毛梾腋芽誘導(dǎo)關(guān)鍵因子研究與培養(yǎng)體系優(yōu)化

張娜

(山西省林業(yè)科學(xué)研究院，山西 太原 030012)

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毛梾腋芽誘導(dǎo)關(guān)鍵因子研究與培養(yǎng)體系優(yōu)化

張娜

(山西省林業(yè)科學(xué)研究院，山西 太原 030012)

[目的]建立毛梾莖段外植體高效腋芽誘導(dǎo)體系。[方法]以毛梾幼嫩莖段作為外植體，對(duì)滅菌劑及滅菌時(shí)間、采集時(shí)期、基本培養(yǎng)基、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、pH值等腋芽誘導(dǎo)的影響因素進(jìn)行研究。[結(jié)果](1)采用0.1% HgCl2滅菌4～5 min是最佳滅菌劑和滅菌時(shí)間；(2)4～5月是外植體較為理想的采集時(shí)期；1～3月是最佳采集時(shí)期，采用當(dāng)年生枝條水培后的幼嫩莖段；(3)MS培養(yǎng)基是莖段腋芽誘導(dǎo)的最佳基本培養(yǎng)基；(4)MS培養(yǎng)基添加0.5～1.0 mg·L-1BA、0.1 mg·L-1NAA與0.1 mg·L-1IBA時(shí)，腋芽誘導(dǎo)率最高，分別達(dá)85.5%和84.4%；(5)最佳pH值為5.8；(6)光照培養(yǎng)環(huán)境更有利于毛梾腋芽誘導(dǎo)及生長(zhǎng)。[結(jié)論]水培后的幼嫩莖段外植體經(jīng)0.1% HgCl2滅菌4～5 min后，培養(yǎng)在MS添加0.5～1.0 mg·L-1BA、0.1 mg·L-1NAA與0.1 mg·L-1IBA，是毛梾腋芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)體系。

毛梾； 莖段外植體； 腋芽誘導(dǎo)

毛梾(CornuswalteriWanger.)，又名黑椋子、車梁木等，隸屬山茱萸科梾木屬落葉喬木[1]，集中分布在山西、河南、山東、陜西、河北等省份[2]。毛梾的果皮和種仁均含有豐富油脂，其中毛梾果實(shí)含油率可達(dá)31.8%～41.3%，果皮含油率達(dá)24.9%～25.7%[3]，是極具發(fā)展前景的食用和工業(yè)用油料樹種。

目前，毛梾主要通過(guò)種子進(jìn)行繁殖，但由于其果皮富含油脂，內(nèi)果皮堅(jiān)硬骨質(zhì)，透水透氣性差，種子繁殖困難?？涤老榈炔捎玫蜏貙臃e方法對(duì)毛梾種子進(jìn)行催芽，發(fā)芽率僅46.7%[4]；采用GA3處理，發(fā)芽率最高也僅48.43%[5]。也有部分學(xué)者對(duì)毛梾進(jìn)行扦插和嫁接研究，但成活率都較低[6～8]。組織培養(yǎng)成為大規(guī)模、快速繁殖毛梾優(yōu)良品種的必然選擇。然而國(guó)內(nèi)外對(duì)毛梾組織培養(yǎng)方面的研究尚處于初期階段。僅有張丹等對(duì)毛梾初代培養(yǎng)影響因素進(jìn)行研究[9，10]。因此，開展毛梾組織培養(yǎng)快速繁殖研究具有重要意義。

本研究通過(guò)對(duì)毛梾莖段腋芽誘導(dǎo)的影響因素進(jìn)行系統(tǒng)研究，旨在建立毛梾莖段外植體高效腋芽誘導(dǎo)體系，為開展毛梾離體培養(yǎng)快速繁殖體系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料的準(zhǔn)備

采自侯馬市綠博中條山植物繁育中心栽培的4～5年生、發(fā)育良好的毛梾幼嫩莖段作為本試驗(yàn)材料。

首先將毛梾幼嫩莖段去葉，肥皂水浸泡30 min，流水沖洗1 h。然后在超凈工作臺(tái)上先采用75%的酒精滅菌20～30 s，無(wú)菌水沖洗3次；再用滅菌劑進(jìn)行滅菌處理后，無(wú)菌水沖洗5～6次，切成1.5 cm左右的帶節(jié)莖段，準(zhǔn)備接種。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和培養(yǎng)條件

1.2.1 滅菌劑及滅菌時(shí)間

本試驗(yàn)采用2%次氯酸鈉溶液(NaClO)和0.1%氯化汞溶液(HgCl2)作為滅菌劑，分別設(shè)計(jì)不同滅菌時(shí)間梯度，具體為2% NaClO溶液(5、8、10、12 min)、0.1% HgCl2溶液(3、4、5、6 min)。培養(yǎng)4周后，觀察統(tǒng)計(jì)毛梾莖段外植體的污染率和成活率。

1.2.2 外植體采集時(shí)期

本試驗(yàn)從2015年4-9月，每月中旬選擇晴朗天氣采集毛梾幼嫩莖段作為外植體；2015年10月-2016年3月每月中旬選擇晴朗天氣采集當(dāng)年生枝條進(jìn)行水培后，采用幼嫩莖段作為外植體進(jìn)行滅菌接種。培養(yǎng)4周后，觀察統(tǒng)計(jì)毛梾莖段外植體的污染率和成活率。

1.2.3 基本培養(yǎng)基

本試驗(yàn)采用MS、B5和WPM 3種培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基。培養(yǎng)4周后，統(tǒng)計(jì)毛梾腋芽誘導(dǎo)率。

1.2.4 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合

本試驗(yàn)設(shè)計(jì)不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合，分別為：不同濃度的BA(0.5、1.0、2.0 mg·L-1)與0.1 mg·L-1NAA組合、不同濃度的BA(0.5、1.0、2.0 mg·L-1)與0.1 mg·L-1NAA和0.1 mg·L-1IBA組合。培養(yǎng)4周后，統(tǒng)計(jì)毛梾腋芽誘導(dǎo)率。

1.2.5 pH值

本試驗(yàn)設(shè)計(jì)3種不同的pH值，分別為：5.4、5.8、6.2。培養(yǎng)4周后，統(tǒng)計(jì)毛梾腋芽誘導(dǎo)率。

1.2.6 光照環(huán)境

分別進(jìn)行光照培養(yǎng)和黑暗培養(yǎng)，4周后，統(tǒng)計(jì)毛梾腋芽誘導(dǎo)率。

所有試驗(yàn)均采用單因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)。每處理20瓶，重復(fù)3次。培養(yǎng)溫度為(25±2) ℃；除光照環(huán)境試驗(yàn)的黑暗培養(yǎng)外，其余光照強(qiáng)度均為2 500～3 000 lx，光照時(shí)間14～16 h·d-1；除pH值試驗(yàn)外，其余培養(yǎng)基pH值均調(diào)整至5.8；所有培養(yǎng)基均添加蔗糖30 g·L-1、瓊脂6.5 g·L-1。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0數(shù)據(jù)軟件進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 滅菌劑及滅菌時(shí)間對(duì)毛梾莖段外植體滅菌效果的影響

由表1可見，不同滅菌劑及滅菌時(shí)間對(duì)毛梾莖段外植體的污染率和成活率均影響顯著(P<0.05)。

表1 不同滅菌劑及滅菌時(shí)間對(duì)外植體滅菌效果的影響

Table 1 Effect of different disinfectants and treatment time on explants disinfection

滅菌劑類型Typeofdisinfectants滅菌時(shí)間/minTreatmenttime污染率/%Pollutionrate成活率/%Survivalrate2%NaClO01%HgCl25946±18a54±29d8878±20b122±20d10756±24c244±26c12623±38d269±70c3833±17bc167±21cd4346±19e654±19a5268±27e701±08a6211±26e422±45b

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同

Note: different lowercase letters show significant difference at the 0.05 level in the same column. Same below

研究結(jié)果表明，采用2% NaClO作為滅菌劑，滅菌時(shí)間為10 min時(shí)，污染率和成活率分別為75.6%和24.4%；隨著滅菌時(shí)間的延長(zhǎng)，污染率有所降低，但部分外植體出現(xiàn)褐化死亡現(xiàn)象，成活率僅為26.9%。采用0.1% HgCl2作為滅菌劑，當(dāng)滅菌時(shí)間為4 min和5 min時(shí)，成活率均較高，分別達(dá)65.4%和70.1%；進(jìn)一步延長(zhǎng)至6 min時(shí)，污染率達(dá)最低，為21.1%，但部分外植體褐化死亡，成活率僅為42.2%。

由此可見，2% NaClO不適宜作為毛梾莖段外植體的滅菌劑，采用0.1% HgCl2滅菌4～5 min，是毛梾莖段外植體的最佳滅菌劑和滅菌時(shí)間。

2.2 采集時(shí)期對(duì)毛梾莖段外植體滅菌效果的影響

由表2可見，不同采集時(shí)期對(duì)毛梾莖段外植體污染率和成活率均有顯著影響(P<0.05)。

表2 不同采集時(shí)期對(duì)外植體菌效果的影響

Table 2 Effect of different collection period on explants disinfection

采集時(shí)期Collectionperiod污染率/%Pollutionrate成活率/%Survivalrate4月278±16g704±19b5月286±27fg691±22b6月436±22de532±27de7月677±33b296±39g8月824±21a154±23h9月505±31cd448±22ef10月533±09c417±19f11月368±24ef605±26cd12月309±29fg641±23bc1月188±19h792±34a2月186±30h801±39a3月158±25h819±17a

研究結(jié)果表明，4-9月采集毛梾幼嫩莖段作為外植體時(shí)，4-5月的污染率較低，成活率較高，分別為70.4%和69.1%；6-9月，污染率呈先升高后降低的趨勢(shì)。

10月到次年3月水培的幼嫩莖段作為外植體時(shí)，10月的污染率仍較高，成活率較低；11月、12月污染率逐漸降低，成活率逐漸升高；1-3月采集時(shí)，污染率最低，成活率最高，分別為79.2%、80.1%和81.9%。

由此可見，4-5月是毛梾莖段外植體較為理想的采集時(shí)期；1-3月采集當(dāng)年生枝條進(jìn)行水培后，采用幼嫩莖段作為外植體是毛梾莖段外植體的最佳采集時(shí)期。

2.3 基本培養(yǎng)基對(duì)毛梾莖段腋芽誘導(dǎo)的影響

由表3可見，基本培養(yǎng)基對(duì)毛梾莖段腋芽誘導(dǎo)率影響顯著(P<0.05)。

表3 基本培養(yǎng)基對(duì)腋芽誘導(dǎo)的影響

Table 3 Effect of basal medium on induction of axillary bud

基本培養(yǎng)基Basalmedium腋芽誘導(dǎo)率/%Inductionfrequency腋芽萌發(fā)期/dGerminationstage生長(zhǎng)表現(xiàn)GrowthsituationMS872±27a7～8良好，葉片伸展較快B5809±14ab8～10細(xì)弱，葉片伸展較快WPM770±13b8～10良好，葉片伸展較慢

研究結(jié)果表明，MS培養(yǎng)基培養(yǎng)的腋芽誘導(dǎo)率最高，達(dá)87.2%，腋芽在7～8 d開始萌發(fā)，植株生長(zhǎng)健壯，葉片伸展較快。B5和WPM培養(yǎng)基培養(yǎng)的腋芽誘導(dǎo)率略低，腋芽萌發(fā)略晚，長(zhǎng)勢(shì)均不及MS培養(yǎng)基生長(zhǎng)健壯。

由此可見，MS培養(yǎng)基是毛梾莖段腋芽誘導(dǎo)的最佳基本培養(yǎng)基。

2.4 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)毛梾莖段腋芽誘導(dǎo)的影響

由表4可見，不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)毛梾莖段腋芽誘導(dǎo)率有極顯著影響(P<0.05)。

表4 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)腋芽誘導(dǎo)的影響

Table 4 Effect of plant growth regulator combination on induction of axillary bud

BA/mg·L-1NAA/mg·L-1IBA/mg·L-1腋芽誘導(dǎo)率/%Inductionfrequency05010667±17d10010742±23bc20010712±13cd050101855±12a100101844±13a200101789±06b

研究結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)基添加不同濃度的BA與0.1 mg·L-1NAA組合時(shí)，腋芽誘導(dǎo)率低于BA、NAA與IBA組合。BA與NAA組合時(shí)，當(dāng)BA濃度為1.0 mg·L-1，腋芽誘導(dǎo)率最高，達(dá)74.2%；高于或低于此濃度，腋芽誘導(dǎo)率均降低。BA、NAA與IBA組合時(shí)，當(dāng)BA濃度為0.5 mg·L-1和1.0 mg·L-1時(shí)，腋芽誘導(dǎo)率最高，分別為85.5%和84.4%；當(dāng)BA濃度提高至2.0 mg·L-1，腋芽誘導(dǎo)率有所降低，并伴有輕微玻璃化現(xiàn)象。

由此可見，培養(yǎng)基添加0.5～1.0 mg·L-1BA、0.1 mg·L-1NAA與0.1 mg·L-1IBA是毛梾莖段腋芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基。

2.5 pH值對(duì)毛梾莖段腋芽誘導(dǎo)的影響

由表5可見，不同pH值對(duì)毛梾莖段腋芽誘導(dǎo)率影響極顯著(P<0.05)。

表5 pH值對(duì)腋芽誘導(dǎo)的影響

研究結(jié)果表明，當(dāng)pH值為5.8時(shí)，腋芽誘導(dǎo)率最高，達(dá)84.9%，腋芽在培養(yǎng)7～8 d時(shí)開始萌發(fā)，植株健壯，生長(zhǎng)較快；當(dāng)pH值升高至6.2時(shí)，腋芽誘導(dǎo)率有所降低，萌發(fā)較晚，生長(zhǎng)也較慢，并伴有黃化苗。

由此可見，毛梾莖段腋芽誘導(dǎo)的最佳pH值為5.8。

2.6 光照環(huán)境對(duì)毛梾莖段腋芽誘導(dǎo)的影響

由表6可見，不同光照環(huán)境對(duì)毛梾莖段腋芽誘導(dǎo)率影響顯著(P<0.05)。

表6 光照環(huán)境對(duì)腋芽誘導(dǎo)的影響

Table 6 Effect of light condition on induction of axillary bud

光照環(huán)境Lightcondition腋芽誘導(dǎo)率/%Inductionfrequency腋芽萌發(fā)期/dGerminationstage生長(zhǎng)表現(xiàn)Growthsituation光照培養(yǎng)851±157～8植株健壯，葉片大而綠黑暗培養(yǎng)788±1710～12莖段細(xì)弱，葉片變小

研究結(jié)果表明，在光照培養(yǎng)環(huán)境下，腋芽誘導(dǎo)率最高，達(dá)85.1%，在培養(yǎng)7～8 d腋芽開始萌發(fā)，植株生長(zhǎng)健壯，葉片大而綠；在黑暗培養(yǎng)條件下，腋芽誘導(dǎo)率略低，萌發(fā)較晚，莖段細(xì)弱，葉片變小，淡綠色，并伴有白化或黃化苗。由此可見，光照培養(yǎng)環(huán)境更有利于毛梾莖段腋芽誘導(dǎo)及生長(zhǎng)。

3 結(jié)論與討論

有效控制外植體污染是建立植物組織培養(yǎng)體系的重要前提。因外植體材料不同，需選用適宜的滅菌劑。本研究選用2% NaClO溶液和0.1% HgCl2溶液作為滅菌劑，并分別設(shè)計(jì)了不同滅菌時(shí)間進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明，采用0.1% HgCl2滅菌4～5 min是毛梾莖段外植體的最佳滅菌劑和滅菌時(shí)間。在紅瑞木的組織培養(yǎng)試驗(yàn)中，也采用0.1% HgCl2作為滅菌劑，滅菌時(shí)間為8 min[11]?？偟膩?lái)說(shuō)，毛梾莖段外植體滅菌較為困難，可能是由于自身覆蓋有一層絨毛，容易滋生細(xì)菌，且不易消除[9]。

不同植物材料的最佳采集時(shí)期也不同。本研究結(jié)果表明，4-5月是毛梾莖段外植體較為理想的采集時(shí)期；1-3月采集當(dāng)年生枝條進(jìn)行水培后，采用幼嫩莖段作為外植體是毛梾莖段外植體的最佳采集時(shí)期?？赡苁怯捎?-5月是毛梾自然萌發(fā)、生長(zhǎng)的季節(jié)，外植體比較幼嫩，攜帶病菌較少，容易消毒；1-3月正處于寒冷的冬季，外界環(huán)境中的病菌較少，而且水培后很快進(jìn)行滅菌接種，外植體攜帶病菌也較少，因此也易于滅菌。但也有學(xué)者對(duì)蘋果莖段進(jìn)行組織培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)，在3-6月采集的成活率可達(dá)60%，而7-11月采集則下降到10%，12月至翌年2月則在10%以下[12]?？梢姡煌参锊牧享氝x擇適宜的采集時(shí)期進(jìn)行接種培養(yǎng)。

選擇適宜的基本培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)成功的關(guān)鍵問(wèn)題之一。根據(jù)不同的植物材料選用合適的基本培養(yǎng)基。本研究發(fā)現(xiàn)，MS培養(yǎng)基是毛梾莖段腋芽誘導(dǎo)的最佳基本培養(yǎng)基，腋芽誘導(dǎo)率高于B5和WPM培養(yǎng)基。該研究結(jié)果與大多數(shù)成功的木本植物組織培養(yǎng)選用MS培養(yǎng)基結(jié)論一致。

木本植物組織培養(yǎng)中，外植體的誘導(dǎo)與植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類、組合及濃度有關(guān)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基添加0.5～1.0 mg·L-1BA、0.1 mg·L-1NAA與0.1 mg·L-1IBA是毛梾莖段腋芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基。在金葉紅瑞木的離體快繁試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，MS培養(yǎng)基添加0.5 mg·L-1BA與0.05～0.20 mg·L-1IBA是金葉紅瑞木的最佳啟動(dòng)培養(yǎng)基[13]。毛梾和金葉紅瑞木同屬于山茱萸科梾木屬植物，腋芽誘導(dǎo)所需的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類和組合卻不盡相同?？梢?，不同植物材料需要根據(jù)自身的生長(zhǎng)特性選擇適宜的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。

培養(yǎng)基的pH值因培養(yǎng)材料不同而異。大多數(shù)木本植物要求pH值在5.0～6.0[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，毛梾莖段腋芽誘導(dǎo)的最佳pH值為5.8。陳陸琴等在彩萼石楠的組培快繁試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，適宜外植體生長(zhǎng)的最佳pH是5.4～5.8[15]。

通常情況下，芽的誘導(dǎo)都是在光照條件下完成的。在培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，光照環(huán)境對(duì)毛梾腋芽誘導(dǎo)影響顯著。光照環(huán)境下，植株生長(zhǎng)健壯，葉片大而綠；黑暗環(huán)境下，莖段細(xì)弱，葉片變小，淡綠色，并伴有白化或黃化苗。可能是因?yàn)槊珬吺窍碴?yáng)植物，光照環(huán)境更有利于其生長(zhǎng)。

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(編輯：馬榮博)

The study of the key factors affecting axillary bud induction and optimizing system ofcornuswalteri

Zhang Na

(ShanxiAcademyofForestrySciences,Taiyuan030012，China)

[Objective]To establish an efficient system for axillary bud induction using young stem segments as explants ofCornuswalteri.[Methods]The paper studied the influence factors which included the disinfectant types and the disinfection time, the collection period of explants, the types of basic culture medium, the combination of plant growth regulators, pH et al.[Result](1) The best disinfectant and disinfecting time was 0.1% mercuric chloride for 4～5 min; (2) The better collection period for explants was from April to May; The best collection period was from January to March, using young stem segments as explants after water culture; (3) The optimum medium was MS medium for axillary bud induction; (4) The frequency of axillary bud induction were the highest when the medium supplemented with 0.5～1.0 mg·L-1BA and 0.1 mg·L-1NAA and 0.1 mg·L-1IBA with 85.5% and 84.4%; (5) The optimum pH was 5.8 for axillary bud induction; (6) Light culture was more beneficial for the induction and development of axillary bud.[Conclusion]Using young stem segments as explants after water culture, 0.1% mercuric chloride as disinfectant for 4～5 min, cultured on MS supplemented with 0.5～1.0 mg·L-1BA and 0.1 mg·L-1NAA and 0.1 mg·L-1IBA, were the best culture system for axillary bud induction ofCornuswalteri.

Cornuswalteri, Stem segment explant, Axillary bud induction

2017-04-04

2017-05-09

張娜(1985-)，女(漢)，山西新絳人，工程師，博士，研究方向：森林培育及林木組織培養(yǎng)快速繁殖

山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(20140311015-1)；山西省林業(yè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目(2016)

S722.8

A

1671-8151(2017)09-0635-05