HPLC法測定骨碎補及其習用品中柚皮苷的含量

朱常成 尹子麗

1.昆藥集團股份有限公司，云南 昆明 650100；2.云南中醫(yī)學院民族醫(yī)藥學院，云南 昆明 650500

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HPLC法測定骨碎補及其習用品中柚皮苷的含量

朱常成1尹子麗2*

1.昆藥集團股份有限公司，云南 昆明 650100；2.云南中醫(yī)學院民族醫(yī)藥學院，云南 昆明 650500

目的：采用HPLC方法以柚皮苷為指標，對骨碎補及其習用品進行柚皮苷含量測定。方法：色譜柱C18(4.6mm×250mm，5μm)；流動相：乙腈-0.088%甲酸水溶液(23.3∶76.7)；流速：0.9mL/min；溫度：30℃；檢測波長283nm。結果：柚皮苷線性關系良好，精密度、重復性、穩(wěn)定性的RSD都低于2%；骨碎補及其習用品的柚皮苷含量差異較大，最高可達6.114mg/g，最低為0.464mg/g，少數習用品中不含柚皮苷。結論：該方法簡便、準確可靠、重復性好，可作為骨碎補及其習用品藥材質量控制的進一步補充。

骨碎補及其習用品；HPL法；含量測定；柚皮苷

骨碎補(RhizomaDrynariae)為我國常用中藥，入藥歷史久遠，具有補腎強骨、續(xù)傷止痛等功效，臨床用于腎虛腰痛、耳鳴耳聾、筋骨傷折等癥的治療，主要分布于云南、四川、廣西、福建和浙江等地[1-2]。2015年版《中國藥典》收載骨碎補為水龍骨科槲蕨Drynariafortune(Kunze) J.Sm. 的干燥根莖，而歷代本草和文獻記載骨碎補習用品有來源于3個科6個屬的10余種藥用植物。柚皮苷是骨碎補的主要活性成分，筆者通過測定骨碎補及其習用品中柚皮苷含量，旨在為骨碎補藥材的資源合理開發(fā)與利用提供科學依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LC-2010AHT高效液相色譜儀(日本島津)；AL204電子天平(梅特勒一托利多儀器(上海)有限公司)；WFZ-UV-2450型紫外分光光度計(日本島津)；超聲儀(上海冠特超聲儀器有限公司)。

1.2 材料 甲醇為色譜純，水為雙重蒸餾水，其他試劑均為分析純。柚皮苷對照品購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院(純度≥98%)；骨碎補及其習用品的樣品主要采自云南省各個分布區(qū)，材料均由經云南大學陸樹剛教授鑒定。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Kromat Universil C18(4.6mm×250mm，5μm)；流動相為乙腈-0.088%甲酸水溶液(23.3∶76.7)；流速：0.9mL/min；檢測波長為最大吸收波長283nm；溫度：30 ℃。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取柚皮苷照品適量，加甲醇溶解制成每mL含柚皮苷0.301mg對照品溶液。2.3 骨碎補類藥材供試品的制備 分別取骨碎補及其習用品藥材，粉碎，取約2g精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇 20mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250W，頻率33kHz) 30min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，濾液水浴揮發(fā)濃縮至約1mL，用甲醇定容至2mL，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液。

2.4 方法學實驗

2.4.1 標準曲線的制作 取柚皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并定量稀釋制成每1mL含0.6mg的溶液，作為對照品儲備液，分別精密移取對照品儲備液2.5、4、5、6、7.5mL置10 mL量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為線性溶液。精密量取各線性溶液10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。由濃度C對峰面積A進行線性回歸，結果線性方程為：y=0.1681x-2.33，R2=0.9993。結果表明，柚皮苷在1.53μg～4.59μg內線性良好。

2.4.2 穩(wěn)定性實驗 精密吸取柚皮苷對照品按上述相同條件測定，分別在0、1、2、4、8、12、24h進樣10 μL，測定柚皮苷峰面積，RSD為0.56%，表明柚皮苷24h內穩(wěn)定性良好。

2.4.3 精密度實驗 取線性關系項下柚皮苷對照品溶液，按上述相同測定條件，連續(xù)進樣6次，進樣體積為10μL，測定結果RSD為0.57%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 重復性 取同一批骨碎補習用品圓蓋陰石蕨藥材6份，按供試品制備方法制備，測定含量，測得重復性6份RSD值為1.34%，小于2%，表明該方法重復性良好。

2.4.5 中間精密度 另一名實驗人員，在不同日期，采用不同儀器及色譜柱對同一批次骨碎補進行含量測定，2人12次測定結果的RSD值為1.14%，小于2%，表明本法精密度良好。

2.5 加樣回收率 精密稱取已知含量的樣品約1g(稱取9份)，分別按柚皮苷含量的50%、100%、150%的量加入各柚皮苷對照品(每一濃度平行制備3份)，按供試品溶液制備方法制備加樣回收率樣品。分別精密量取10μL進樣，計算測得量和回收率。要求回收率在95.0%～105.0%之間，以證實方法具有良好的準確度。9份回收率均在95%～105%之間。RSD值小于2%，符合要求，本法準確度良好。見表1。

表1 加樣回收率實驗結果

2.6 耐用性 為考察色譜條件發(fā)生微小變動時，對柚皮苷含量測定的影響。通過改變流動相流速、柱溫、流動相比例及甲酸濃度的微小變化，來考察測定結果不受影響的程度。當色譜條件發(fā)生微小變動時，對含量測定無影響，說明本法精密度好、準確度高，可用于骨碎補中柚皮苷的含量測定。見表2

表2 耐用性實驗結果

2.7 樣品含量測定 取骨碎補及其習用品不同樣品，按確定的供試品溶液制備方法依法制備，分別精密吸取供試品及對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定柚皮苷的含量。表明所測定的10種樣品中，柚皮苷含量差異較大。見表3。

3 討論

研究采用高效液相色譜法測定骨碎補及其習用品藥材中柚皮苷的含量，對10個不同地區(qū)骨碎補及其習用品進行測定，測定結果表明：柚皮苷含量差異很大，最高是川滇槲蕨為6.114mg/g，最低是膜葉星蕨為0.464mg/g，其中光亮瘤蕨、中華槲蕨、大葉骨碎補及硬葉槲蕨4個習用品藥材中中不含柚皮苷。骨碎補習用品種較多，化學成分種類較多。目前認為柚皮苷為骨碎補主要的活血化瘀成分，但是否為唯一有效成分，能否代表骨碎補入藥，富含柚皮苷的蕓香科植物是否有此藥用功效，由此否定骨碎補習用品入藥是否合理值得進一步從成分與藥效結合研究后再作評價。

表3 骨碎補及其習用品中柚皮苷含量測定結果

[1]明·李時珍．本草綱目草部第二十卷-骨碎補(校點本，上冊)[M]．北京：人民衛(wèi)生出版社，1982：1384.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：256.

朱常成(1981-)，男，漢族，工程師，研究方向為新藥研發(fā)。E-mail:chng810915@sina.com

尹子麗(1982-)，女，白族，實驗師，研究方向為中藥資源開發(fā)與利用。E-mail:zccyzl197974@126.com

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1007-8517(2017)14-0020-02

2017-05-13 編輯：陶希睿)