薏苡仁提取物對(duì)裸鼠肝癌移植瘤生長(zhǎng)的影響及機(jī)制

陳萍，胡偉結(jié)，游贛花，張閩閩(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，貴陽(yáng)550004；2貴州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院；貴州省食品藥品檢驗(yàn)所)

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·基礎(chǔ)研究·

薏苡仁提取物對(duì)裸鼠肝癌移植瘤生長(zhǎng)的影響及機(jī)制

陳萍1，2，胡偉結(jié)1，游贛花3，張閩閩1
(1貴州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，貴陽(yáng)550004；2貴州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院；3貴州省食品藥品檢驗(yàn)所)

目的 觀察薏苡仁提取物對(duì)裸鼠肝癌移植瘤瘤體生長(zhǎng)情況及血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影響，探討薏苡仁治療肝癌的機(jī)制。方法 建立裸鼠肝癌模型，將24只成模裸鼠隨機(jī)分成模型組、薏苡仁低劑量組、薏苡仁高劑量組各8只，分別給予生理鹽水、0.08 g/mL的薏苡仁混懸劑、0.16 g/mL的薏苡仁混懸劑連續(xù)灌胃給藥40 d。收集瘤體標(biāo)本，測(cè)量腫瘤體積、瘤重，計(jì)算抑瘤率；HE染色法觀察瘤體組織細(xì)胞形態(tài)；ELISA法檢測(cè)血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平。結(jié)果 與模型組相比，薏苡仁低、高劑量組的瘤體積減小、瘤重降低(P均<0.01)；鏡下見(jiàn)薏苡仁低、高劑量藥組生長(zhǎng)狀態(tài)良好的腫瘤細(xì)胞數(shù)量明顯減少，出現(xiàn)面積大小不等的核濃縮或核溶解的壞死細(xì)胞群。薏苡仁高劑量組血清TNF-α水平較模型組降低(P<0.05)，薏苡仁低劑量組與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；薏苡仁低、高劑量組較模型組血清IL-1β水平均升高，IL-6水平均降低(P<0.05或<0.01)。結(jié)論 薏苡仁可能通過(guò)調(diào)節(jié)血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平，進(jìn)而有效抑制裸鼠肝癌移植瘤生長(zhǎng)。

薏苡仁；肝腫瘤；移植瘤;腫瘤壞死因子α；白細(xì)胞介素1β；白細(xì)胞介素6；裸鼠

原發(fā)性肝癌(以下簡(jiǎn)稱肝癌)主要包括肝細(xì)胞癌、肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌和肝細(xì)胞癌-肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌混合型等不同病理類(lèi)型。在我國(guó)，肝細(xì)胞癌占肝癌的85%～90%[1]。我國(guó)每年約有38.3萬(wàn)人死于肝癌，占全球肝癌死亡病例數(shù)的51%[2]。薏苡仁是禾本科植物薏苡的干燥成熟種仁。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，薏苡仁粉口服幾乎無(wú)不良反應(yīng)，僅個(gè)別患者在外敷時(shí)出現(xiàn)皮膚干燥或輕微脫屑，停用后癥狀消失[3]。2016年，我們通過(guò)觀察口服薏苡仁對(duì)荷瘤裸鼠瘤體生長(zhǎng)及細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)的影響，旨在為薏苡仁治療肝癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級(jí)BAL/c裸鼠30只，4～6周齡，雄性，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。人肝癌SMMC-7721細(xì)胞株由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所提供。薏苡仁藥材購(gòu)于貴州同濟(jì)堂藥房，經(jīng)麩炒炮制，粉碎，過(guò)300目藥篩，用注射用水配成0.08 g/mL和0.16 g/mL的混懸劑備用。0.9%氯化鈉注射液(四川科倫藥業(yè)股份有限公司)。Thermo全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)，臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)(德國(guó)5804R型Eppendorf)，BS210S電子天平(德國(guó)，賽多利思公司)，TNF-α、IL-1β及IL-6酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)。

1.2 模型制作與分組處理 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SMMC-7721細(xì)胞，用0.25%胰酶消化，PBS沖洗，離心收集細(xì)胞。用0.9%氯化鈉注射液懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×106/mL。每只裸鼠分別取細(xì)胞懸液0.2 mL接種于頸背部皮下，3 d后見(jiàn)瘤體長(zhǎng)出。將成模的24只裸鼠隨機(jī)分為模型組、薏苡仁低劑量組、薏苡仁高劑量組，每組8只。薏苡仁低、高劑量組分別給予0.08、0.16 g/mL的薏苡仁混懸劑灌胃，模型組給予等量0.9%氯化鈉注射液灌胃，均0.5 mL/次、2次/d，連續(xù)40 d。

1.3 移植瘤體積、瘤重及抑瘤率的測(cè)算 觀察3組荷瘤裸鼠實(shí)驗(yàn)期間的飲食和活動(dòng)狀態(tài)。末次給藥24 h后采用頸椎脫臼法處死荷瘤裸鼠，完整剝離出裸鼠的瘤體。用游標(biāo)卡尺測(cè)量瘤體最大直徑LD和最小直徑SD，以LD×SD2×0.5計(jì)算移植瘤體積。稱取瘤體質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率，抑瘤率=(模型組平均瘤重-用藥組平均瘤重)/模型組平均瘤重×100%。

1.4 瘤體組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 將腫瘤用甲醛固定，石蠟包埋，切5 μm厚切片。行常規(guī)HE染色，鏡下觀察腫瘤細(xì)胞形態(tài)。

1.5 血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平檢測(cè) 裸鼠眼眶取血，離心分離血清，-20 ℃保存?zhèn)溆?。采用ELISA法檢測(cè)血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

2 結(jié)果

2.1 三組移植瘤體積、瘤重及抑瘤率比較 三組荷瘤裸鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，除模型組在最后6 d攝食量和活動(dòng)量稍有減少外，薏苡仁低、高劑量組均無(wú)明顯變化。與模型組比較，薏苡仁低、高劑量組的瘤體積縮小，瘤重減少(P均<0.01)。薏苡仁高、低劑量組間瘤體積和瘤重比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表1。薏苡仁低、高劑量組的抑瘤率分別為52.12%、56.63%，組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 三組移植瘤體積、瘤重比較

注：與模型組比較，*P<0.05。

2.2 三組瘤體組織細(xì)胞形態(tài) 鏡下見(jiàn)模型組大多數(shù)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，呈多角形或不規(guī)則形，核大深染，核分裂象多見(jiàn)；薏苡仁低劑量組多數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)壞死的初期表現(xiàn)核濃縮，少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)壞死的末期表現(xiàn)核溶解；薏苡仁高劑量組大多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)核濃縮的壞死表現(xiàn)，且有大面積的核溶解壞死細(xì)胞群出現(xiàn)。

2.3 三組血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較 薏苡仁高劑量組血清TNF-α、IL-6水平均低于模型組，IL-1β水平高于模型組；薏苡仁低劑量組血清IL-6水平低于模型組，IL-1β水平高于模型組(P<0.05或<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 三組血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

肝癌因發(fā)病隱匿，確診時(shí)多為晚期，患者預(yù)后較差。其發(fā)病機(jī)制主要與乙型或丙型肝炎病毒感染密切相關(guān)，非病毒性因素則與過(guò)度飲酒、發(fā)霉食物、不潔飲水等相關(guān)。目前研究認(rèn)為，肝細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制與原癌基因激活、抑癌基因的失活、多種分子信號(hào)通路異?；罨⑾嚓P(guān)蛋白質(zhì)異常表達(dá)等因素有關(guān)[4]。目前對(duì)肝癌的治療多采用手術(shù)切除為主，介入、放療、化療等為輔的綜合治療方案，但高復(fù)發(fā)率、高病死率一直是困擾臨床的棘手難題。

薏苡仁為禾本科植物薏苡的干燥成熟種仁。2015年版《中國(guó)藥典》一部里載明薏苡仁飲片的功能與主治項(xiàng)為用于水腫、贅疣、癌腫等。且我國(guó)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的中藥注射用薏苡仁油(薏苡仁有效活性成分制劑)的說(shuō)明書(shū)也明確載明用于原發(fā)性肝癌治療。既往有報(bào)道指出，薏苡仁油注射液和薏苡仁脂肪酸在體外對(duì)肝癌細(xì)胞具有良好的抗腫瘤活性，其作用機(jī)制可能與其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、上調(diào)抑癌基因、下調(diào)癌基因、抑制G2/M細(xì)胞周期有關(guān)[5，6]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，薏苡仁可提高細(xì)胞免疫功能，調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的水平、恢復(fù)Th1/Th2亞群的動(dòng)態(tài)平衡，發(fā)揮抗病毒作用[7]。國(guó)外學(xué)者[8]報(bào)道，薏苡仁提取物α-單亞麻酯有抗病毒作用。然而目前多見(jiàn)注射用薏苡仁油治療肝癌的報(bào)道，鮮有內(nèi)服薏苡仁報(bào)道。而注射用薏苡仁油存在脂過(guò)敏、靜脈炎及血管硬化等不良反應(yīng)，導(dǎo)致患者用藥不便且痛苦。本研究顯示，與模型組比較，薏苡仁低、高劑量組的瘤體積及瘤重均顯著減少。表明不同劑量的薏苡仁內(nèi)服均對(duì)人肝癌細(xì)胞移植瘤有一定的抑制作用。

流行病學(xué)調(diào)查表明，炎癥是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展的主要因素之一[9]。肝細(xì)胞癌是炎癥相關(guān)性腫瘤，因此，探討炎癥與肝細(xì)胞癌的關(guān)系有助于篩選肝癌的治療藥物與治療靶點(diǎn)。有研究指出在肝癌的炎性微環(huán)境中，TNF-α、IL-1β、IL-6細(xì)胞因子不僅可由腫瘤細(xì)胞分泌，還能產(chǎn)生于炎癥反應(yīng)過(guò)程。它們互為因果，相互促進(jìn)對(duì)方的表達(dá)，共同組成和維持有利于肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的炎性微環(huán)境。

TNF-α是炎癥反應(yīng)的始動(dòng)因子，既能由單核/巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞及淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞釋放產(chǎn)生，還能以自分泌方法促進(jìn)自身合成。其對(duì)多種有助于腫瘤細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展及逃逸的因子高表達(dá)有誘導(dǎo)作用，是改變腫瘤細(xì)胞微環(huán)境的關(guān)鍵因素[10]。賈綺賓等[11]報(bào)道，肝癌患者血清TNF-α水平明顯高于肝硬化患者，且治療后隨著病情好轉(zhuǎn)而逐漸降低，隨病情惡化而明顯上升。表明抑制血清TNF-α水平的高表達(dá)可能成為有效治療肝癌的新靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，薏苡仁高劑量組血清TNF-α水平較模型組降低，表明高劑量薏苡仁能明顯抑制血清TNF-α的高表達(dá)，從而減少炎性因子分泌，從而減小腫瘤體積、減輕瘤重等發(fā)揮抑瘤作用。雖然薏苡仁低劑量組血清TNF-α水平較模型組有所降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示高劑量薏苡仁降低血清TNF-α水平的作用更佳。

IL-1β是較強(qiáng)的炎癥反應(yīng)繼發(fā)因子，其通過(guò)激活c-Jun氨基末端激酶促進(jìn)肝星狀細(xì)胞增殖并分泌細(xì)胞外基質(zhì)。這種作用既有利于炎癥、損傷的愈合，也會(huì)導(dǎo)致肝纖維化[12]。還有研究[13]認(rèn)為，IL-1β細(xì)胞因子在肝臟慢性炎癥中的高表達(dá)不僅可誘導(dǎo)其他細(xì)胞因子如IL-2、IL-6、TNF-α的分泌，引發(fā)免疫反應(yīng)以清除病毒，也能促進(jìn)病毒性肝炎演變的肝細(xì)胞性肝癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲與遷移。在肝癌的發(fā)展與轉(zhuǎn)歸過(guò)程中，IL-1β參與了腫瘤細(xì)胞分裂增殖、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、腫瘤細(xì)胞凋亡、機(jī)體免疫反應(yīng)等,表現(xiàn)出了多樣性的生物效應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，薏苡仁高、低劑量組均能提高血清IL-1β水平，通過(guò)上調(diào)血清IL-1β表達(dá)，促進(jìn)炎癥減退和病毒清除。

IL-6是促炎細(xì)胞因子，它能通過(guò)刺激活化B細(xì)胞的增殖而分泌抗體,刺激T細(xì)胞的增殖及細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的活化,刺激肝細(xì)胞合成急性期蛋白而參與炎癥反應(yīng)[14]。同時(shí)還能作用于肝內(nèi)的免疫細(xì)胞和其他基質(zhì)細(xì)胞，激活STAT3信號(hào)通路，使之表達(dá)更多的炎癥因子如IL-6、TNF-α、IL-10等，維持有利于肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的炎性微環(huán)境，促進(jìn)肝癌進(jìn)展[15]。李丹等[16]報(bào)道，IL-6具有提高肝癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲能力的作用。Meta分析結(jié)果顯示，肝細(xì)胞癌患者血清IL-6不但高于正常人，而且高于肝硬化患者和慢性肝炎患者，同時(shí)文獻(xiàn)指出這個(gè)結(jié)果可為以IL-6細(xì)胞因子為靶點(diǎn)的抗炎治療肝癌方案提供決策依據(jù)[15]。本研究結(jié)果表明，薏苡仁不同劑量組均具有下調(diào)荷瘤裸鼠血清IL-6表達(dá)的作用，提示薏苡仁可能通過(guò)下調(diào)血清IL-6水平，抑制肝癌細(xì)胞增殖或轉(zhuǎn)移。

綜上所述，薏苡仁可降低肝癌瘤體體積和瘤重、誘發(fā)瘤體細(xì)胞變性壞死，其機(jī)制可能是通過(guò)影響血清TNF-α、IL-6、IL-1β表達(dá)，減輕肝癌組織細(xì)胞的炎性損害，從而抑制肝癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移。

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2016-12-12)