利用AB SCIEX QTRAP?4500系統(tǒng)建立假羊肉的檢測(cè)方法AB SCIEX QTRAP?MIDASTM工作流程在假肉檢測(cè)中的優(yōu)勢(shì)

□ 郭立海 程海燕 王海鑒 靳文海 劉華芬 AB SCIEX公司

利用AB SCIEX QTRAP?4500系統(tǒng)建立假羊肉的檢測(cè)方法AB SCIEX QTRAP?MIDASTM工作流程在假肉檢測(cè)中的優(yōu)勢(shì)

□ 郭立海 程海燕 王海鑒 靳文海 劉華芬 AB SCIEX公司

近年來(lái)，市場(chǎng)上出售的部分羊肉卷中摻有大量鴨肉的新聞屢被報(bào)道，甚至有老鼠肉的新聞，商家通過(guò)摻假賺取非法利潤(rùn)，“掛羊頭賣(mài)狗肉”欺騙消費(fèi)者，侵犯消費(fèi)者合法權(quán)益，這種現(xiàn)象在中國(guó)已是行業(yè)內(nèi)默認(rèn)的“潛規(guī)則”。目前有效準(zhǔn)確的摻假檢測(cè)方法十分有限，只有個(gè)別檢測(cè)機(jī)構(gòu)利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR）擴(kuò)增這些物種特有的DNA，但這種方法并不能直接檢測(cè)肉類(lèi)的主要成分—蛋白質(zhì)，而且肉類(lèi)處理加工過(guò)程會(huì)輕易地破壞和去除這些DNA。這樣一來(lái)，就算食品樣品中含有大量的鴨或老鼠組織和其他一些污染物也無(wú)法被檢測(cè)出來(lái)。還有一種補(bǔ)充方法—酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）也可以進(jìn)行蛋白質(zhì)檢測(cè)，但是這種方法一次只能檢測(cè)單個(gè)蛋白質(zhì)，不能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)物種，反應(yīng)特異性也不好。

肉類(lèi)來(lái)源物種檢測(cè)最大的困難是如何找到特定物種的特異蛋白質(zhì)或肽，由于以上兩種方法特異性并不高，可能會(huì)存在假陽(yáng)性結(jié)果，所以急需開(kāi)發(fā)出一種快速、準(zhǔn)確和特異性更高的檢測(cè)方法。

首先采用高靈敏度、高掃描速度的AB SCIEX Triple TOFTM5600質(zhì)譜系統(tǒng)鑒定各肉類(lèi)的蛋白質(zhì)，通過(guò)比較分析尋找各肉類(lèi)物種蛋白質(zhì)特異的肽，經(jīng)過(guò)blast進(jìn)一步篩查和確認(rèn)，然后再在AB SCIEX QTRAP?4500系統(tǒng)上利用MIDASTM工作流程建立起多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）檢測(cè)假羊肉的方法。主要目的是建立一套簡(jiǎn)單易用的MRM檢測(cè)假肉方法，不再需要復(fù)雜的方法開(kāi)發(fā)過(guò)程，而且該方法可以很方便地將新的需要檢測(cè)物種的MRM離子對(duì)加進(jìn)去，在一個(gè)方法里可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)特征肽和多個(gè)物種。另外QTRAP?質(zhì)譜可以利用MRM觸發(fā)的增強(qiáng)離子掃描方式進(jìn)一步確認(rèn)蛋白質(zhì)/肽序列，從而有效去除假陽(yáng)性的可能，增加檢測(cè)結(jié)果的可靠性。最終檢測(cè)方法可以利用純鴨肉或雞肉樣品來(lái)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而很容易計(jì)算出樣品中摻入假肉的比例和量。所以質(zhì)譜檢測(cè)方法要比PCR、ELISA 或其他非直接檢測(cè)方法更簡(jiǎn)易、更準(zhǔn)確和更可靠。

AB SCIEX QTRAP?4500

方法

材料

本文所用的肉類(lèi)樣品：鴨肉、雞肉、羊肉、牛肉、豬肉、兔肉，均從市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)，摻假樣品羊肉卷是從某大型超市購(gòu)買(mǎi)，大鼠肉來(lái)自實(shí)驗(yàn)用大鼠腿部肌肉。

樣品制備

首先取2g肉樣均質(zhì)，加入液氮研磨成粉狀，然后加入蛋白提取液（7M尿素，2M硫脲，4%CHAPS），離心取0.1mL上清液并轉(zhuǎn)移到超濾管中，加入二硫蘇糖醇在60℃條件下保持60分鐘還原二硫鍵，然后加入碘乙酰胺室溫避光反應(yīng)30分鐘進(jìn)行烷基化，加入200μL50mmol/mL碳酸氫銨溶液，14000g離心20分鐘，重復(fù)3次，最后加入100μL含有胰蛋白酶的50mmol/mL碳酸氫銨溶液震蕩混勻，40℃酶解3小時(shí)。

特征肽的找尋

采用Eksigent nanoLC-Ultra?液相系統(tǒng)和AB SCIEX Triple TOFTM5600質(zhì)譜系統(tǒng)鑒定各物種肉類(lèi)蛋白質(zhì)，每個(gè)樣品上樣2μg總蛋白。采用75μm內(nèi)徑柱子30分鐘梯度分析時(shí)間。用Protein PilotTM軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，所用數(shù)據(jù)庫(kù)是NCBInr全庫(kù)，選用了氨基酸替換搜索功能。

通過(guò)詳細(xì)比較在各個(gè)物種肉類(lèi)鑒定的蛋白質(zhì)和肽列表，找到只在鴨肉或雞肉樣品里鑒定的特異肽，即這些肽可以作為鴨或雞的特異標(biāo)志物，且這些肽對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)必須是幾個(gè)物種里都能鑒定到的，只是肽的氨基酸序列有差別，并且盡量選用高豐度蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)的肽。最后將這些特征肽再在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行blast分析，進(jìn)一步確認(rèn)其特異性，即這些肽的氨基酸序列不能與其他幾個(gè)物種100%匹配。

MIDASTM工作流程建立MRM檢測(cè)方法

采用Shimadzu 20AD XR液相系統(tǒng)和AB SCIEX QTRAP?4500質(zhì)譜系統(tǒng)構(gòu)建MIDASTM工作流程、建立MRM檢測(cè)方法。每個(gè)肉類(lèi)樣品取2μg總蛋白，經(jīng)過(guò)22分鐘的液相梯度條件分離，其中的A相為0.1%甲酸的水溶液，B相為0.1%甲酸的乙腈。色譜柱采用Phenomenex Kinetex 4.6mm×100mm，2.6um，100A反向C18色譜柱，流速0.4mL/min，40℃柱溫。

表 1 MRM檢測(cè)液相分離條件

MIADSTM工作流程

質(zhì)譜檢測(cè)是在配有電噴霧電離源（ESI）的AB SCIEX QTRAP?4500質(zhì)譜平臺(tái)上完成的。MRM觸發(fā)EPI方法是基于MIDASTM工作流程開(kāi)發(fā)完成。

基本思路：首先，利用Skyline軟件構(gòu)建鴨和雞的特征肽的MRM離子對(duì)和QTRAP?的MRM觸發(fā)EPI實(shí)驗(yàn)方法。然后在7個(gè)肉類(lèi)樣品中逐一進(jìn)行篩選和確認(rèn)，根據(jù)同一個(gè)肽的MRM離子對(duì)的保留時(shí)間和MSMS質(zhì)譜碎片離子與鑒定實(shí)驗(yàn)的匹配性去掉在其他肉類(lèi)出現(xiàn)的MRM離子對(duì)，保留特異的MRM離子對(duì)，并進(jìn)一步優(yōu)化DP、CE等質(zhì)譜參數(shù)。

最終確定的質(zhì)譜方法中，TurboVTM離子源參數(shù)為：gas1、gas2和氣簾氣為50psi，源溫度設(shè)為550℃，噴霧電壓為5500V。采用Scheduled MRMTM算法進(jìn)行檢測(cè)：MRM檢測(cè)窗口設(shè)置為30秒，掃描時(shí)間設(shè)置為0.6秒。EPI掃描速度10000Da/s，掃描質(zhì)量范圍：250～1200Da，DP電壓50v，CE能量40±15V。

摻入最低定量檢測(cè)限LLOQ

將鴨肉和雞肉蛋白樣品按比例稀釋加入到羊肉蛋白樣品中，羊肉蛋白總量維持在2μg，以此確定鴨肉和雞肉摻入羊肉中的最低定量檢測(cè)限。用MultiquantTM軟件自動(dòng)積分并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算CV值和準(zhǔn)確度。

鴨和雞特征肽找尋

肉類(lèi)鑒定的方法開(kāi)發(fā)最關(guān)鍵的是找尋某一物種特征肽。眾所周知，一些物種親緣關(guān)系比較近，蛋白序列差別很小，比如雞和鴨、羊和牛等。還有一些物種的蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)非常稀缺，比如鴨和羊，這樣找尋這些物種特征肽存在一定的難度，因此實(shí)驗(yàn)采用Triple TOFTM質(zhì)譜系統(tǒng)和Protein PilotTM軟件先鑒定這些物種肉樣品包含的蛋白質(zhì)，充分利用Triple TOFTM質(zhì)譜系統(tǒng)強(qiáng)大的蛋白質(zhì)鑒定能力和Protein PilotTM軟件優(yōu)越的蛋白同源分析能力和物種分組能力。而且通過(guò)檢索NCBInr所有物種的蛋白庫(kù)，這樣很容易在Protein PilotTM軟件中確定一些物種同源的蛋白質(zhì)和肽，并且比較容易地找到某物種特異的肽，即使鴨或羊的數(shù)據(jù)庫(kù)不全，也可以通過(guò)Protein PilotTM軟件氨基酸替換檢索方式找到鴨的特征肽序列。最后在最全的蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI網(wǎng)站做blast分析，進(jìn)一步確認(rèn)這些特征肽的物種特異性，將非特異的肽淘汰掉，保留特異肽。

筆者從某大型超市里隨機(jī)購(gòu)買(mǎi)的羊肉卷里就鑒定出了大量的禽類(lèi)來(lái)源蛋白質(zhì)，由于鴨蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)不全，加上鴨和雞親緣關(guān)系比較接近，所以顯示的蛋白來(lái)源物種基本是原雞，這已經(jīng)提示這些羊肉卷里確實(shí)摻入了某種禽類(lèi)肉，但無(wú)法確定具體是摻入什么肉。通過(guò)尋找的特征構(gòu)建的MRM方法檢測(cè)最終顯示這些羊肉卷里主要摻入了鴨肉而非雞肉，這就表明MRM方法比蛋白鑒定方法結(jié)果特異性更好，所以最終確定開(kāi)發(fā)MRM檢測(cè)方法。

MIDASTM工作流程確認(rèn)特征MRM離子對(duì)

AB SCIEX QTRAP?系列質(zhì)譜最大的優(yōu)勢(shì)是將串聯(lián)四級(jí)桿的高選擇性MRM掃描和離子阱高靈敏度的碎片離子掃描即EPI組合在一起，從而可以實(shí)現(xiàn)MIDASTM工作流程，這樣MRM峰可以得到二級(jí)圖譜的進(jìn)一步確認(rèn)，有效消除假陽(yáng)性的MRM峰。比如在用雞的特征MRM方法分析兔肉樣品時(shí)，在15.5分鐘出現(xiàn)很明顯的MRM峰，但其觸發(fā)的二級(jí)圖譜去做圖庫(kù)檢索發(fā)現(xiàn)此MRM峰匹配到另外一個(gè)肽并不是設(shè)定的雞的特征肽。這說(shuō)明單純的MRM峰并不一定能判定兔肉中有雞肉成分，需要MSMS圖譜進(jìn)一步確認(rèn)。

鴨肉和雞肉的最終特征MRM檢測(cè)方法的確立

通過(guò)以上流程可以確定，鴨的特征MRM檢測(cè)方法在純雞肉、純羊肉、純牛肉、純豬肉、純兔肉和純大鼠肉樣品中都沒(méi)有檢測(cè)出相應(yīng)的MRM峰，在純鴨肉樣品中檢測(cè)出強(qiáng)度很高的MRM峰，證明了該方法的專一性和可靠性。但在超市購(gòu)買(mǎi)的羊肉卷里檢測(cè)出很強(qiáng)的MRM峰，與在純雞肉里出現(xiàn)的MRM峰一致，證明此羊肉卷確實(shí)是摻入了鴨肉，是假羊肉卷。

通過(guò)以上流程，確定雞的特征MRM檢測(cè)方法在純鴨肉、純羊肉、純牛肉、純豬肉、純兔肉和純大鼠肉樣品中都沒(méi)有檢測(cè)出相應(yīng)的MRM峰，在純鴨肉樣品中檢測(cè)出強(qiáng)度很高的MRM峰，證明了該方法的專一性和可靠性。同樣在超市購(gòu)買(mǎi)的假羊肉卷里沒(méi)有檢測(cè)到雞的特征MRM峰，證明此羊肉卷里沒(méi)有摻入雞肉。

羊肉中摻入鴨肉和雞肉最低定量檢測(cè)限

通過(guò)人為方法將鴨肉和雞肉蛋白按比例依次稀釋加入到2μg的羊肉蛋白里，用最終確定的鴨肉特征MRM方法和雞肉特征MRM方法來(lái)確定最低定量檢測(cè)限，鴨肉和雞肉蛋白從2μg開(kāi)始摻入，每個(gè)稀釋重復(fù)3次。最終確定鴨肉最低定量檢測(cè)限可以達(dá)到4ng，最低摻入比例為0.2%，從4～2000ng呈現(xiàn)良好的定量線性。雞肉最低定量檢測(cè)限達(dá)到20ng，最低摻入比例為1%，從20～2000ng呈現(xiàn)良好的定量線性。定量重現(xiàn)性良好，在最低濃度條件下，CV在5%以內(nèi)。這樣的最低定量檢測(cè)限和最低參入比例完全可以滿足日常的肉商檢測(cè)的需要。并可以非常容易地以此標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得假羊肉里摻入鴨肉或雞肉的比例和摻入的絕對(duì)量。

液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)為肉類(lèi)物種來(lái)源檢測(cè)提供了一種快速、穩(wěn)定、靈敏、特異的方法，本方法的靈敏度可以媲美任何現(xiàn)有的ELISA方法或PCR方法。而且液質(zhì)聯(lián)用的方法可以同時(shí)檢測(cè)多種生物物種，遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于ELISA每次只能分別檢測(cè)某種生物。使用MIDAS?工作流程可以在定量的同時(shí)，進(jìn)行QTRAP?二級(jí)全掃描獲得定性確認(rèn)信息，與其他檢測(cè)方式相比大大減少了假陽(yáng)性的概率。

本文給出了肉類(lèi)物種來(lái)源分析的一種通用流程，即用AB SCIEX TripleTOFTM系列快速采集質(zhì)譜系統(tǒng)和ProteinPilotTM軟件鑒定各個(gè)物種蛋白質(zhì)，然后分析找到某些物種的特征肽，再進(jìn)行blast分析篩選確定特征肽，然后轉(zhuǎn)到AB SCIEX QTRAP?質(zhì)譜系統(tǒng)上進(jìn)行MIDASTM流程，確定最終的特征肽MRM檢測(cè)方法。

本文建立了鴨肉和雞肉物種來(lái)源檢測(cè)的MRM方法，實(shí)驗(yàn)表明此方法具有很高的靈敏度、特異性、重現(xiàn)性和極低的線性定量檢測(cè)限，并且在市場(chǎng)上出售的假羊肉卷樣品中得到實(shí)際應(yīng)用，也表明此方法完全可以應(yīng)用在日常的羊肉卷?yè)饺滕喨饣螂u肉的實(shí)際檢測(cè)中。最終可以通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線很容易計(jì)算出在羊肉卷里摻入的鴨肉和雞肉比例和絕對(duì)量。

本文建立的MRM檢測(cè)方法簡(jiǎn)單易用，不需要再進(jìn)行復(fù)雜繁瑣的方法開(kāi)發(fā)過(guò)程，可以直接用來(lái)檢測(cè)羊肉中摻入的鴨肉和雞肉，并且該方法的通量高，具有很好的擴(kuò)充性，可以方便加入新的需要監(jiān)測(cè)的物種MRM離子對(duì)，一個(gè)方法里可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)物種。