HerpesSimplexVirusType1感染SH—SY5Y細(xì)胞與Aβ1—42誘導(dǎo)SH—SY5Y細(xì)胞AD模型比較

徐曉艷　封玉玲　李小山

【摘要】目的：探討HSV-1感染SH-SY5Y細(xì)胞后，與Aβ1-42誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞模型的病理差異。方法：建立HSV-1感染和Aβ1-42作用的SH-SY5Y細(xì)胞模型，同時設(shè)立未加干預(yù)的正常對照組，RT-PCR的方法檢測炎癥因子（IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α及iNOS）在mRNA的表達(dá)水平，Western blot檢測炎癥通路相關(guān)蛋白（BDNF、NF-κB、Cox-2、TNF-α、iNOS）的表達(dá)水平，對比差異。結(jié)果：與正常對照組相比HSV-1感染組和Aβ1-42模型組有顯著差異（p<0.05），HSV-1感染組與Aβ1-42模型組相比有著較為一致的變化趨勢。結(jié)論：HSV-1感染SH-SY5Y細(xì)胞也會導(dǎo)致與AD細(xì)胞模型相同的通路損傷，HSV-1的感染可能是導(dǎo)致AD的潛在因素之一。

【關(guān)鍵詞】HSV-1；AD ；Aβ1-42；SH-SY5Y細(xì)胞；NF-κB炎癥通路

【中圖分類號】R786 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】2095-6851（2017）07-0-01

Herpes Simplex Virus Type 1（單純皰疹病毒1型）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的常見病原體，引起宿主的局灶性壞死性腦炎，臨床預(yù)后差，患者會遺留有不同程度的神經(jīng)功能損傷[1]。阿爾茨海默癥（Alzheimer' s disease，AD），又稱老年癡呆，是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性變，以認(rèn)知功能障礙為主要臨床表現(xiàn)，隨著人口老齡化的增長，此病的發(fā)病率繼續(xù)成上升趨勢，成為人類的一大負(fù)擔(dān)[2]。本實(shí)驗(yàn)以此為基礎(chǔ)，HSV-1感染SH-SY5Y細(xì)胞后的病理表現(xiàn)，與SH-SY5Y細(xì)胞的AD模型相對比，以AD發(fā)病過程中經(jīng)典炎癥通路NF-κB及其下游的相關(guān)蛋白為主線，探討HSV-1感染后與AD發(fā)病之間可能的聯(lián)系，為進(jìn)一步研究提供參照。

1.材料與方法

1.1 材料與試劑

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SH-SY5Y購自美國細(xì)胞庫（ATCC），GIBCO胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)液購自Invitrogen公司；Aβ1-42購自Sigma公司；RT-PCR試劑購自日本TAKARA公司；炎癥因子（IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α及iNOS）引物購自上海生工公司，BDNF鼠單抗（15KD，ab205067）、NF-κB兔單抗（50KD/100KD，ab32360），Cox-2兔單抗（72KD，ab62331），TNF-α兔多抗（16KD，ab6671），iNOS兔多抗（131KD，ab15323），GAPDH鼠單抗（36KD，ab8245）購自abcam公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔和山羊抗小鼠抗體購自上海碧云天公司（A019，A026）；細(xì)胞裂解液、BCA蛋白測定試劑盒購自北京普利萊技術(shù)有限公司；蛋白酶抑制劑購自Roche公司；PVDF膜購自Millipore公司；發(fā)光液購自上海碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 病毒液準(zhǔn)備

利用Vero細(xì)胞擴(kuò)增HSV-1病毒并測定其滴度，將實(shí)驗(yàn)室保存的HSV-1長期穩(wěn)定感染的Vero細(xì)胞復(fù)蘇，待細(xì)胞融合至80%以上時收取細(xì)胞及培養(yǎng)上清液，-80℃冰箱反復(fù)凍融3次使細(xì)胞裂解，HSV-1病毒顆粒釋放，3000r/min離心15min，收集上清液，即為病毒液，保存于-80℃冰箱。通過空斑法定量（Plaque for ming unit ， PFU）法，確定其感染滴度為107 PFU。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和病毒感染

SH-SY5Y細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。待其單層細(xì)胞融匯80%時，用上述提取的HSV-1病毒液（ 107PFU）感染SH-SY5Y細(xì)胞，置培養(yǎng)箱中孵育2h，吸去病毒上清液液，再換含 2 %胎牛血清的維持液，置37 ℃、5 % CO2 孵箱繼續(xù)培養(yǎng)，作為HSV-1病毒感染組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以病毒感染15h 后的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞；同時設(shè)立Aβ1-42誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞模型組（Aβ1-42 15μM 誘導(dǎo)損傷15h）和未加處理的正常對照組SH-SY5Y細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)分組。

1.4 RT-PCR檢測HSV-1糖蛋白D的表達(dá)

糖蛋白D（gD）是HSV-1感染組成性表達(dá)的基因，根據(jù)gD基因序列（登錄號：X14112）設(shè)計(jì)引物，上游引物：5'-GCAACTGTGCTATCCCCATCA-3'，下游引物：5'-CTCCGTCCAGTCGTTTATCTT-3'，擴(kuò)增序列長度為221bp。從感染組和模型組以及正常組細(xì)胞中提取總RNA，以隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測感染組的細(xì)胞中糖蛋白D的mRNA表達(dá)情況，以確定HSV-1感染是否建立。

1.5 RT-PCR檢測炎性因子的mRNA水平變化

分別提取正常組、模型組和HSV-1病毒感染組細(xì)胞的總RNA，使用TAKARA試劑盒，對炎癥因子（IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α及iNOS）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增后，判斷其mRNA水平的變化。

1.6 Western blot檢測炎癥因子的表達(dá)AD主要相關(guān)的炎癥因子包括BDNF、NF-κB，Cox-2，TNN-α，iNOS蛋白的檢測。分別提取HSV-1感染SH-SY5Y細(xì)胞15h后及模型組和正常組細(xì)胞的總蛋白，測定蛋白質(zhì)濃度。蛋白樣品中加入5×緩沖液后，用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體；加入化學(xué)發(fā)光試劑反應(yīng)5min，將X射線底片放在聚偏二氟乙烯（Polyvinylicdene fluoride，PVDF）上曝光10min，沖洗顯影。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。組間差異顯著性采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

2.1 HSV-1感染SH-SY5Y細(xì)胞

病毒感染后12h，瓊脂糖凝膠電泳分析各組細(xì)胞的RT-PCR產(chǎn)物，病毒感染組細(xì)胞在221bp處可見特異性條帶（圖1），而其他兩組細(xì)胞為陰性結(jié)果。

2.2 RT-PCR法檢查炎性因子（IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α及iNOS） mRNA的變化，經(jīng)PCR檢測發(fā)現(xiàn)，炎癥因子在病毒感染組和模型組呈現(xiàn)相一致的改變（圖2），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。

2.3 炎癥通路相關(guān)蛋白檢測

經(jīng)Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，炎癥因子在病毒感染組和模型組呈現(xiàn)相一致的改變（圖3），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。

3.討論

HSV-1也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的病原體，有較強(qiáng)的嗜神經(jīng)作用，導(dǎo)致神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的損傷，但是其確切的致病機(jī)制也尚未明確。

本次研究將Aβ1-42誘導(dǎo)的經(jīng)典AD細(xì)胞模型與HSV-1感染的SH-SY5Y相對比發(fā)現(xiàn)，在炎癥因子（IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α及iNOS）mRNA水平上和炎癥通路相關(guān)蛋白（BDNF、NF-κB、Cox-2、TNF-α、iNOS）的表達(dá)水平上都呈現(xiàn)相一致的變化差異。其中，炎癥因子（IL-2、IL-4、IL-10）作為免疫機(jī)制的重要因子，在病毒感染等外界的不良刺激下，會出現(xiàn)分泌異常的情況。BDNF在兩個實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)減弱，這可能是HSV-1和Aβ1-42干擾神經(jīng)細(xì)胞微環(huán)境，進(jìn)而影響到神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷，但是神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)和受體受到多重因素的調(diào)控，兩者是否具有相同的作用機(jī)制，還需進(jìn)一步的研究。HSV-1的感染導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，可能是機(jī)體或細(xì)胞的免疫防御反應(yīng)，也可能是病毒擴(kuò)散過程中對宿主的損傷[6]。

綜上所述，本研究通過體外實(shí)驗(yàn)初步探究了HSV-1感染SH-SY5Y細(xì)胞與Aβ1-42誘導(dǎo)AD模型的病理變化，發(fā)現(xiàn)在對炎癥通路的干擾上，二者有著相似的表達(dá)差異，為后期研究提供了參考。但是HSV-1是不是導(dǎo)致AD的因素之一，尚需大量的研究論證，包括體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。

參考文獻(xiàn)

[1]Marques C P ，Hu S ，Sheng W ，et al. Microg lial cellsinitiate vigo rous yet non -protective immune responsesduring HSV-1 brain infection [J].Virus Res，2006，121（1）：1 -10.

[2]畢丹蕾，文郎，熊偉，等. 阿爾茨海默病的可能藥物靶點(diǎn)和臨床治療研究進(jìn)展[J]. 中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志. 2015，8（4）： 507-536.

[3]SeIkOe DJ.AIzheimers disease is a synaptic failure[J].Science，2002. 298（5594）：789-791.

[4]Junq SS，Nalbantoglu J，Cashman NR. Alzheimers beta-amyloid precursor protein is expressed on the surface of immediately ex vivo braincell： a flow cytometric study [J]. J Neurosci Res，1996，46（3） ： 336-348.

[5]Sam G. The role of cerebral amyloid β accumulation in common forms of Alzheimer disease[J]. J Clin Invest，2005，115 （5） ：1121.

[6]侯云，李玲，胡明，等. HSV-1 感染對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞NGF和BDNF表達(dá)變化的研究[J]. 病毒學(xué)報. 2010，26（6）： 477-482.