定量分析方法，結(jié)果表明該方法前處理簡(jiǎn)單快速、檢測(cè)效率高、線性范圍寬、靈敏度高。高星等[31]報(bào)道用氣相色譜法測(cè)定酸牛乳及含乳飲料中的苯甲酸、山梨酸，樣品經(jīng)醋酸鋅-亞鐵氰化鉀沉淀，濾液經(jīng)乙醚提取后上機(jī)測(cè)定，苯甲酸檢出限為9.5×10-10g，精密度變異系數(shù)為2.8%，平均回收率為101.1%。

3.3 液相/氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC/GC-MS)法

液相/氣相色譜-質(zhì)譜法，是一種集液相/氣相色譜對(duì)復(fù)雜樣品中目標(biāo)物質(zhì)有高效分離能力并具有質(zhì)譜特異選擇性和高靈敏度及分子信息于一體的現(xiàn)代分析技術(shù)，能為復(fù)雜樣品的分離分析提供有效手段。胡桂林等[32]建立了GC-MS測(cè)定牛奶和奶粉中苯甲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的方法，試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，靈敏度高，可以用于牛奶和奶粉中苯甲酸的檢測(cè)。張魯南等[33]報(bào)道了LC-MS測(cè)定牛奶中苯甲酸的方法，該方法快速、靈敏、特異性強(qiáng)。郭文麗等[34]研究使用液相色譜法（HPLC）同時(shí)測(cè)定乳制品中的馬尿酸和苯甲酸，該方法具有良好的準(zhǔn)確度、精密度和較高的重現(xiàn)性。但在使用此類高端分析儀器對(duì)復(fù)雜樣品分析時(shí)，樣品中往往可能含有與目標(biāo)物質(zhì)性質(zhì)相似的物質(zhì)，這些物質(zhì)會(huì)干擾儀器分析造成假陽性或假陰性的檢測(cè)結(jié)果。

4 總結(jié)與展望

乳制品中苯甲酸的天然來源，主要是由馬尿酸在厭氧細(xì)菌作用下代謝產(chǎn)生。過量攝入苯甲酸能對(duì)人體產(chǎn)生危害，甚至致癌、死亡。因此，有效測(cè)定乳制品中苯甲酸的含量，是控制苯甲酸產(chǎn)生的重要前提手段。色譜法是分析乳制品中苯甲酸含量的主要方法，其中高效液相色譜法由于其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)成為研究的熱點(diǎn)。但乳制品中蛋白質(zhì)含量高，嚴(yán)重影響乳制品中苯甲酸的測(cè)定結(jié)果，如何提高乳制品樣品前處理技術(shù)，成為準(zhǔn)確分析苯甲酸含量的重要問題。目前，乳制品樣品前處理方法有：沉淀法（酸堿沉淀法、重金屬沉淀法、有機(jī)沉淀法）和萃取法，兩者都存在一定程度的缺陷，還需深入探討和研究。今后，需新建立能進(jìn)一步滿足低耗高效、方便準(zhǔn)確、環(huán)保安全等要求的乳制品中苯甲酸含量的分析方法。

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Research Progress on Chromatography Analytical Methods of Benzoic Acid in Dairy Products

ZHANG Qiang
(Sichuan Research and Design Institute of Light Industry, Chengdu 610081)

Benzoic acid is a kind of common food additive, which is widely added to the food. This paper systematically analyzed the source of benzoic acid and the damage to human body caused by excessive intake of it in dairy products. The high performance liquid chromatography (HPLC),gas chromatography,LC-MS,GC-MS etc method for the analysis of benzoic acid in dairy products were introduced.

Benzoic acid; Chromatography; Dairy products; Analytical method

TS252.1

A

1004-4264（2017）06-0045-04

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.06.011

2017-01-16

張強(qiáng)（1989-），男，漢族，碩士，長(zhǎng)期從事分析化學(xué)相關(guān)領(lǐng)域研究。