以臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞為載體的靶向基因治療系統(tǒng)聯(lián)合5-FU對(duì)裸鼠HepG2移植瘤的作用

孔凡妮，查劍英，楊圓圓，盧楊 ，李真真，張硯君(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院血液學(xué)研究所，天津30000；西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院)

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以臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞為載體的靶向基因治療系統(tǒng)聯(lián)合5-FU對(duì)裸鼠HepG2移植瘤的作用

孔凡妮1，查劍英1，楊圓圓1，盧楊1，李真真2，張硯君1
(1中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院血液學(xué)研究所，天津300020；2西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院)

目的 構(gòu)建以人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(HUMSCs)為載體的靶向基因治療系統(tǒng)，觀察該系統(tǒng)聯(lián)合低劑量5-FU對(duì)裸鼠HepG2移植瘤的治療作用。方法 采用組織塊接種法從新鮮無(wú)菌新生兒臍帶中分離HUMSCs，利用PCR、重疊PCR、酶切、連接等分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建慢病毒表達(dá)質(zhì)粒LentiR.E1A和腺病毒穿梭質(zhì)粒pAd-hTERTp-IL24，并包裝慢病毒LentiR.E1A和腺病毒Ad-hTERTp-IL24。采用Transwell實(shí)驗(yàn)觀察慢病毒和腺病毒共感染對(duì)HUMSCs向HepG2細(xì)胞趨化的影響。采用皮下接種的方法建立HepG2移植瘤模型，將荷瘤小鼠分成5組各5只，分別給予尾靜脈注射PBS、HUMSCs、低劑量5-FU、慢病毒感染HUMSCs聯(lián)用低劑量5-FU、雙病毒共感染HUMSCs聯(lián)用低劑量5-FU的治療，比較各組的抑瘤效應(yīng)。利用BD Annexin-Ⅴ-PE凋亡試劑盒檢測(cè)腺病毒Ad-hTERTp-IL24與低劑量5-FU聯(lián)用誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡情況。 結(jié)果 成功構(gòu)建了慢病毒表達(dá)載體pLentiR.E1A和腺病毒表達(dá)載體pAd-hTERTp-IL24，并成功包裝出了慢病毒LentiR.E1A和腺病毒Ad-hTERTp-IL24。Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，慢病毒和腺病毒共感染HUMSCs向腫瘤細(xì)胞的遷移能力無(wú)明顯改變。聯(lián)合低劑量5-FU治療裸鼠肝移植瘤中治療組腫瘤體積較對(duì)照組減小(P<0.01)。Ad-hTERTp-IL24與低劑量5-FU聯(lián)用誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境內(nèi)的腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，其熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于Ad-Track+5-Fu組和5-Fu組。結(jié)論 成功構(gòu)建了以HUMSCs為載體的靶向基因治療系統(tǒng)，由HUMSCS.LentiR.E1A運(yùn)載攜帶抑瘤基因的腺病毒Ad-hTERTp-IL24聯(lián)用低劑量5-FU對(duì)裸鼠HepG2移植瘤有明顯抑制作用。

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；腺病毒；靶向基因治療系統(tǒng)；5-氟尿嘧啶；HepG2移植瘤

肝癌由于其發(fā)病隱匿，患者被確診時(shí)往往已達(dá)晚期并伴隨肝功能不全，多數(shù)預(yù)后很差。目前，針對(duì)肝癌的傳統(tǒng)治療手段包括手術(shù)、化療和放療等，但療效均欠佳。隨著腫瘤分子生物學(xué)和現(xiàn)代細(xì)胞分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，基因治療成為未來(lái)腫瘤治療的新希望。間充質(zhì)干細(xì)胞具有來(lái)源廣泛、擴(kuò)增迅速、外源基因?qū)敫咝?、低免疫原性和在體內(nèi)向炎癥損傷及腫瘤部位歸巢等優(yōu)勢(shì)[1]，作為基因治療的運(yùn)載細(xì)胞受到越來(lái)越多的關(guān)注。研究[2，3]顯示，將運(yùn)載體人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(HUMSCs)攜帶腺病毒復(fù)制所必需的早期基因E1A，使其成為腺病毒包裝細(xì)胞，具備在腫瘤部位靶向釋放腺病毒的能力。人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子(hTERTp)在腫瘤細(xì)胞中具有較高的轉(zhuǎn)錄活性，能夠驅(qū)動(dòng)抑瘤基因白細(xì)胞介素24(IL-24)表達(dá)[4，5]。因此，將hTERTp裝載于腺病毒上用以操控IL-24表達(dá)，可使該治療基因特異高效地在腫瘤細(xì)胞表達(dá)而對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有影響[6，7]。復(fù)制缺陷型腺病毒有一定的局限性，比如它缺乏條件復(fù)制型病毒的放大效應(yīng)及病毒擴(kuò)散的能力、治療基因在腫瘤細(xì)胞表達(dá)水平不高等，勢(shì)必影響療效。我們的前期研究已利用基因工程方法成功構(gòu)建慢病毒表達(dá)質(zhì)粒P LentiR.E1A和腺病毒穿梭質(zhì)粒pAd-hTERTp-IL24，并成功包裝出相應(yīng)的慢病毒和腺病毒；并證實(shí)由雙病毒共感染的HUMSCs可以包裝出IL-24腺病毒，其對(duì)HepG2細(xì)胞系的感染效率較好[8]。5-FU作為肝癌治療中常用的化療藥物，低劑量的5-FU能提高腫瘤細(xì)胞表面柯薩奇腺病毒受體(CAR)表達(dá)，與腺病毒聯(lián)合應(yīng)用表現(xiàn)出協(xié)同作用[9]，使其抑瘤作用更顯著。在此研究基礎(chǔ)上，近一年時(shí)間我們利用經(jīng)過(guò)E1A基因修飾的HUMSCs復(fù)制和包裝出由hTERTp啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的特異抑瘤基因IL-24的Ad-hTERTp-IL24質(zhì)粒，觀察其與低劑量5-FU聯(lián)合治療HepG2肝癌皮下移植瘤的效果。

1 材料與方法

1.1 材料 5～6周齡SPF級(jí)雌性BALB/c裸鼠，體質(zhì)量15～17 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。新鮮無(wú)菌新生兒臍帶，由天津市中心婦產(chǎn)科提供，獲得孕產(chǎn)婦知情同意。BD Annexin-Ⅴ-PE凋亡試劑盒。人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系HepG2、人胚腎細(xì)胞系293A由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院血液學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)室保存；人胚腎細(xì)胞系293T細(xì)胞由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室程濤教授饋贈(zèng)。

1.2 HUMSCs的分離培養(yǎng)與鑒定 采用組織塊接種法。將新生兒臍帶剪碎，種植于10 cm2平皿中，于37 ℃、5% CO2孵箱中倒置;貼壁4 h后，添加含10% FBS和2 mmol/L谷氨酰胺的DF-12培養(yǎng)液8 mL。繼續(xù)培養(yǎng)7～10 d后，顯微鏡下可見(jiàn)組織塊周?chē)虚L(zhǎng)梭形纖維狀細(xì)胞爬出，形成克隆樣。待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%融合時(shí)可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取培養(yǎng)3～6代HUMSCs，消化離心后分別加入CD105-APC、CD73-PE、CD90-PE、CD34-PE、CD19-PE、CD45-PE的直標(biāo)抗體或同型對(duì)照抗體，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行表型鑒定。3個(gè)陽(yáng)性表面標(biāo)志CD105、CD73、CD90陽(yáng)性率均接近100%，3個(gè)陰性表面標(biāo)志CD34、CD45、CD19表達(dá)均為陰性，表明獲得了生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HUMSCs。

1.3 慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pLentiR.E1A和腺病毒穿梭質(zhì)粒pAd-hTERTp-IL24的構(gòu)建 參考文獻(xiàn)[8]方法，構(gòu)建表達(dá)E1A的慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pLentiR.E1A。根據(jù)Invitrogen三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)操作手冊(cè)，將pLentiR.E1A、pLentiR(空載體對(duì)照)分別和2種包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收集病毒上清液保存?zhèn)溆?。將hTERTp片段和IL24基因全長(zhǎng)克隆入pAd-Track，構(gòu)建腺病毒穿梭質(zhì)粒pAd-hTERTp-IL24。將穿梭質(zhì)粒pAd-hTERTp-IL24、pAd-Track(空載體對(duì)照)分別與pAd-Easy-1骨架質(zhì)粒正確重組后，根據(jù)pAd-Easy腺病毒包裝手冊(cè)說(shuō)明，于293A細(xì)胞中包裝腺病毒質(zhì)粒Ad-hTERTp-IL24。

1.4 雙病毒共感染HUMSCs向HepG2細(xì)胞的趨化作用觀察 采用Transwell實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞，用含5% FBS的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL，接種于24孔板中。次日將Transwell小室放入已接種HepG2細(xì)胞的24孔板中，于細(xì)胞培養(yǎng)箱預(yù)平衡1 h。其間消化收集腺病毒和慢病毒共感染12 h的HUMSCs(雙病毒共感染HUMSCs組)，共感染腺病毒和對(duì)照慢病毒LentiR的HUMSCs(慢病毒感染HUMSCs組)和未處理的空白HUMSCs(對(duì)照組)。培養(yǎng)20 h后，取出小室用0.1%結(jié)晶紫溶液染色45 min；倒置、風(fēng)干后在倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)20倍物鏡視野計(jì)數(shù)染色細(xì)胞數(shù)目。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 雙病毒共感染HUMSCs聯(lián)合低劑量5-FU對(duì)裸鼠肝癌皮下移植瘤的作用觀察 建立BALB/c裸鼠HepG2移植瘤模型。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞，冷PBS洗2次，調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×107/mL，取200 μL細(xì)胞懸液接種于小鼠右前肢根部背側(cè)皮下，建立肝癌移植瘤模型。接種后每天測(cè)量腫瘤長(zhǎng)徑和短徑，計(jì)算腫瘤體積，腫瘤體積=1/2×長(zhǎng)徑×短徑2。待腫瘤生長(zhǎng)至200～300 mm3時(shí)，將小鼠分為空白組、對(duì)照組、5-FU組、慢病毒+5-FU組、雙病毒+5-FU組5組各5只，分別向小鼠尾靜脈注射PBS、HUMSCs、5-FU、慢病毒感染的HUMSCs和5-FU、雙病毒共感染的HUMSCs和5-FU;聯(lián)用5-FU的治療組從HUMSCs注射后第3天開(kāi)始腹腔注射藥物，10 mg/kg，連續(xù)給藥5 d。自開(kāi)始治療之日起，每隔3 d用游標(biāo)卡尺測(cè)量各組小鼠移植瘤模型的腫瘤長(zhǎng)徑和短徑，計(jì)算腫瘤體積。相對(duì)腫瘤體積比(RTV)=Vt/V0(V0為治療開(kāi)始時(shí)的體積，Vt為每次測(cè)量的體積)，腫瘤抑制率=(1-治療組RTV/空白組RTV)×100%。

1.6 腺病毒Ad-hTERTp-IL24與低劑量5-FU聯(lián)用對(duì)肝癌細(xì)胞的作用觀察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞，以1.5×105/mL接種于6孔板上的其中4個(gè)孔，培養(yǎng)1～2 h待細(xì)胞沉于孔板底部后，其中2孔按100 MOI的感染復(fù)數(shù)分別加入腺病毒Ad-hTERTp-IL24和對(duì)照病毒Ad-Track，再分別加入低劑量5-FU(終濃度2 μg/mL)，另外2孔分別加入等體積PBS(空白組)和低劑量5-FU(終濃度2 μg/mL)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，使用BD AnnexinⅤ-PE試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。正常細(xì)胞無(wú)染色，凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞呈紅色熒光，根據(jù)熒光強(qiáng)弱判斷凋亡發(fā)生的程度。

2 結(jié)果

2.1 雙病毒共感染前后HUMSCs向腫瘤細(xì)胞的趨化作用比較 結(jié)晶紫染色顯示，對(duì)照組、慢病毒感染HUMSCs組和雙病毒共感染HUMSCs組向HepG2細(xì)胞遷移的HUMSCs細(xì)胞數(shù)量均在60個(gè)左右，三組間比較無(wú)明顯差異。

2.2 雙病毒共感染HUMSCs聯(lián)合低劑量5-FU的抑瘤作用 治療后第6天，雙病毒+5-FU組的平均腫瘤體積為180 mm3，空白組的平均腫瘤體積為400 mm3，兩組比較P<0.01。且隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，這一趨勢(shì)更為明顯。初始治療后第21天，雙病毒+5-FU組的腫瘤抑制率為70.8%，高于慢病毒+5-FU組(23.2%)和5-FU組(21.4%)，見(jiàn)圖1。

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01。

圖1 雙病毒共感染HUMSCs聯(lián)用低劑量5-FU對(duì)HepG2移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用

2.3 腺病毒Ad-hTERTp-IL24與低劑量5-FU聯(lián)用誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡 熒光顯微鏡下可見(jiàn)，空白組幾乎沒(méi)有紅色熒光，Ad-hTERTp-IL24聯(lián)合5-FU組紅色熒光非常明顯，熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于Ad-Track+5-FU組和5-FU組。

3 討論

大多數(shù)肝癌患者伴隨基礎(chǔ)的肝臟疾病，如肝硬化、肝功能代償失調(diào)，手術(shù)切除效率低，放療和化療的效果差，病死率極高?；虬邢蛑委熓菒盒阅[瘤治療中最有發(fā)展前景的領(lǐng)域之一，其中腺病毒的基因治療在臨床試驗(yàn)中的應(yīng)用最為廣泛[10～12]。由于腺病毒宿主范圍廣，可有效感染多種靶細(xì)胞，包括分裂和非分裂細(xì)胞，而其基因組游離于細(xì)胞基因組之外，可短期高效地表達(dá)目的基因，其已經(jīng)應(yīng)用于多種癌癥的治療研究。但腺病毒的基因治療存在缺乏靶向性、免疫原性等問(wèn)題。HUMSCs具有在體內(nèi)向炎癥損傷及腫瘤部位歸巢、來(lái)源廣泛、擴(kuò)增迅速、外源基因?qū)敫咝?、低免疫原性等?yōu)勢(shì)[1]，在基因治療中呈現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。

我們的前期研究顯示，在HepG2肝癌移植瘤模型小鼠體內(nèi)，病毒感染的HUMSCs可以選擇性地歸巢于腫瘤部位[13]。本研究基于腺病毒基因治療和HUMSCs腫瘤歸巢的特性，設(shè)計(jì)了一種以HUMSCs為載體的靶向肝癌的腺病毒治療體系。5-FU是臨床治療肝癌常用的化療藥物，我們將其與腺病毒靶向治療體系聯(lián)用以增加療效，觀察對(duì)HepG2肝癌移植瘤模型小鼠的抑瘤效應(yīng)。首先采用組織塊接種法分離HUMSCs，利用PCR、重疊PCR、酶切、連接等分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建慢病毒表達(dá)質(zhì)粒LentiR.E1A和腺病毒穿梭質(zhì)粒pAd-hTERTp-IL24，并成功包裝出了慢病毒和腺病毒共感染HUMSCs。利用Transwell試驗(yàn)觀察雙病毒感染對(duì)HUMSCs向HepG2細(xì)胞趨化作用的影響。關(guān)于HUMSCs對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的趨化性已有報(bào)道，在HepG2細(xì)胞條件培養(yǎng)基的作用下，大量HUMSCs向其遷移，且呈細(xì)胞濃度依賴(lài)性；另外慢病毒感染HUMSCs后，對(duì)其遷移特性并無(wú)顯著影響[13]。本研究結(jié)果顯示，雙病毒共感染后HUMSCs向HepG2細(xì)胞的趨化作用沒(méi)有改變。簡(jiǎn)言之，腺病毒與慢病毒LentiR.E1A共感染HUMSCs并不影響其體內(nèi)外向腫瘤部位歸巢的能力。為了驗(yàn)證該治療體系的治療效果，我們建立了BALB/c裸鼠HepG2肝癌移植瘤模型，經(jīng)尾靜脈注射雙病毒共感染的HUMSCS并聯(lián)合低劑量5-FU，結(jié)果顯示，該聯(lián)合方案對(duì)BALB/c裸鼠HepG2移植瘤的生長(zhǎng)具有明顯抑制作用，優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用的治療效果。利用BD Annexin-Ⅴ-PE凋亡試劑盒檢測(cè)腺病毒Ad-hTERTp-IL24與低劑量5-FU聯(lián)用誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡情況，通過(guò)熒光顯微鏡觀察熒光強(qiáng)弱來(lái)判斷凋亡發(fā)生的程度。結(jié)果顯示，腺病毒Ad-hTERTp-IL24聯(lián)合5-FU組紅色熒光非常明顯，與該腺病毒作用體內(nèi)腫瘤微環(huán)境對(duì)HepG2移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用結(jié)果一致[14]。

綜上所述，我們建立了以HUMSCs為載體的腺病毒基因治療體系，即利用E1A基因修飾的HUMSCs復(fù)制和包裝出特異治療基因(由hTERTp啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的抑瘤基因IL-24)的腺病毒。復(fù)制缺陷的腺病毒感染E1A基因修飾的HUMSCs后可在細(xì)胞中復(fù)制包裝，最終釋放腺病毒顆粒；在HepG2肝癌移植瘤模型小鼠體內(nèi)，病毒感染的HUMSCs可選擇性向腫瘤部位歸巢，隨著腺病毒的大量復(fù)制，HUMSCs最終被裂解，并在腫瘤周?chē)尫艛y帶由hTER啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的特異抑瘤基因IL-24的腺病毒顆粒，感染腫瘤細(xì)胞后，因?yàn)槟[瘤細(xì)胞內(nèi)hTERT啟動(dòng)子具有較高的轉(zhuǎn)錄活性，可以特異高效地啟動(dòng)IL-24基因的表達(dá)，發(fā)揮其抗腫瘤作用；當(dāng)與5-FU聯(lián)合應(yīng)用時(shí)抑瘤作用更顯著。該靶向治療體系既解決了腺病毒載體缺乏靶向性的問(wèn)題，又保留其高效的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)能力，并利用HUMSCs向微小轉(zhuǎn)移灶歸巢的能力，為肝癌治療特別是轉(zhuǎn)移灶的治療提供了一個(gè)安全、有效、靶向性好的基因?qū)塍w系。

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Effect of targeted gene therapeutic system with HUMSCs as vectors combined with 5-FU on HepG2 exnograft tumor of nude mice

KONGFanni1,ZHAJianying,YANGYuanyuan,LUYang,LIZhenzhen,ZHANGYanjun

(1ChineseAcademyofMedicalSciencesHospitalofBloodDiseases&InstituteofHematology,Tianjin300020,China)

Objective To construct a targeted gene therapy system with human umbilical cord mesenchymal stem cells (HUMSCs) as vectors, and to observe its therapeutic effect on nude mice HepG2 xenografts combined with low-dose 5-fluorouracil (5-FU). Methods HUMSCs were isolated from fresh sterile neonatal umbilical cord by tissue adherent method. We used the methods of PCR, overlap PCR, and restriction enzyme cleavage and linkage to construct the lentiviral expression vector pLentiR.E1A and the adenovirus shuttle vector pAd-hTERTp-IL24. The migratory ability to HepG2 cells of HUMSCs co-infected by lentivirus and adenovirus in vitro was determined by Transwell experiment. HepG2 transplanted tumor model was established in BALB/c nude mice by subcutaneous inoculation. The tumor-bearing mice were divided into five groups and the groups were separately injected with PBS, HUMSCs, low-dose 5-FU, HUMSCs infected by lentivirus combined with ow-dose 5-FU, and HUMSCs co-infected by double virus combined with 5-FU. The anti-tumor effect of each group was compared. The apoptosis of hepatocellular carcinoma cells induced by adenovirus Ad-hTERTp-IL24 and low-dose 5-FU was detected by BD Annexin-Ⅴ-PE apoptotic kit.Results The lentiviral expression vector pLentiR.E1A and adenovirus expression vector pAd-hTERTp-IL24 were successfully constructed and the lentivirus LentiR.E1A and adenovirus Ad-hTERTp-IL24 were successfully packaged. Transwell experiment showed that there was no significant change in the migratory ability of HUMSCs to tumor cells after co-infected by double virus. In treatment of HepG2 exnograft tumor of nude mice, the tumor volume was significantly smaller in the treatment group than in the control group (P<0.01). Ad-hTERTp-IL24 combined with low-dose 5-FU induced tumor apoptosis in the tumor microenvironment, and its fluorescence intensity was stronger than that of the other treatment control groups.Conclusion The targeted gene therapeutic system based on HUMSCs is successfully established, and adenovirus Ad-hTERTp-IL24 combined with low-dose 5-FU have significant inhibitory effect on HepG2 exnograft tumor of nude mice.

human umbilical cord mesenchymal stem cells; adenovirus; targeted gene therapeutic system; 5-fluorouracil; HepG2 exnograft tumor

國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(2012ZX09102301-015)。

孔凡妮(1988-)，女，碩士研究生，主要研究方向?yàn)槟[瘤藥理學(xué)。E-mail: fannikong@163.com

張硯君(1977-)，女，博士，助理研究員，主要研究方向?yàn)槟[瘤藥理學(xué)。E-mail: junjunfriend@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.26.003

R394.6

A

1002-266X(2017)26-0009-04

2017-02-04)