谷子Aux/IAA家族基因干旱脅迫響應(yīng)表達(dá)模式分析

劉晶，王俊杰，程璐，陳利青，禾璐，候蕊，韓淵懷,*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801； 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物工程研究所，山西 太谷 030801；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所，山西 忻州 034000； 4.山西省晉城市城區(qū)農(nóng)業(yè)委員會，山西 晉城 048400)

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谷子Aux/IAA家族基因干旱脅迫響應(yīng)表達(dá)模式分析

劉晶1，王俊杰2，程璐1，陳利青1，禾璐3，候蕊4，韓淵懷1,2*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801； 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物工程研究所，山西 太谷 030801；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所，山西 忻州 034000； 4.山西省晉城市城區(qū)農(nóng)業(yè)委員會，山西 晉城 048400)

[目的]Aux/IAA是重要的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與植物生長素介導(dǎo)的應(yīng)答作用，同時參與植物的脅迫和防御響應(yīng)。本文通過分析Aux/IAA家族基因在干旱脅迫中的表達(dá)情況，探索谷子抗旱與Aux/IAA家族基因的關(guān)系。[方法]本文對谷子Aux/IAA家族基因理化性質(zhì)、蛋白親疏水性、啟動子功能元件等進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并對抗旱(GG)和干旱敏感(JF16)谷子品種在澆水和干旱脅迫下基因的表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。[結(jié)果]谷子Aux/IAA家族基因均含有多個與脅迫相關(guān)的功能元件，且5個基因編碼的蛋白均為親水性蛋白；干旱脅迫處理后，GG和JF16中5個基因的表達(dá)變化趨勢有所不同，Seita.5G126200、Seita.1G028400、Seita.3G109400表達(dá)量均下調(diào)，Seita.1G356800基因的表達(dá)量明顯上調(diào)。[結(jié)論]谷子Aux/IAA家族基因參與調(diào)控谷子干旱脅迫，其調(diào)控過程比較復(fù)雜，可作為參與谷子抗旱的候選基因。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探究谷子中Aux/IAA與抗旱機(jī)制提供一定理論依據(jù)。

谷子；Aux/IAA； 干旱脅迫； 生物信息學(xué)分析

谷子(Setariaitalica(L.)Beauv.)，在古代被稱做“百谷之長”，是我國種植最古老的農(nóng)作物之一，是重要的雜糧作物[1]。我國的谷子種植范圍較廣，主要分布在華北、東北地區(qū)。由于種植地區(qū)不同，各地區(qū)的環(huán)境、氣候條件差異較大，對谷子的生長發(fā)育產(chǎn)生較大影響。

目前，影響谷子產(chǎn)量的眾多因素中，干旱(drought)是限制谷子產(chǎn)量提高的主要因素。因此，了解谷子干旱脅迫條件下的分子機(jī)制對提高谷子抗旱性有很大作用。

生長素IAA(Indole-3-acetic acid)是重要的植物激素之一，對植物生長發(fā)育具有重要的調(diào)節(jié)作用，其在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控受很多蛋白的影響。Aux/IAA(auxin /indoleacetic acids protein)和生長素應(yīng)答因子ARF(auxin response factor)是2個重要的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子，它們廣泛參與植物生長素介導(dǎo)的應(yīng)答作用， Aux/IAA蛋白是通過與ARF轉(zhuǎn)錄因子相互作用介導(dǎo)生長素反應(yīng)的短壽命轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。通常Aux/IAA家族基因均包含4個保守結(jié)構(gòu)域：結(jié)構(gòu)域 I、II、III、IV[2]。

近年來對Aux/IAA基因家族的研究逐漸成為熱點(diǎn)，雖然對植物生長素的研究主要集中在植物發(fā)育過程中，但最近的一些研究表明，生長素也參與植物的脅迫或防御反應(yīng)。據(jù)報道，植物感病時內(nèi)源性激素IAA含量顯著增加[3]，同時，一些生長素調(diào)節(jié)基因的表達(dá)量也會發(fā)生改變[4]；microRNA介導(dǎo)的生長素信號被抑制時，可以使細(xì)菌的耐藥性增強(qiáng)[5]；對水稻生長素相關(guān)的基因進(jìn)行全基因組分析發(fā)現(xiàn)，幾種與生長素相關(guān)的基因在各種非生物脅迫條件下的表達(dá)存在差異，說明生長素與非生物脅迫信號之間有聯(lián)系[6]；擬南芥處于低溫環(huán)境時，其中Aux/IAA和ARF基因家族成員的表達(dá)也會發(fā)生改變[7]。

目前國內(nèi)外對于谷子中Aux/IAA基因家族干旱脅迫表達(dá)分析的研究較少，本研究以耐旱品種勾勾母雞咀(GG)和干旱敏感品種晉汾16(JF16)為材料，種植21 d后，用20%的PEG-6000對谷子幼苗采取干旱脅迫處理，將處理后的幼苗提取RNA，進(jìn)行表達(dá)譜測序分析，找到與脅迫相關(guān)的Aux/IAA家族基因，對其理化性質(zhì)、啟動子元件等進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時對干旱脅迫下耐旱品種GG和干旱敏感品種JF16中不同Aux/IAA家族基因成員的表達(dá)量進(jìn)行分析，為進(jìn)一步研究谷子Aux/IAA家族基因在干旱脅迫過程中的功能奠定基礎(chǔ)，為闡明谷子在分子水平的抗旱機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用材料耐旱品種勾勾母雞咀(GG)和干旱敏感品種晉汾16(JF16)，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究所和山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院品種資源研究所提供，在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院人工氣候室種植培養(yǎng)。

將GG和JF16種于混合土壤(蛭石∶營養(yǎng)土=1∶3)，在14 h光照(28 ℃)、10 h黑暗(23 ℃)條件下培養(yǎng)21 d后，用20%的PEG-6000對谷子幼苗進(jìn)行30 min干旱脅迫處理，對照組用蒸餾水處理。將處理后的幼苗隨機(jī)選取3株，提取RNA、反轉(zhuǎn)錄，然后進(jìn)行表達(dá)譜測序分析。

1.2 試驗(yàn)方法

利用ExPASY(https://web.expasy.org/compute-pi/)分析谷子Aux/IAA家族基因的理化性質(zhì)；

利用GSDS 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)分析基因結(jié)構(gòu)；

利用Expasy Protscale(http://web.expasy.org/protscale/)分析Aux/IAA家族基因編碼蛋白的親水/疏水性；

利用Phytozome 12(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)谷子基因組數(shù)據(jù)庫查找Aux/IAA家族基因的基因序列信息；

利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對谷子Aux/IAA家族基因進(jìn)行啟動子元件分析；

利用MAGA7.0軟件對谷子中找到的5個Aux/IAA家族基因與玉米、高梁等禾本科作物的Aux/IAA基因進(jìn)行比對，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷子Aux/IAA家族基因的基因結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)

在谷子中找到了5個Aux/IAA家族基因，對它們進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)的分析，主要包括基因組序列長度、CDS序列長度、在染色體上的位置、氨基酸數(shù)量、等電點(diǎn)和分子量。由表1可見，谷子Aux/IAA家族的5個基因分布在3條不同的染色體上，分別位于1，3，5號染色體的不同位點(diǎn)。他們的基因組序列長度有很大區(qū)別，最小為973 bp，最大的有4 822 bp；有4個蛋白長度在231～277個氨基酸之間，最小(Seita.1G028400)為175個氨基酸，相對應(yīng)的蛋白分子量在18 914.19(Seita.1G356800)～29 316.79(Seita.1G028400)Da之間，CDS序列長度在528～834 bp之間。等電點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，除Seita.1G356800等電點(diǎn)的為6.08顯酸性外，其余4個均大于7.5，顯堿性。

表1 谷子Aux/IAA 家族基因的基本信息

2.2Aux/IAA家族基因內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)組成分析

使用GSDS2.0對Aux/IAA家族基因的CDS序列、基因序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。由圖1可見所有基因都包含內(nèi)含子和外顯子結(jié)構(gòu)，Seita.1G028400、Seita.3G109400都含有5個內(nèi)含子，Seita.5G268600含有4個內(nèi)含子，而Seita.1G356800和Seita.5G126200只含有2個內(nèi)含子；Seita.5G126200不含有上下游序列，Seita.1G028400、Seita.3G109400有較長的上游序列。

圖1 谷子Aux/IAA 家族基因內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)Fig.1 Intron-exon structures of Aux/IAA family members in foxtail millet

2.3Aux/IAA家族基因編碼蛋白的親水/疏水性分析

用Expasy Protscale分析Aux/IAA家族基因編碼蛋白的親水/疏水性，結(jié)果如圖2所示，Aux/IAA家族基因蛋白氨基酸殘基中疏水性最強(qiáng)的為Seita.1G356800(2.500)，最弱的為Seita.3G109400(2.360)；親水性最強(qiáng)的為Seita.5G126200(-3.780)，最弱的為Seita.3G109400(-3.080)。在5個Aux/IAA家族基因編碼的蛋白中，親水性氨基酸數(shù)量明顯多于疏水性氨基酸的數(shù)目，故推斷5個Aux/IAA家族基因編碼的蛋白均為親水蛋白。

2.4Aux/IAA家族基因的啟動子元件及功能分析

使用在線軟件PlantCARE對所取谷子的Aux/IAA家族基因啟動子上游1 500 bp進(jìn)行啟動子元件分析。由表2可見，谷子Aux/IAA家族基因都含有至少一個或多個與脅迫相關(guān)的調(diào)控元件，它們共同調(diào)控谷子生長過程對脅迫的應(yīng)對。5個基因均含有與茉莉酸甲酯(MeJA)相關(guān)的調(diào)控元件，除Seita.5G126200外均含有與脫落酸(ABA)相關(guān)的調(diào)控元件，除Seita.1G356800外都含有與水楊酸(SA)相關(guān)的調(diào)控元件，Seita.1G356800和Seita.1G028400含有與赤霉素(GA)相關(guān)的調(diào)控元件等。

圖2 Aux/IAA家族基因蛋白的親水/疏水性預(yù)測Fig.2 Prediction of hydrophobicity and rophilicity of Aux/IAA family members

2.5Aux/IAA家族基因成員干旱脅迫時在GG和JF中的表達(dá)量分析

使用20%的PEG-6000對谷子幼苗進(jìn)行干旱脅迫處理后，對Aux/IAA家族基因在耐旱品種GG和干旱敏感品種JF16中的表達(dá)量進(jìn)行分析。

由圖3可見，GG和JF16中，Seita.5G126200、Seita.1G028400、Seita.3G109400三個基因在干旱脅迫條件下，表達(dá)量都下調(diào)；Seita.5G268600基因在正常澆水時，2個品種相比表達(dá)水平差異不明顯，在干旱脅迫時，耐旱品種GG中表達(dá)量上調(diào)，在干旱敏感品種JF16中表達(dá)量卻出現(xiàn)下調(diào)；Seita.1G356800基因在正常澆水情況下，在GG中表達(dá)水平很低，在JF16中表達(dá)水平較高；在干旱脅迫時，GG和JF16中Seita.1G356800基因的表達(dá)量都明顯上調(diào)。

表2 谷子Aux/IAA家族基因啟動子功能元件數(shù)目

圖3 谷子Aux/IAA家族基因干旱脅迫及對照情況下在GG和JF中的表達(dá)量Fig.3 The expression of Aux/IAA family members in GG and JF under drought stress and control

2.6 谷子Aux/IAA家族基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

使用MAGA7.0軟件對谷子中找到的5個Aux/IAA家族基因與玉米、高梁等禾本科作物的Aux/IAA基因進(jìn)行比對，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，可以直觀的看到5個成員與玉其他植物Aux/IAA基因親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，了解其進(jìn)化過程。由圖4可見，Aux/IAA家族5個基因中，Seita.5G268600與Zeamays5親緣關(guān)系最近，Seita.5G126200與Zeamays15處在同一分支上，親緣關(guān)系較近，而Seita.1G356800與Zeamays9親緣關(guān)系較近，且Seita.5G268600、Seita.5G126200、Seita.1G356800處在同一大的分支，表明這3個基因親緣關(guān)系較近。Seita.1G028400與Seita.3G109400處在一個大的分支，分別與Zeamays2和Zeamays16聚為一類，說明二者親緣關(guān)系較其他3個基因近。

圖4 谷子Aux/IAA家族基因進(jìn)化樹分析Fig.4 Phylogenetic tree of Aux/IAA family members

3 結(jié)論與討論

生長素IAA是植物體內(nèi)一種非常重要的激素，在植物的生長發(fā)育過程中起重要的調(diào)節(jié)作用。Aux/IAA基因是生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中重要的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子，同時它在植物抗逆性方面也起到調(diào)節(jié)作用。本試驗(yàn)通過對谷子幼苗進(jìn)行20%的PEG-6000干旱脅迫處理，找到5個響應(yīng)干旱脅迫的Aux/IAA家族基因，對其基因結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、與脅迫相關(guān)的啟動子原件等進(jìn)行分析，為研究谷子Aux/IAA家族基因在干旱脅迫等發(fā)育進(jìn)程中的功能奠定基礎(chǔ)。

通過對Aux/IAA家族5個基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行親水/疏水性分析，發(fā)現(xiàn)5個蛋白均為親水性蛋白。蛋白質(zhì)的高親水性使植物即使受到干旱脅迫，蛋白質(zhì)也能夠代替細(xì)胞中的水分子，從而很好的抵御干旱脅迫對植物造成的損傷，在提高植物的抗逆性方面有很大作用[8]。表明，Aux/IAA家族基因?qū)茸涌购敌缘奶岣叻矫嬗杏绊憽?/p>

通過對谷子Aux/IAA家族基因啟動子上游1 500 bp進(jìn)行啟動子元件分析，結(jié)果顯示，谷子Aux/IAA家族基因包含許多與脅迫相關(guān)的元件：ABRE是與脫落酸(ABA)相關(guān)的調(diào)控元件，而ABA可以提高植物的抗旱能力；CGTCA-motif和TGACG-motif均是與茉莉酸甲酯(MeJA)相關(guān)的調(diào)控元件，MeJA能夠激發(fā)植物防御基因的表達(dá)，從而提高植物的抗逆能力[9]；TCA-element和TATC-box分別是與水楊酸(SA)和赤霉素(GA)相關(guān)的調(diào)控元件，據(jù)報道，干旱條件下在玉米幼苗葉表皮噴灑SA可以提高其抗旱性、GA可以提高煙草幼苗及種子的抗旱性[10,11]；MBS(TAACTG)是與干旱誘導(dǎo)相關(guān)的調(diào)控元件；MBS(CGGTCA)、TC-rich repeats等都是與脅迫相關(guān)的調(diào)控元件，它們共同作用來調(diào)節(jié)谷子生長過程對脅迫的響應(yīng)。

有研究表明，對不同脅迫下水稻中Aux/IAA家族基因的表達(dá)譜進(jìn)行分析，多個基因表達(dá)量出現(xiàn)上調(diào)或下調(diào)[12]。本試驗(yàn)通過分析Aux/IAA家族的5個基因在耐旱品種GG和干旱敏感品種JF16中的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫時，Seita.1G356800基因表達(dá)量在2個品種中都上調(diào)，說明該基因響應(yīng)干旱脅迫，提高植物的抗旱能力，與Jain等人的研究結(jié)果一致[6]；Seita.5G268600基因干旱脅迫下在耐旱品種GG中表達(dá)量上調(diào)，在干旱敏感品種JF中表達(dá)量下調(diào)，說明該基因在2個不同品種中表達(dá)響應(yīng)不同，可能是造成2個品種抗旱能力不同的原因之一；Seita.5G126200、Seita.1G028400、Seita.3G109400三個基因表達(dá)量均下調(diào)，說明Aux/IAA家族基因在生長素、水楊酸和抗生素脅迫信號通路之間的串?dāng)_中起到重要作用[13]。

綜上所述，本文對谷子Aux/IAA家族基因的理化性質(zhì)、蛋白質(zhì)親疏水性、所含脅迫相關(guān)元件以及系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，基于不同品種谷子干旱脅迫下的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，初步探究了谷子Aux/IAA家族基因在干旱脅迫下的表達(dá)量及變化規(guī)律，為研究谷子抗旱分子機(jī)制提供了一定的理論依據(jù)。

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(編輯：韓志強(qiáng))

Expression analysis ofAux/IAAfamily members in response to drought stress in foxtail millet

Liu Jing1, Wang Junjie2, Cheng Lu1, Chen Liqing1, He Lu3, Hou Rui4, Han Yuanhuai1,2*

(1.CollegeofAgriculture，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China; 2.InstituteofAgriculturalBioengineering，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China; 3.MaizeResearchInstitutetoShanxiAcademyofAgricultureSciences，Xinzhou034000，China; 4.UrbanAgricultureCommitteeofShanxiJincheng，Jincheng048400，China)

[Objective]Aux/IAA is an important transcription factor protein. It is widely involved in plant auxin-mediated response, plant stress and defense response. The relationship between drought resistance andAux/IAAfamily members was studied by analyzing the expression ofAux/IAAfamily members under drought stress in foxtail millet.[Methods]The bioinformatics analysis was carried out on the physicochemical properties, protein hydrophobicity and cis-acting elements of theAux/IAAfamily members in foxtail millet. Then we analyzed the expression ofAux/IAAfamily members under drought stress.[Results]The result showed that there were a number of stress-related functional elements in theAux/IAAfamily members in foxtail millet, and the proteins they code were all hydrophilic. The expression levels of genes were significantly different between drought-tolerant and drought-sensitive varieties under drought stress. The expression levels ofSeita1.5G126200,Seita.1G028400 andSeita.3G109400 were down-regulated, whereas the expression level ofSeita.1G356800 gene was significantly up-regulated.[Conclusion]TheAux/IAAfamily members in foxtail millet are involved in the regulation of millet drought stress, and the process of regulation is a complex process. Some of them could also be used as candidate genes for drought tolerance in foxtail millet. Theseresult provide a theoretical basis for further study of the mechanism of the relationship between theAux/IAAand drought tolerance in foxtail millet.

Foxtail millet,Aux/IAAfamily members, Drought stress, Bioinformatics analysis

2017-04-21

2017-05-22

劉晶(1994-)，女(漢)，山西晉中人，碩士，研究方向：基因組學(xué)與分子育種

*通信作者：韓淵懷，教授，博士生導(dǎo)師，Tel：0354-6287239；E-mail：swgctd@163.com

國家自然科學(xué)基金(31401396)；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新基金(20142-07)

S515

A

1671-8151(2017)09-0609-07