擬康寧木霉T-51幾丁質(zhì)酶活性及內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因克隆與分析

尤佳琪, 李國慶

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物病害監(jiān)測和安全控制湖北省重點實驗室, 武漢 430070)

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擬康寧木霉T-51幾丁質(zhì)酶活性及內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因克隆與分析

尤佳琪, 李國慶*

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物病害監(jiān)測和安全控制湖北省重點實驗室, 武漢 430070)

木霉是一類重要的生防真菌,木霉產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶在其生物防治的重寄生過程中起著重要作用。擬康寧木霉TrichodermakoningiopsisT-51是一株對番茄灰霉病有生防潛力的木霉菌株,本文測定了T-51菌株產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶的活性,結(jié)果表明T-51在PDB中液體培養(yǎng)以及與灰霉病菌在PDA上對峙培養(yǎng)時產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶活性顯著受到灰霉病菌的誘導(dǎo)。采用RACE技術(shù)首次克隆了擬康寧木霉T-51中一個幾丁質(zhì)酶基因Tkchit42,全長為1 817 bp,包含4個外顯子和3個內(nèi)含子。預(yù)測該基因有一個1 275 bp的開放閱讀框,編碼424個氨基酸,預(yù)測的蛋白總分子量為46.378 kDa,預(yù)測的等電點(pI)為5.16,與T.koningii中42 kDa內(nèi)切幾丁質(zhì)酶的氨基酸序列相似性達到99%。

幾丁質(zhì)酶; 擬康寧木霉; 基因克隆; 序列分析

果蔬灰霉病是我國保護地果蔬生產(chǎn)中最主要的病害之一[1],在保護地果蔬生產(chǎn)中造成巨大的產(chǎn)量損失?；颐共【鷮瘜W(xué)農(nóng)藥極易產(chǎn)生抗藥性[2],而且化學(xué)農(nóng)藥所引起的農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染等問題也受到人們的重視,因此,生物防治作為一種可替代的灰霉病防治措施,逐漸得到了植物保護研究者的關(guān)注。

木霉是一類具有廣譜生防效果的生防真菌,對包括灰霉病在內(nèi)的許多植物真菌病害都有生防作用。木霉對植物真菌病害的生防機制是多樣的,包括對病原菌營養(yǎng)競爭、重寄生、抗生作用以及通過誘導(dǎo)植物抗性防治病害[3-4]。木霉的重寄生作用過程中,分泌真菌細胞壁水解酶是極其重要的[5]。幾丁質(zhì)是僅次于纖維素的自然界中第二大有機的可再生資源,也是真菌細胞壁骨架的主要成分[6],分泌幾丁質(zhì)酶能夠幫助木霉降解寄主真菌的細胞壁,幫助木霉寄生寄主真菌。幾丁質(zhì)酶家族十分龐大,可分為內(nèi)切幾丁質(zhì)酶、外切幾丁質(zhì)酶、β-N-乙酰氨基葡糖苷酶和殼二糖酶等[7],這些酶共同作用將幾丁質(zhì)逐步降解為單糖。許多研究表明,木霉產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶活性受到病原菌細胞壁的誘導(dǎo)[8],在重寄生過程中幾丁質(zhì)酶基因的表達也有顯著的上調(diào)[9]。擬康寧木霉T-51是本實驗室分離篩選得到的生防木霉菌株,前期的研究結(jié)果表明T-51對灰霉病菌有很強的重寄生能力,并且可以有效抑制灰霉病菌在植物殘體上產(chǎn)孢,還有產(chǎn)生抗真菌物質(zhì)、促進植物生長、誘導(dǎo)植物抗性等作用,對番茄灰霉病表現(xiàn)出很好的生防潛力[10]。然而,目前世界上對于擬康寧木霉生物防治的研究極少,對擬康寧木霉生物防治的分子機制暫無報道。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

擬康寧木霉Trichodermakoningiopsis菌株T-51由本實驗室分離自湖北省武漢市油菜田土壤中。

灰葡萄孢Botrytiscinerea菌株RoseBC-3由本實驗室分離自月季灰霉病殘體上。

1.2 主要試劑

TRIzol?Reagent (InvitrogenTM, USA)、pMD18-T、rTaqDNA聚合酶、dNTP混合物、 5′-Full RACE試劑盒和3′-Full RACE 試劑盒等均購于TaKaRa公司(中國大連);DNA凝膠回收試劑盒購于Axygen Scientific;粉狀幾丁質(zhì)購于Sigma公司,并且根據(jù)任莉[11]的方法制成膠態(tài)幾丁質(zhì)。1% DMAB(對二甲氨基苯甲醛):10 g DMAB溶于100 mL含有12%濃鹽酸的冰醋酸溶液中,待完全溶解后置于4℃下貯存?zhèn)溆?使用時用冰醋酸稀釋10倍。

1.3 粗酶液的制備

1.3.1 液體培養(yǎng)

灰霉病菌菌株RoseBC-3菌絲塊接種在鋪有玻璃紙的PDA平板上生長,菌落長滿后,將菌絲刮下,加液氮研磨成粉,按1%(W/V)比例加入PDB培養(yǎng)基中,在80℃水浴鍋中水浴4 h后,用雙層濾紙過濾,121℃蒸汽滅菌,即為Bc-PDB。取3 mL Bc-PDB或PDB在20 mL的玻璃搖菌瓶中,每瓶加入一個直徑5 mm的木霉T-51生長2 d的新鮮菌絲塊,在25℃搖床中150 r/min搖培3 d。取搖培上清液為粗酶液。

1.3.2 對峙培養(yǎng)

將灰霉病菌菌株RoseBC-3和擬康寧木霉菌株T-51的菌絲塊分別接種在PDA平板的兩端,兩個菌絲塊相距7 cm,或者在PDA平板上單獨接種灰霉或單獨接種木霉。將接種后的PDA平板放在20℃下培養(yǎng)7 d,互作區(qū)域的粗酶液浸提方法參考任莉[11],將對峙培養(yǎng)的平板中灰霉病菌和木霉菌落重疊區(qū)域(即為木霉與灰霉病菌的互作區(qū),簡稱為T+B)或單獨灰霉病菌(B only)或單獨木霉(T only)菌落下的PDA培養(yǎng)基切下,搗碎,按照2∶1(W/V)的比例在ddH2O中浸提過夜,然后取上清液作為粗酶液。

1.4 幾丁質(zhì)酶活力測定

幾丁質(zhì)酶的測定方法參考任莉[11],吸取0.5 mL 粗酶液或PDB(空白對照)于5 mL的離心管中,加入0.5 mL膠態(tài)幾丁質(zhì)。將離心管置于37℃水浴中反應(yīng)4 h。然后以8 000 r/min的速度離心5 min終止酶促反應(yīng)。吸取0.5 mL上清液于一支潔凈離心管中,加入0.1 mL濃度為0.8 mol/L 四硼酸鉀溶液(pH 9.1)。搖勻后,沸水浴中反應(yīng)3 min,迅速用冰水冷卻至室溫。再加入3 mL 制備好的1%對二甲氨基苯甲醛(DMAB)試劑,并在37℃下保溫20 min,自來水中冷卻至室溫。測定各反應(yīng)體系在585 nm下的吸光值。以N-乙酰氨基葡萄糖做標準曲線,在上述酶促反應(yīng)體系中,定義1 mL酶液每小時釋放出1 μmol的N-乙酰氨基葡萄糖定義為一個酶活力單位(U),計算各粗酶液中的幾丁質(zhì)酶活力。

1.5 核酸提取

將生長旺盛的擬康寧木霉T-51菌絲接種到鋪有玻璃紙的固體PDA平板上,置于20℃下培養(yǎng)3 d后收集菌絲。分別使用CTAB法和TRIzol法提取菌絲總DNA和總RNA[12]。

1.6 PCR擴增

本研究所使用的引物序列見表1,其中P1-F/R引物參考伊洪偉[13]克隆長枝木霉中幾丁質(zhì)酶基因的PCR引物,其余引物是本研究中設(shè)計,由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

首先以擬康寧木霉T-51的基因組DNA為模板,用P1F和P1R引物(表1)進行擴增,PCR擴增體系(50 μL):DNA (1 μg/μL) 1 μL,10 × PCR buffer 5 μL,dNTP mix (2.5 mmol/L each) 1 μL, P1-F (20 μmol/L) 1 μL, P1-R (20 μmol/L) 1 μL,rTaqDNA polymerase 0.5 μL,ddH2O 40.5 μL。PCR反應(yīng)程序為:94℃ 預(yù)變性30 s; 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 2 min(35個循環(huán));72℃ 10 min,16℃ 5 min?；蚰┒诵蛄械目寺∈褂?′ RACE和 3′ RACE的方法,根據(jù)已經(jīng)測序獲得的序列設(shè)計了引物Tk-5′-GSP Outer、Tk-5′-GSP Inner、Tk-3′-GSP Inner及Tk-3′-GSP Outer(表1),根據(jù)試劑盒說明書進行擴增。

表1 本文使用的PCR擴增引物序列

Table 1 The sequences of PCR primers used in this study

引物名稱Primername引物序列(5'-3')Sequence(5'-3')P1-FATGTTGGGTTTCCTCGGAAAATCCP1-RCTAGTTGAGACCGCTTCGGATGTTTk-5'-GSPOuterCTGGGTGTCATCGGAAGGGTACTTk-5'-GSPInnerAGCCACCGATAGAAAGCATAACCTk-3'-GSPInnerACGGTATCTGGGACTACAAGGTk-3'-GSPOuterTGGGAGTACCCTTCCGATGA

1.7 擴增產(chǎn)物的純化、連接、轉(zhuǎn)化及測序

擴增后的產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,切下目的片段,使用DNA 凝膠回收試劑盒進行純化,然后連接pMD18-T載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,篩選陽性轉(zhuǎn)化子測序。測序由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成。

1.8 序列分析

核酸序列在NCBI(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)上進行同源性檢索,使用DNAMAN軟件對序列進行拼接,并將核苷酸序列翻譯為氨基酸,使用BioEdit分析軟件對基因的核苷酸序列進行堿基成分和氨基酸組成分析。使用NCBI的ORF Finder分析序列的保守結(jié)構(gòu)域。使用SignalP工具(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)中預(yù)測氨基酸序列的信號肽,通過TargetP工具(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)進行蛋白亞細胞定位的預(yù)測,用SWISS-MODEL工具(http:∥www.swissmodel.expasy.org/) 預(yù)測蛋白的三維模型。使用MEGA軟件(NJ法, 重復(fù)運算1 000次)構(gòu)建與同源基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 幾丁質(zhì)酶活性

T-51在Bc-PDB和PDB中的幾丁質(zhì)酶活性測定結(jié)果如圖1,T-51在Bc-PDB中培養(yǎng)產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶活性(12.85±4.85 U/mL)顯著高于(P<0.05)在PDB中培養(yǎng)產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶活性(9.36±0.61 U/mL)。T-51和灰霉病菌對峙培養(yǎng)過程中的幾丁質(zhì)酶活性測定結(jié)果如圖2,在T-51與RoseBC-3的互作區(qū)域(T+B)中的幾丁質(zhì)酶活性(32.67±10.27 U/mL)顯著高于(P<0.05)單獨培養(yǎng)木霉(T only)(11.71±1.72 U/mL)或者單獨培養(yǎng)灰霉病菌(B only)(9.99±1.68 U/mL)所產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶活性。這表明灰霉病菌會誘導(dǎo)擬康寧木霉T-51產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶,特別是在T-51重寄生灰霉病菌菌落的過程中,幾丁質(zhì)酶活性顯著上升,這表明幾丁質(zhì)酶可能在木霉的重寄生過程中起著重要的作用。

圖1 擬康寧木霉T-51在Bc-PDB與PDB中產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶活性Fig.1 Chitinase activity of Trichoderma koningiopsis T-51 in Bc-PDB and PDB

圖2 擬康寧木霉T-51與灰霉病菌對峙培養(yǎng)時產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶活性Fig.2 Chitinase activity in dual culture of Trichoderma koningiopsis T-51 and Botrytis on PDA

2.2 擬康寧木霉T-51幾丁質(zhì)酶基因的克隆及序列分析

通過P1-F/R引物的擴增兩株擬康寧木霉T-51的基因組DNA得到1 400 bp左右的條帶,如圖3a。該目的條帶測序結(jié)果得到1 470 bp的序列。這段序列經(jīng)過NCBI中比對,發(fā)現(xiàn)與許多木霉屬其他種的內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因有很高的同源性,其中與其近緣種康寧木霉T.koningii中編碼42 kDa內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因的核苷酸序列同源性達到97%,因此將這個基因命名為Tkchit42。然后根據(jù)這段序列設(shè)計了特異性引物進行末端序列的克隆。通過對cDNA的巢式PCR分別擴增5′端(圖3b)和3′端(圖3c),均得到約600 bp的條帶。測序后的序列使用DNAMAN軟件進行拼接得到了該基因的全長序列。Tkchit42基因序列在GenBank中的登錄號為KU140672。

圖3 Tkchit42基因的PCR及RACE擴增電泳圖Fig.3 Amplification of Tkchit42 by using PCR and RACE

序列分析的結(jié)果表明,該基因全長共1 817 bp(不含polyA),其中5′端非編碼區(qū)有135 bp,3′端非編碼區(qū)有212 bp。包含4個外顯子和3個內(nèi)含子,內(nèi)含子大小分別為57、70、68 bp。外顯子組成一個長1 275 bp的開放閱讀框,起始密碼子為ATG,終止密碼子為TAA(圖4),Tkchit42基因全長堿基組成:G+C=49.26%,A+T=50.74%。

圖4 Tkchit42基因全長結(jié)構(gòu)示意圖Fig.4 Structure of Tkchit42 gene

2.3Tkchit42基因編碼的氨基酸序列分析

Tkchit42基因編碼424個氨基酸(圖5),其中絲氨酸含量最高(10.82%),半胱氨酸含量最低(0.24%)。預(yù)測的蛋白總分子量為46.378 kDa,預(yù)測的等電點(pI)為5.16。氨基酸序列在NCBI上預(yù)測到內(nèi)切幾丁質(zhì)酶的保守結(jié)構(gòu)域,屬于GH18-幾丁質(zhì)酶超家族,有幾丁質(zhì)酶的活性位點。根據(jù)SignalP 4.0預(yù)測,在氨基酸序列前端存在信號肽,最可能的剪切位點是在27～28位:VAA-KD。使用Target P預(yù)測蛋白亞細胞器定位,預(yù)測結(jié)果表明該蛋白最有可能定位在胞外,是分泌蛋白。使用SWISS-MODEL在線預(yù)測了Tkchit42編碼的蛋白三維結(jié)構(gòu)的絲帶模型,如圖6。

2.4 同源性及分子進化分析

將Tkchit42編碼的氨基酸在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對發(fā)現(xiàn),其序列與多種木霉屬真菌中42 kDa內(nèi)切幾丁質(zhì)酶或幾丁質(zhì)酶基因的氨基酸序列相似性都達到85%以上,其中與T.koningii相似性達到99%(表2)。利用MEGA軟件建立Tkchit42編碼的氨基酸序列及其他木霉中的同源氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹,如圖7。

3 結(jié)論與討論

幾丁質(zhì)酶在木霉與寄主真菌互作的過程中十分重要,其中的β-N-乙酰氨基葡糖苷酶NAG1在木霉識別寄主真菌的過程中起到關(guān)鍵作用[14]。木霉與寄主真菌還未接觸的時候,木霉通過分泌少量的β-N-乙酰氨基葡糖苷酶來識別寄主真菌,當識別反應(yīng)成功后,便在短時間內(nèi)大量分泌幾丁質(zhì)酶來降解寄主真菌的細胞壁[15-16],降解寄主細胞壁后產(chǎn)生的小分子產(chǎn)物反饋給木霉后又能激活包括幾丁質(zhì)酶基因在內(nèi)的重寄生相關(guān)基因的表達上調(diào),進一步分泌更多的細胞壁水解酶類,最終導(dǎo)致寄主真菌細胞壁裂解,細胞死亡[17]。已有研究表明木霉的幾丁質(zhì)酶等細胞壁水解酶類的活性受到寄主真菌細胞壁的誘導(dǎo)[8],例如哈茨木霉產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶受到灰霉病菌細胞壁的誘導(dǎo)[18]。本文的研究結(jié)果表明擬康寧木霉T-51在PDB搖培中產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶的活性受到灰霉病菌的誘導(dǎo),在擬康寧木霉T-51對灰霉病菌對峙培養(yǎng)時的互作區(qū)幾丁質(zhì)酶活性也顯著升高,這意味著幾丁質(zhì)酶在T-51在對灰霉病菌的生物防治過程中可能起著重要作用。本實驗室前期的研究表明,擬康寧木霉T-51對番茄灰霉病有著很好的生防潛力,并且對多種其他植物病原真菌菌落有重寄生能力。因此有必要對擬康寧木霉中生防相關(guān)的分子機制進行深入的研究。

本研究首次克隆了擬康寧木霉中的一個幾丁質(zhì)酶基因Tkchit42。在木霉中存在多種幾丁質(zhì)酶,在重寄生的過程中起著不同的作用,這些幾丁質(zhì)酶在木霉不同的種之間都存在差異。目前報道木霉中的內(nèi)切幾丁質(zhì)酶的分子量主要為33、37 kDa以及42 kDa等[19],同源性分析表明Tkchit42的序列與編碼42 kDa的內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因的序列較為相近,根據(jù)本研究克隆的幾丁質(zhì)酶基因Tkchit42核酸序列預(yù)測其編碼蛋白的分子量為46 kDa。胡仕鳳等[15]通過比對分析17種木霉的42 kDa幾丁質(zhì)酶具有信號肽,序列為其N端的22個氨基酸殘基,序列通常為“MLGFLGKSVALLAALQATLTSA”,本研究中Tkchit42編碼的前22個氨基酸序列與之相同,而且Tkchit42也預(yù)測到了信號肽。

圖5 Tkchit42基因預(yù)測的開放閱讀框序列及氨基酸序列Fig.5 Predicted ORF and amino acid sequence of Tkchit42

圖6 Tkchit42編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)絲帶模型的預(yù)測Fig.6 The 3D structure prediction of the protein encoded by Tkchit42

圖7 基于Tkchit42推導(dǎo)的氨基酸序列與其他木霉幾丁質(zhì)酶氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹Fig.7 Phylogenetic tree of the predicted amino acid sequences of Tkchit42

GenBank登錄號GenBankaccessionnumber基因編碼產(chǎn)物Encodedproduct物種名Species氨基酸序列相似性/%Identityofaminoacidsequencegi|6630936|gb|AAF19612.1|42kDa內(nèi)切幾丁質(zhì)酶康寧木霉Trichodermakoningii99gi|226596953|gb|ACO72604.1|幾丁質(zhì)酶深綠木霉T.atroviride97gi|6630948|gb|AAF19618.1|42kDa內(nèi)切幾丁質(zhì)酶綠色木霉T.viride96gi|56967602|gb|AAW31950.1|42kDa內(nèi)切幾丁質(zhì)酶黃綠木霉T.aureoviride96gi|297573457|gb|ADI46579.1|CHI42幾丁質(zhì)酶棘胞木霉T.asperellum95gi|6630962|gb|AAF19625.1|42kDa內(nèi)切幾丁質(zhì)酶酒色木霉T.vinosum95gi|88191681|gb|ABD42921.1|內(nèi)切幾丁質(zhì)酶長枝木霉T.longibrachiatum94gi|74049056|gb|AAZ95174.1|內(nèi)切幾丁質(zhì)酶哈茨木霉T.harzianum94gi|2738109|gb|AAC60385.1|內(nèi)切幾丁質(zhì)酶鉤狀木霉T.hamatum94gi|294992331|gb|ADF57309.1|幾丁質(zhì)酶chi18-5加納木霉T.ghanense85gi|13516885|dbj|BAB40594.1|內(nèi)切幾丁質(zhì)酶假康寧木霉T.pseudokoningii85gi|13516873|dbj|BAB40588.1|內(nèi)切幾丁質(zhì)酶e-G2綠木霉T.virens85gi|294992333|gb|ADF57310.1|幾丁質(zhì)酶chi18-5橘綠木霉T.citrinoviride84gi|589112229|ref|XP_006968137.1|幾丁質(zhì)酶里氏木霉T.reesei83gi|284451278|gb|ADB89220.1|42kDa內(nèi)切幾丁質(zhì)酶土星孢木霉T.saturnisporum81gi|317134350|gb|ADV02751.1|幾丁質(zhì)酶粉紅單端孢霉Trichotheciumroseum71

幾丁質(zhì)酶有著廣泛的應(yīng)用前景。幾丁質(zhì)被幾丁質(zhì)酶降解后的產(chǎn)物(幾丁寡糖、殼聚糖和N-乙酰氨基葡萄糖)具有抗菌及抗腫瘤等活性[20]。木霉中的幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入水稻[21]、煙草[8]、蘋果[8]、棉花[22]等植物,能夠誘導(dǎo)植物對一些病原真菌產(chǎn)生抗性。哈茨木霉產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶粗提物能夠抑制灰霉病菌菌絲生長和孢子萌發(fā),并且抑制番茄灰霉病的發(fā)生[23]。本研究結(jié)果表明擬康寧木霉T-51產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶可能在生防過程中起著重要的作用,因此將來有必要對擬康寧木霉T-51的幾丁質(zhì)酶等生防相關(guān)的酶類進行更深入的研究,探究其在灰霉病防治中的作用。

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(責(zé)任編輯：田 喆)

Chitinase activity and endo-chitinase gene cloning and sequence analysis ofTrichodermakoningiopsisT-51

You Jiaqi, Li Guoqing

(KeyLaboratoryofCropDiseaseMonitoring&SafetyControlofHubeiProvince,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan430070,China)

TrichodermakoningiopsisT-51 is a potential biological control agent againstBotrytiscinerea. In this study, chitinase activity of T-51 was significantly induced byB.cinereain both liquid PDB medium and the interacting area withB.cinereacolony on PDA medium. An endo-chitinase geneTkchit42 was cloned fromT.koningiopsisT-51. The full length ofTkchit42 was 1 817 bp, encoding an endo-chitinase protein containing 424 amino acid residues. The predicted protein molecular weight was 46.378 kDa. TheTkchit42 amino acid sequence BLAST showed 99% similarity with that of a 42 kDa endo-chitinase ofT.koningii. For our knowledge, this is the first report of chitinase gene cloned fromT.koningiopsis.

chitinase;Trichodermakoningiopsis; gene cloning; sequence analysis

研究報告ResearchReports

2016-08-17

2016-12-19

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201303025)

S 476

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.04.004

* 通信作者 E-mail: guoqingli@mail.hzau.edu.cn