五味子乙素調(diào)控NF-κB通路對順鉑致HK-2細(xì)胞炎癥損傷的保護作用

李 佳，尹一子，簡曉順，林 蔚

（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，廣東 廣州 510095）

·實驗研究·

五味子乙素調(diào)控NF-κB通路對順鉑致HK-2細(xì)胞炎癥損傷的保護作用

李 佳，尹一子，簡曉順，林 蔚

（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，廣東 廣州 510095）

目的 研究五味子乙素對順鉑致HK－2細(xì)胞炎癥損傷的保護作用及相關(guān)機制。方法 以不同濃度的五味子乙素及順鉑干預(yù)人腎小管上皮HK－2細(xì)胞，CCK－8法檢測細(xì)胞活性，Hoechst33258熒光染色法觀察細(xì)胞形態(tài)變化，Western blot法檢測NF－κB活化，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測細(xì)胞上清液中炎性細(xì)胞因子[腫瘤壞死因子－α(TNF－α)、白細(xì)胞介素1β(IL－1β)、白細(xì)胞介素6(IL－6)]水平，實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)(RT－PCR)法檢測細(xì)胞中TNF－α，IL－1β，IL－6的mRNA表達。結(jié)果 與對照組相比，順鉑組細(xì)胞活性顯著下降，細(xì)胞形態(tài)明顯改變；五味子乙素呈濃度依賴性地減輕順鉑的細(xì)胞毒性作用。同時，五味子乙素能顯著抑制順鉑所致NF－κB活化及炎性細(xì)胞因子（TNF－α，IL－1β，IL－6）在細(xì)胞上清液中及mRNA表達的升高。結(jié)論 五味子乙素能通過調(diào)控NF－κB通路對抗順鉑所致腎小管上皮細(xì)胞的炎癥損傷。

五味子乙素；順鉑；腎毒性；炎性反應(yīng)；NF－κB通路；HK－2細(xì)胞

順鉑（cisplatin）是目前臨床常用的廣譜抗癌藥，治療各種實體瘤如肺癌、乳腺癌、卵巢癌等均效果良好[1]。因有腎毒性，其臨床應(yīng)用受到極大限制[2－3]，目前臨床普遍使用水化法預(yù)防順鉑腎毒性，但仍有25%～35%的患者在首次接受順鉑治療后出現(xiàn)腎功能減退[4]，這往往導(dǎo)致后續(xù)化學(xué)治療（簡稱化療）劑量的降低或化療周期的延遲、終止，影響整體治療效果。因此，有效防治腎毒性是臨床使用順鉑化療過程中亟待解決的問題[5]。五味子乙素（schisandrin B，Sch B）是從中藥五味子成熟果實中提取的一種二苯環(huán)辛二烯類木脂素成分，具有顯著的抗氧化和抑制細(xì)胞損傷凋亡作用。前期研究表明，其能顯著減輕順鉑對人腎小管上皮HK－2細(xì)胞的毒性，且這一作用與五味子乙素激活Nrf2／ARE通路和對抗氧化應(yīng)激損傷有關(guān)[6]，但其作用機制尚未完全闡明。炎癥損傷是順鉑腎毒性的細(xì)胞生物學(xué)機制之一[7]。本研究中以HK－2細(xì)胞為模型，探討五味子乙素通過調(diào)控NF－κB通路、對抗炎癥損傷而減輕順鉑腎毒性的作用機制?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：HK－2細(xì)胞由中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎病實驗室聶靜教授惠贈；順鉑（99.0%，美國Sigma公司）；五味子乙素（99.1%，上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司）；DMEM／F12培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）；胎牛血清（美國Hyclone公司）；CCK－8試劑盒，Hoechst33258染色試劑，細(xì)胞蛋白抽提試劑盒，BCA蛋白濃度測定試劑盒（杭州碧云天公司）；I－κB，β－actin抗體，抗小鼠IgG （H＋L）二抗（美國 CST公司）；腫瘤壞死因子 －α(TNF－α)、白細(xì)胞介素 1β(IL－1β)、白細(xì)胞介素 6 (IL－6)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒（美國R＆D公司）；RNA提取及實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)(RT－PCR)檢測試劑（日本Takara公司）；其余試劑為分析純。

儀器：CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；熒光倒置顯微鏡（德國Leica公司）；蛋白電泳儀（美國 BIO－RAD公司）；Real－time PCR儀（瑞士羅氏公司）。

1.2 方法

細(xì)胞培養(yǎng)：HK－2細(xì)胞置含10%胎牛血清、100U／mL青霉素、100μg／m L鏈霉素的DMEM／F12培養(yǎng)液中，在5%CO2及37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用于試驗。

CCK－8法檢測細(xì)胞活性：取對數(shù)生長期的HK－2細(xì)胞，以細(xì)胞數(shù)1×104個／mL（200μL／孔）接種于96孔板，置5%CO2及37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后更換含5%胎牛血清培養(yǎng)基，加入不同濃度（0.5，1.0，2.0μmmol／L）五味子乙素預(yù)孵育12 h后，除盡培養(yǎng)基，順鉑（30μmmol／L）孵育24 h，同時設(shè)置空白對照組、溶劑對照組、調(diào)零組。孵育結(jié)束后，每孔加入20μLCCK－8溶液，置5%CO2及37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1 h，酶標(biāo)儀450 nm波長檢測吸光度。每組設(shè)6個副孔，重復(fù)3次，結(jié)果以細(xì)胞存活率表示，細(xì)胞存活率(%)＝試驗組吸光度值／空白對照組吸光度值×100%。

Hoechst33258熒光染色法觀察細(xì)胞形態(tài)：將HK－2細(xì)胞接種于 24孔板中，加入不同濃度（0.5，1.0，2.0μmmol／L）五味子乙素預(yù)孵育 12 h后以順鉑（30μmmol／L）孵育24 h。處理結(jié)束后棄去培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，加入0.5 m L Hoechst 33258染色液，染色10min。去除染色液，PBS洗滌2次，吸盡液體，熒光倒置顯微鏡觀察并拍照。

Western blot法檢測細(xì)胞中I－κB蛋白水平：不同濃度（0.5，1.0，2.0μmmol／L）五味子乙素預(yù)孵育12 h后以順鉑（30μmmol／L）處理HK－2細(xì)胞24 h，棄去培養(yǎng)液，根據(jù)試劑盒說明書提取、分離蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取等量樣品進行SDS－PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加入稀釋的一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜3次（每次10min），二抗室溫孵育1 h，ECL顯色。

ELISA法檢測細(xì)胞上清液中TNF－α，IL－1β，IL－6水平：不同濃度（0.5，1.0，2.0μmmol／L）五味子乙素預(yù)孵育12 h后以順鉑（30μmmol／L）處理HK－2細(xì)胞24 h，吸取培養(yǎng)基至離心管中，2 500 r／min離心5 min，收集上清。根據(jù)試劑盒說明書，夾心ELISA法測定上清液中TNF－α，IL－1β，IL－6水平。

RT－PCR法檢測TNF－α，IL－1β，IL－6mRNA水平：不同濃度（0.5，1.0，2.0μmmol／L）五味子乙素預(yù)孵育12 h后，以順鉑（30μmmol／L）處理HK－2細(xì)胞24 h，棄去培養(yǎng)液，用Trizol等試劑提取總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。所得cDNA在RTPCR儀上進行反應(yīng)。每次擴增的同時設(shè)置cDNA的陰性對照。將PCR產(chǎn)物作熔解曲線，以證實以上PCR反應(yīng)產(chǎn)物特異性良好。統(tǒng)計△Ct值以比較各組mRNA水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞活性

順鉑（30μmmol／L）處理HK－2細(xì)胞24 h后，與溶劑對照組相比，細(xì)胞活性明顯降低（P＜0.01）；而不同濃度（0.5，1.0，2.0μmmol／L）五味子乙素能顯著減輕順鉑所致細(xì)胞活性降低，且作用呈濃度依賴性（圖1）。

注：A組為溶劑對照組，B為五味子乙素2.0μmol／L組，C組為順鉑組，D組為順鉑 ＋五味子乙素 0.5μmol／L組，E組為順鉑 ＋五味子乙素 1.0μmol／L組，F(xiàn)組為順鉑 ＋五味子乙素2.0μmol／L組，圖2至圖5同。與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與順鉑組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；圖3至圖5同。

2.2 細(xì)胞形態(tài)

對照組HK－2細(xì)胞核數(shù)量密集，排列緊密，呈現(xiàn)正常的藍色。順鉑（30μmmol／L）處理 HK－2細(xì)胞 24 h后，細(xì)胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染，顏色發(fā)白，排列不緊密，細(xì)胞數(shù)量明顯減少。不同濃度（0.5，1.0，2.0μmmol／L）五味子乙素能抑制順鉑所致細(xì)胞膜破裂（圖2）。

2.3 細(xì)胞中I－κB蛋白水平

順鉑（30μmmol／L）處理HK－2細(xì)胞24 h后，I－κB蛋白水平與對照組相比明顯下降（P＜0.01），表明NF－κB活化增強，不同濃度（0.5，1.0，2.0μmmol／L）五味子乙素能呈濃度依賴性地抑制順鉑所致NF－κB的活化（圖3）。

圖2 不同濃度五味子乙素對順鉑所致細(xì)胞形態(tài)改變的影響

2.4 細(xì)胞上清液中TNF－α，IL－1β，IL－6水平

順鉑（30μmmol／L）處理 HK－2細(xì)胞 24 h后，HK－2細(xì)胞培養(yǎng)上清液中炎性因子TNF－α，IL－1β，IL－6的水平均升高（P＜0.01），而不同濃度（0.5，1.0，2.0μmmol／L）五味子乙素給藥組細(xì)胞上清液中各炎性細(xì)胞因子濃度與順鉑組相比顯著降低，且呈濃度依賴性（圖4）。

2.5 TNF－α，IL－1β，IL－6 m RNA水平

順鉑（30μmmol／L）處理HK－2細(xì)胞24 h后，細(xì)胞內(nèi)各炎性細(xì)胞因子（TNF－α，IL－1β，IL－6）的 mRNA相對表達水平升高（P＜0.01），而不同濃度的五味子乙素組上述炎癥介質(zhì)的mRNA表達水平較順鉑組降低，趨勢與細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的濃度變化一致（圖5）。

圖3 不同濃度五味子乙素對順鉑所致I－κB降解的影響（n＝3）

3 討論

目前認(rèn)為，順鉑致腎毒性的細(xì)胞生物學(xué)機制涉及細(xì)胞凋亡、DNA損傷、炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激等[7]。近年來許多研究發(fā)現(xiàn)，炎性反應(yīng)在誘發(fā)順鉑腎毒性中發(fā)揮了重要作用[8]。順鉑在腎小管細(xì)胞中通過促進抑制性蛋白I－κB的降解，激活促炎轉(zhuǎn)錄因子NF－κB，誘導(dǎo)一系列炎癥因子的表達，引發(fā)炎性反應(yīng)[9]。其中TNF－α是順鉑所致炎性反應(yīng)中的關(guān)鍵因子，TNF－α在腎小管細(xì)胞中的表達增加，可激活整個炎性細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，促進白細(xì)胞介素1β、白細(xì)胞介素4、白細(xì)胞介素6（IL－1β、IL－4，IL－6）的生成[10]。筆者在HK－2細(xì)胞模型中證實，順鉑能激活NF－κB，促進多種炎性細(xì)胞因子表達，造成炎癥損傷，該結(jié)果與其他文獻在整體動物實驗中的報道一致[9－10]。

圖4 不同濃度五味子乙素對順鉑所致細(xì)胞培養(yǎng)上清液中炎性細(xì)胞因子水平升高的影響（n＝3）

圖5 不同濃度五味子乙素對順鉑所致炎性細(xì)胞因子mRNA表達升高的影響

五味子乙素是五味子有效成分中含量豐富、活性最強的化合物之一，不僅可通過增強線粒體功能與結(jié)構(gòu)的完整性，表現(xiàn)出對細(xì)胞凋亡的保護作用，還可刺激機體細(xì)胞產(chǎn)生更多的抗氧化劑谷胱甘肽，并增加各種抗氧化酶的活性，抵抗毒性物質(zhì)對心臟、肝臟、腎臟、大腦等細(xì)胞或組織的損傷[11]。此外，還有研究顯示，五味子乙素具有抗癌活性。Wu等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，五味子乙素通過Caspase－3途徑誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡，下調(diào)熱休克蛋白HSP70的表達，抑制腫瘤細(xì)胞增殖。Xu等[13]的研究則發(fā)現(xiàn)，五味子乙素在預(yù)防抗癌藥多柔比星引起的慢性心臟毒性的同時，還能增加腫瘤細(xì)胞對多柔比星的敏感性，增強其抗腫瘤活性。目前，關(guān)于五味子乙素對抗藥源性腎損傷的報道較少。有研究發(fā)現(xiàn)，五味子乙素能通過增加線粒體的抗氧化狀態(tài)及結(jié)構(gòu)、功能的完整性，減輕慶大霉素引起的嚴(yán)重腎臟損傷[14]。關(guān)于五味子乙素抗炎作用的報道較少，Rahul等首次發(fā)現(xiàn)五味子乙素在淋巴細(xì)胞中通過調(diào)節(jié) NF－κB及 Nrf2發(fā)揮抗炎效果[15]。本研究結(jié)果顯示，五味子乙素能抑制順鉑在HK－2細(xì)胞中誘導(dǎo)的NF－κB活化，抑制炎性細(xì)胞因子的表達，從而減輕順鉑對細(xì)胞的炎性損傷。

Nrf2／ARE通路除了與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，與炎性反應(yīng)也有關(guān)聯(lián)。Nrf2的激活可抑制NF－κB的活化，而Nrf2靶基因血紅素加氧酶－1(HO－1)的激活則能減少白細(xì)胞的黏附、遷移及細(xì)胞因子的生成，還能誘導(dǎo)抗炎因子IL－10的生成。在五味子乙素對順鉑致腎損傷的保護作用中，Nrf2與NF－κB是否通過交互對話發(fā)揮協(xié)同作用，仍有待于進一步研究。

五味子乙素能抑制順鉑在HK－2細(xì)胞中誘導(dǎo)的NF－κB活化，抑制炎性細(xì)胞因子的表達，減輕順鉑對腎小管上皮細(xì)胞的炎癥損傷。本研究結(jié)果為臨床合理使用五味子乙素防治順鉑腎毒性提供了實驗依據(jù)。

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Protective Effect of Schisandrin B for Protecting Cisp latin－Induced Inflamm atory Dam age of HK－2 Cells Through Regulating NF－κB Pathway

Li Jia，Yin Yizi，Jian Xiaoshun，Lin Wei
（Cancer Center of Guangzhou Medical University，Guangzhou，Guangdong，China 510095)

Objective To investigate the protective effect of schisandrin B against Cisplatin－induced inflammation damage in HK－2 cells and its related mechanism.M ethods After treated with various concentrations of schisandrin B and Cisplatin，viability of HK－2 cells was determined by CCK－8 assay；cellular morphology was evaluated by Hoechst 33258 staining；activation of NF－κB was detected by Western blot；levels of TNF－α，IL－1β，IL－6 in supernatants were measured by ELISA，mRNA expressions of TNF－α，IL－1β，IL－6 were detected by RT－PCR.Results Compared with the control group，the cell activity of the cisplatin group decreased significantly，and the cell morphology changed significantly.Schisandrin B dose－dependently reduced the cytotoxicity induced by cisplatin，at the same time，schisandrin B significantly inhibited the activation of NF－κB induced by Cisplatin and reversed the increase of levels of TNF－α，IL－1β，IL－6 in supernatants and mRNA expressions.Conclusion Schisandrin B can against Cisplatin－induced inflammation damage in HK－2 cells through regulating NF－κB pathway.

schisandrin B；Cisplatin；nephrotoxicity；inflammatory reaction；NF－κB pathway；HK－2 cell

R285.5；R287.1；R979.1

：A

：1006－4931(2017)12－0011－04

2016－11－09)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.12.003

廣州醫(yī)科大學(xué)博士啟動項目[2013C64]。

李佳（1985－），女，博士研究生，主管藥師，研究方向為腫瘤臨床藥學(xué)、藥物毒理學(xué)，（電話）020－66673666－2045。