山藥組織培養(yǎng)研究進(jìn)展

蒙真鋮++蘇翠++楊曦++孔得信

摘 要 介紹了山藥組織培養(yǎng)的國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展，包括山藥組織培養(yǎng)的莖尖培養(yǎng)、零余子培養(yǎng)、愈傷組織培養(yǎng)等方法；總結(jié)山藥組織培養(yǎng)的條件和目前存在的問(wèn)題，并對(duì)今后的發(fā)展作出預(yù)測(cè)。

關(guān)鍵詞 山藥 ；組織培養(yǎng) ；研究綜述

中圖分類(lèi)號(hào) S632.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.07.017

Research Advances in Tissuce Culture of Chinese Yam

MENG Zhencheng SU Cui YANG Xi KONG Dexin

（Honghe Research Institute of Tropical Agriculture， Hekou Yunnan 661300）

Abstract The research activities and progresses made in tissue culture of Chinese yam were introduced， including yam stem tip culture， bulbil culture and callus culture. The conditions and current problems of yam tissue culture were summarized， and the prospect of tissue culture was put forward.

Keywords Chinese yam ； tissue culture ； research review

山藥，又名薯蕷（Dioscorea opposita Thunb），為薯蕷科（Dioscoreaceae）薯蕷屬（Dioscorea L.）一年生或多年生纏繞性藤本植物。山藥主要產(chǎn)于中國(guó)，以及印度、緬甸、朝鮮和日本等東南亞一帶。中國(guó)栽培山藥的時(shí)間較長(zhǎng)，主產(chǎn)地為河南、湖南、湖北、山西、云南、河北、陜西、江浙、江西、貴州、四川[1]等?。▍^(qū)）。山藥按形狀可分為三大類(lèi)型，分別為長(zhǎng)山藥、扁山藥和圓山藥；蔡金輝、黃曉輝等[2]將中國(guó)山藥資源分為2個(gè)種，5個(gè)變種以及10個(gè)品種種群。山藥地下肉質(zhì)塊莖營(yíng)養(yǎng)成分豐富，除了含有脂肪、糖類(lèi)、蛋白質(zhì)、維生素、膽堿和淀粉酶等成分，還含有鈣、碘、磷和鐵等人體不可缺少的無(wú)機(jī)鹽和微量元素[3]。山藥具有較高的食用和藥用價(jià)值，對(duì)慢性腸炎、腎脾病、糖尿病等人體疾病有輔助療效，也是重要的出口特產(chǎn)蔬菜之一[4]，還可以制作罐頭，做成飲料，醬油及各種保健品[5]。它與懷地黃、懷牛膝、懷菊花、合稱(chēng)“四大懷藥”[6]。

中國(guó)是山藥重要的原產(chǎn)地和馴化中心，已有2 500 a的栽培歷史，除西藏和東北等少數(shù)地區(qū)外，其他各地均有栽培種植[4]。近年來(lái)，隨著生活水平的提高，山藥食用及藥用價(jià)值越來(lái)越受到人們的重視，其需求量不斷增長(zhǎng)，嚴(yán)重出現(xiàn)了供不應(yīng)求的現(xiàn)象，而且長(zhǎng)期傳統(tǒng)育種，容易造成品質(zhì)退化，產(chǎn)量降低甚至品種變異，且抗病抗蟲(chóng)能力降低，導(dǎo)致某些優(yōu)良品種趨于滅絕[7-8]，限制了山藥的種植和產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

以組織培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ)的離體快速繁殖是應(yīng)用最廣泛和最有效的一種育苗技術(shù)。植物組織培養(yǎng)是利用植物細(xì)胞的全能性，在無(wú)菌條件下，把離體的植物器官誘導(dǎo)并產(chǎn)生愈傷組織、不定芽或不定根，最后形成完整植株的一種技術(shù)。筆者通過(guò)對(duì)近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者在山藥組織培養(yǎng)方面的研究成果進(jìn)行了總結(jié)，希望能為此領(lǐng)域未來(lái)的研究提供一些參考。

1 山藥外植體培養(yǎng)

山藥組織培養(yǎng)技術(shù)所使用的外植體包括莖段（帶頂芽和腋芽）、葉片、零余子和塊莖等。

1.1 莖段

通過(guò)利用山藥莖段作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，可以快速獲得優(yōu)質(zhì)無(wú)菌種苗。馬林等[9]通過(guò)采用黃山藥的帶芽莖段為外植體，建立了黃山藥的組培快繁技術(shù)體系。蔡建榮等[10]采用長(zhǎng)山藥莖段作為外植體，組培出了生長(zhǎng)健壯的長(zhǎng)山藥無(wú)菌幼苗植株；趙艷紅等[11]以‘桂淮2號(hào)，‘桂淮5號(hào)和野生種‘GY483個(gè)不同山藥品種的莖段為材料，研究培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件對(duì)這3個(gè)品種愈傷組織誘導(dǎo)的影響，發(fā)現(xiàn)以MS為基本培養(yǎng)基，添加6-BA 2.0 mg/L 和NAA 2.0 mg/L的組合是誘導(dǎo)愈傷組織較好的培養(yǎng)基，而光照的強(qiáng)弱對(duì)這3個(gè)山藥品種愈傷組織的誘導(dǎo)沒(méi)有影響；劉金英等[12]以佛手山藥莖段為外植體，發(fā)現(xiàn)MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L是誘導(dǎo)愈傷組織較好的培養(yǎng)基，誘導(dǎo)率為36.5%；初代培養(yǎng)以MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L或MS+6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.1 mg/L效果較好；繼代培養(yǎng)以MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L效果最好；生根以1/2MS+NAA 0.5 mg/L，附加0.06%活性炭，生根率達(dá)87.4%。王碧琴、韓曉勇等[13-14]分別以紫山藥莖段為材料，發(fā)現(xiàn)隨著6-BA濃度的增加，不定芽增殖率出現(xiàn)先低后高，再降低的現(xiàn)象；MS+6-BA 0.5 mg/L～1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L的培養(yǎng)基對(duì)不定芽有較高的分化率和增殖率；韓曉勇等[15]發(fā)現(xiàn)，MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L的培養(yǎng)基對(duì)鐵棍山藥莖段的誘導(dǎo)效果較好；MS+6-BA 1.5 mg/L最適合其增殖，生根培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 1.0 mg/L+0.02%活性炭；平阿敏[16]則認(rèn)為，適合鐵棍山藥生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.05 mg/L。蔡建榮[17]發(fā)現(xiàn)，MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1-0.5 mg/L的培養(yǎng)基較適合寸金薯莖段的誘導(dǎo)，且不定芽成苗時(shí)間較短，數(shù)量較多，芽體健壯飽滿(mǎn)。蔡月琴[18]發(fā)現(xiàn)，改良MS+TDZ 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L更適合漳州云霄毛山藥莖段的增殖，增殖系數(shù)為8.56，且植株生長(zhǎng)健壯。

1.2 零余子

李明軍[19]研究了光照條件對(duì)山藥零余子愈傷組織誘導(dǎo)的影響，發(fā)現(xiàn)在暗培養(yǎng)條件下更有利于其愈傷組織的誘導(dǎo)。郭君麗[20]研究了不同光照條件和不同激素配比對(duì)長(zhǎng)山藥零余子脫分化和再分化的影響，得出在6-BA 2 mg/L+NAA 2 mg/L和6-BA 2 mg/L+4 mg/L 的2種培養(yǎng)基上，其愈傷組織誘導(dǎo)率最高；白光和紅光更有利于愈傷組織的誘導(dǎo)，而藍(lán)光更有利于愈傷組織的分化。張志勇等[21]采用龍巖寸金薯，龍巖大池淮山以及練成宣和千金薯等零余子為研究材料發(fā)現(xiàn)，這幾個(gè)品種無(wú)菌苗形成時(shí)間較短，約 4～5周；山藥苗的組培快繁以MS+6-BA 3 mg/L+NAA 0.3 mg/L+0.5%活性炭為宜，生長(zhǎng)速度快，較健壯。

1.3 塊莖

由于部分薯蕷屬植物莖的結(jié)構(gòu)比較特殊，造成組培過(guò)程中無(wú)菌苗生根比較困難，因此，通過(guò)誘導(dǎo)微塊莖的形成也是一種較為理想和快捷的途徑。培養(yǎng)條件（如周光期、光照長(zhǎng)度、溫度等）和培養(yǎng)基（如蔗糖濃度、氮源、植物生長(zhǎng)激素等）因素對(duì)微塊莖的形成、數(shù)量、大小以及形成正常無(wú)菌苗的比例有著重要的影響[22]。Martine等[23]在塊莖切段培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)素的提高有利于愈傷組織的形成；朱海萍[24]利用紫色薯蕷塊莖培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)較低濃度的激素組合，其誘導(dǎo)率和分化率都較高；劉金英[14]采用佛手山藥塊莖為材料，在MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L培養(yǎng)基中愈傷組織誘導(dǎo)率較高，誘導(dǎo)率可達(dá)53.6%。

1.4 葉片

劉金英等[14]采用佛手山藥葉片進(jìn)行組織培養(yǎng)研究，發(fā)現(xiàn)只有少數(shù)葉片形成愈傷組織，誘導(dǎo)率并不高。梁方剛等[28]發(fā)現(xiàn)，懷山藥葉片雖然能形成愈傷組織，但不能形成苗。胡選萍等[25]研究山藥葉片愈傷組織的形成過(guò)程發(fā)現(xiàn)，其出愈速度較快，愈傷組織顏色、質(zhì)地比較好。Hiroyuki等[26]以山藥未成熟的葉子，通過(guò)誘導(dǎo)形成不定芽，不定芽經(jīng)過(guò)6個(gè)月的繼代培養(yǎng)，無(wú)菌植株產(chǎn)生了數(shù)量較多的微型塊莖。

1.5 培養(yǎng)條件

山藥組培苗的誘導(dǎo)，分化和增殖生長(zhǎng)不僅受植物生長(zhǎng)激素的影響，還與溫度、光照、培養(yǎng)基蔗糖濃度等培養(yǎng)條件有關(guān)。李明軍等[19]研究發(fā)現(xiàn)光、暗條件的不同對(duì)山藥愈傷組織的誘導(dǎo)效果也不同，其生長(zhǎng)和發(fā)育也會(huì)受到光質(zhì)的影響。蔗糖作為山藥組培的主要碳源，是組織培養(yǎng)的重要組成部分。蔡國(guó)紅等[27]發(fā)現(xiàn)，淮山薯無(wú)菌芽的誘導(dǎo)率和芽的數(shù)量都隨著蔗糖濃度的提高而有所增加，認(rèn)為蔗糖對(duì)某些重要酶的基因表達(dá)以及某種貯藏蛋白的積累有一定的影響。Edison等[28]認(rèn)為，無(wú)菌苗葉片的數(shù)量與蔗糖濃度緊密相關(guān)，蔗糖使用濃度以3%～5%為宜。嚴(yán)華兵等[29]認(rèn)為，蔗糖通過(guò)提供代謝產(chǎn)物和調(diào)節(jié)培養(yǎng)基溶液的滲透壓，從而影響山薯組培苗的形態(tài)發(fā)生途徑，但其影響具有一定的閥值效應(yīng)。在一定的濃度范圍內(nèi)，適當(dāng)提高蔗糖的使用濃度有利于山藥微型塊莖的誘導(dǎo)[30]。

2 存在問(wèn)題

2.1 污染

植物組培中所造成的污染可歸類(lèi)為外源性污染和內(nèi)源性污染。外源性污染一般比較容易控制，如操作過(guò)程中嚴(yán)格要求得當(dāng)，環(huán)境條件嚴(yán)格控制；而內(nèi)源性污染由于植物材料各異復(fù)雜，是最難控制的污染源，主要從外植體的選取以及消毒等方面進(jìn)行控制[31]。除此以外，造成組培污染的病原菌主要分為細(xì)菌和真菌。一般來(lái)說(shuō)，接種1～5 d后就可以發(fā)現(xiàn)有沒(méi)細(xì)菌污染；而真菌污染則發(fā)現(xiàn)時(shí)間稍晚，一般在接種 3～15 d后才可能被發(fā)現(xiàn)[32]。外植體是否可以正常生長(zhǎng)，在接種2個(gè)星期左右方可判斷。外植體消毒所使用的消毒劑比較常用的有氯化汞、次氯酸鈉、漂白水等[33]。

在組培過(guò)程中，如果發(fā)現(xiàn)污染物是從外植體周?chē)L(zhǎng)起，則可能是由于植物材料本身帶菌引起的，也有可能是在接種過(guò)程中外植體被污染或是鑷子、手術(shù)刀等接種工具滅菌不徹底導(dǎo)致；如果污染物是在培養(yǎng)基以上部分長(zhǎng)起，就可以認(rèn)為是外植體本身的內(nèi)生菌所導(dǎo)致的污染。如果污染是從培養(yǎng)基內(nèi)部產(chǎn)生，并且有從里向外發(fā)展的趨勢(shì)，就說(shuō)明是外植體切口引起的污染，原因可能是因?yàn)橥庵搀w滅菌消毒之后沒(méi)有剪去切口；或雖剪去，但器具本身帶菌[34]。

2.2 褐化

褐化在植物組織培養(yǎng)中是經(jīng)常容易出現(xiàn)的現(xiàn)象。褐化是指在植物組培過(guò)程中，外植體材料的器官和組織被切割損傷或是在接種繁殖時(shí)，損傷細(xì)胞中的酚類(lèi)物質(zhì)（底物）在酚氧化酶的作用下與氧氣聚合而發(fā)生氧化反應(yīng)，形成有毒的醌類(lèi)物質(zhì)，從而使外植體切面迅速變成棕褐色或暗褐色，并逐步擴(kuò)散到培養(yǎng)基中，抑制其它酶的活性，從而導(dǎo)致植物組織代謝紊亂，生長(zhǎng)受到抑制，最終導(dǎo)致外植體的死亡[35-37]。隨著研究學(xué)者對(duì)植物褐化的重視，在培養(yǎng)中抑制植物褐變的方法也有很多，比如選擇適宜的外植體、改變培養(yǎng)條件（如溫度，光照，pH），在培養(yǎng)基中添加抗氧化劑，如抗壞血酸（Vc）、亞硫酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等[38]；山藥組培快繁過(guò)程中容易發(fā)生褐化現(xiàn)象，也受到越來(lái)越多的重視，目前，一些學(xué)者在山藥培養(yǎng)中短期抑制褐化方面做了些試驗(yàn)探討，也取得了一些階段性的成果[39-41]；雖然通過(guò)使用一定濃度的防褐化劑可以在一定程度上減輕褐化對(duì)植物生長(zhǎng)的影響，但對(duì)于一些容易褐化且褐化比較嚴(yán)重的外植體則效果不是很明顯；若是能夠從植物生理生化，遺傳等方面的知識(shí)領(lǐng)域?qū)ι剿幒只F(xiàn)象發(fā)生的原因以及形成規(guī)律進(jìn)行進(jìn)一步深入的研究分析，從根本上解決褐化現(xiàn)象，對(duì)山藥的種質(zhì)資源和品種保存以及規(guī)?；a(chǎn)和推廣則是很有價(jià)值的。

3 展望

植物組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展在生物技術(shù)科學(xué)研究和應(yīng)用中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用，也在山藥的種質(zhì)資源保存、繁育和生產(chǎn)推廣上得到廣泛的應(yīng)用和研究。山藥離體培養(yǎng)技術(shù)體系的迅速發(fā)展和不斷完善，必將會(huì)大大提高山藥的育種效率，加快山藥品種保存，改良、推進(jìn)和擴(kuò)大山藥產(chǎn)業(yè)化的進(jìn)程。

針對(duì)山藥組織培養(yǎng)中存在的問(wèn)題，雖然中國(guó)學(xué)者研究不少，也取得了一定的成果，但還需加大力度重視山藥的組織培養(yǎng)技術(shù)研究體系；建立和完善不同山藥品種的實(shí)用、高效、標(biāo)準(zhǔn)的組織培養(yǎng)快繁技術(shù)體系。結(jié)合基因工程技術(shù)培育出具有高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、抗病能力強(qiáng)等優(yōu)良性狀的山藥新品種，以滿(mǎn)足人們?nèi)找嬖鲩L(zhǎng)的需求。

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