兒茶素EGCG對(duì)Caco—2細(xì)胞α—葡萄糖苷酶活性的抑制作用研究

劉淑媛++艾仄宜++陳玉瓊++倪德江

摘要：試驗(yàn)對(duì)Caco-2細(xì)胞膜上蔗糖酶和麥芽糖酶這兩種α-葡萄糖苷酶活性進(jìn)行不同培養(yǎng)時(shí)間檢測(cè)，并以兒茶素單體EGCG作為抑制劑，探究其對(duì)Caco-2來源的蔗糖酶和麥芽糖酶的抑制效果。結(jié)果表明，Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)18 d后膜表面具有較高活性的蔗糖酶和麥芽糖酶，可用于進(jìn)行α-葡萄糖苷酶抑制劑篩選。兒茶素EGCG具有蔗糖酶和麥芽糖酶抑制活性，抑制IC50分別為31.08 μg/mL和36.44 μg/mL。

關(guān)鍵詞：茶；EGCG；蔗糖酶；麥芽糖酶；Caco-2細(xì)胞

中圖分類號(hào)：S571.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）13-2479-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.13.020

Alpha-glucosidase Inhibitory Activity of EGCG in Caco-2 Cells

LIU Shu-yuan， AI Ze-yi， CHEN Yu-qiong， NI De-jiang

（Key Laboratory of Horticultural Plant Biology， Ministry of Education/College of Horticulture and Forestry Sciences，

Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China）

Abstract： This research used the Caco-2 cell monolayer model in vitro to simulate the α-glucosidase activity at different culture days. EGCG was used as an inhibitor to investigate the inhibition activities on sucrase and maltase in Caco-2 cells. The results illustrated that Caco-2 could be used to estimate α-glucosidase inhibitory activity after 18 days with high sucrase and maltase activities. EGCG showed inhibitory effect on sucrase and maltase in Caco-2 cells， with the IC50 values of 31.08 μg/mL and 36.44 μg/mL， respectively.

Key words： tea； EGCG； sucrase； maltase； Caco-2

茶作為世界上三大飲品之一，其抗癌、抗氧化、降血糖、降血脂等健康功效已得到廣泛證實(shí)[1-4]。兒茶素被認(rèn)為是茶發(fā)揮其健康功效的主要成分。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）是茶葉中兒茶素的重要單體，占兒茶素總量的約80%。已有大量文獻(xiàn)以兒茶素EGCG為研究對(duì)象，研究其在細(xì)胞上抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、保護(hù)細(xì)胞膜損傷、信號(hào)通道等作用機(jī)理[5-7]。

α-葡萄糖苷酶在碳水化合物消化吸收方面發(fā)揮重要作用，是Ⅱ型糖尿病治療的靶點(diǎn)之一。本茶生理生化課題組實(shí)驗(yàn)室前期體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)EGCG是茶葉中對(duì)α-葡萄糖苷酶起抑制作用的主要成分，其抑制IC50僅為0.059 mmol/L，遠(yuǎn)小于陽性對(duì)照阿卡波糖（阿卡波糖IC50為7.19 mmol/L）[8]。Matsumoto等[9]利用大鼠體內(nèi)試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)兒茶素短時(shí)間（提前30 min）灌胃Wistar大鼠，可降低大鼠小腸上皮黏膜蔗糖酶活性。人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系Caco-2模型具有與人小腸上皮細(xì)胞相似的糖消化、吸收和葡萄糖異生相關(guān)的酶，可應(yīng)用于α-葡萄糖苷酶抑制劑的篩選[10，11]。為此，試驗(yàn)采用Caco-2模型，分析兒茶素EGCG對(duì)蔗糖酶和麥芽糖酶這兩種α-葡萄糖苷酶的抑制效果，以期為兒茶素抑制餐后血糖升高，減緩糖尿病癥狀提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

Caco-2細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所；EGCG購自Sigma公司（E4143，純度 >95%）；DMEM培養(yǎng)液、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、青霉素/鏈霉素及胰蛋白酶（含0.02% EDTA）均購自美國Hyclone公司；支原體抗生素Plasmocin購自Invivogen公司；cck-8試劑盒和葡萄糖測(cè)定試劑盒購自南京建成生物科技發(fā)展有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶以及24孔細(xì)胞培養(yǎng)板購自美國Corning公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于24孔板，接種密度為4 000個(gè)/cm2，于37 ℃、含5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用DMEM培養(yǎng)液（含10%胎牛血清，1%非必需氨基酸，1%青霉素/鏈霉素，1%的L-谷氨酰胺，0.25 mg支原體抗生素plasmocin）培養(yǎng)細(xì)胞，隔天換液。

1.3 兒茶素EGCG對(duì)Caco-2細(xì)胞增殖的影響

采用cck-8法評(píng)價(jià)200 μmol/L濃度范圍內(nèi)EGCG對(duì)Caco-2細(xì)胞增殖的影響。細(xì)胞接種于96孔板，接種密度為104個(gè)/cm2，于37 ℃、含5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。棄去舊培養(yǎng)基，分別加入含10、30、50、100、200 μmol/L EGCG的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。加入10 μL cck-8試劑，37 ℃孵育1 h后450 nm處測(cè)OD值。用細(xì)胞存活率來衡量EGCG在Caco-2細(xì)胞模型上的安全負(fù)載量。

1.4 Caco-2細(xì)胞中α-葡萄糖苷酶活性檢測(cè)

Caco-2細(xì)胞接種后分別于14、16、18、20、22和24 d檢測(cè)細(xì)胞上蔗糖酶和麥芽糖酶活性。蔗糖、麥芽糖溶液均為28 mmol/L，用磷酸緩沖溶液（PBS，pH 7.4）溶解，過0.22 μmol/L膜抽濾滅菌，37 ℃預(yù)熱待用。Caco-2細(xì)胞棄去舊的培養(yǎng)液，用37 ℃預(yù)熱的PBS緩沖溶液清洗細(xì)胞表面3次。每孔加入1 mL蔗糖/麥芽糖溶液，37 ℃孵育40 min，冰浴結(jié)束反應(yīng)。根據(jù)葡萄糖測(cè)定試劑盒方法檢測(cè)產(chǎn)物葡萄糖含量。

1.5 兒茶素EGCG對(duì)Caco-2細(xì)胞上α-葡萄糖苷酶活力的影響

Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)至21 d，棄去舊的培養(yǎng)液，用37 ℃預(yù)熱的PBS緩沖溶液清洗細(xì)胞表面3次，加入1 mL含不同濃度EGCG的蔗糖/麥芽糖溶液（28 mmol/L，PBS溶解），37 ℃孵育40 min。冰浴結(jié)束反應(yīng)。陰性測(cè)定組加入1 mL蔗糖/麥芽糖溶液（28 mmol/L），空白組加入1 mL PBS緩沖溶液。根據(jù)葡萄糖測(cè)定試劑盒方法檢測(cè)產(chǎn)物葡萄糖含量。根據(jù)下面公式計(jì)算抑制率：

抑制率=[（OD陰性對(duì)照組-OD樣品測(cè)定組）/（OD陰性對(duì)照組-OD空白）]×100%

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 兒茶素EGCG毒理

不同濃度兒茶素EGCG孵育Caco-2細(xì)胞24 h細(xì)胞活力見圖1。從圖1可以看出，兒茶素EGCG在濃度達(dá)200 μmol/L濃度時(shí)，細(xì)胞存活率仍大于80%。在此濃度范圍內(nèi)對(duì)Caco-細(xì)胞增殖無明顯影響，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 不同培養(yǎng)時(shí)間Caco-2上蔗糖酶和麥芽糖酶變化

Caco-2細(xì)胞接種24孔板，約7 d后細(xì)胞融合，開始分化。從圖2和圖3可以看出，細(xì)胞膜表面酶活性隨細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。蔗糖酶活性在細(xì)胞培養(yǎng)14～18 d之間活性變化平穩(wěn)，且酶活性較低。18 d后蔗糖酶活性逐漸增強(qiáng)，至培養(yǎng)24 d時(shí)，蔗糖酶活性仍保持上升趨勢(shì)。麥芽糖酶活性自細(xì)胞培養(yǎng)16 d時(shí)逐漸增強(qiáng)，培養(yǎng)24 d后仍保持上升趨勢(shì)。蔗糖酶和麥芽糖酶活性在20～22 d之間均變化平穩(wěn)，故細(xì)胞培養(yǎng)21 d用于兒茶素EGCG對(duì)此兩種酶活性的抑制試驗(yàn)。

2.3 兒茶素EGCG對(duì)Caco-2細(xì)胞上蔗糖酶和麥芽糖酶的抑制作用

從圖4可以看出，兒茶素EGCG對(duì)Caco-2細(xì)胞上蔗糖酶和麥芽糖酶均有抑制效果，且抑制作用隨濃度的增大而增強(qiáng)。當(dāng)EGCG濃度超過一定范圍后對(duì)蔗糖酶和麥芽糖酶抑制活性的增強(qiáng)都減弱。EGCG對(duì)蔗糖酶和麥芽糖酶抑制IC50分別為31.08 μg/mL和36.44 μg/mL。EGCG對(duì)蔗糖酶的抑制效果要略強(qiáng)于麥芽糖酶。然而，在低濃度（10 μmol/L）情況下，兒茶素EGCG對(duì)麥芽糖酶抑制率高于蔗糖酶。

3 小結(jié)與討論

α-葡萄糖苷酶是一類能夠催化水解葡萄糖基的酶的總稱。α-葡萄糖苷酶抑制劑可抑制小腸內(nèi)α-葡萄糖苷酶的活性，延緩或抑制葡萄糖在腸道的吸收，從而有效降低餐后高血糖。中國人飲食結(jié)構(gòu)主要是淀粉，麥芽糖酶和蔗糖酶在食物消化成可被吸收的單糖過程中發(fā)揮主要作用。Caco-2細(xì)胞來源于人結(jié)腸腺癌細(xì)胞，體外培養(yǎng)時(shí)能自發(fā)地進(jìn)行類似腸道細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和生化學(xué)上的分化，獲得許多小腸吸收細(xì)胞的特性。Caco-2細(xì)胞不同培養(yǎng)天數(shù)后蔗糖酶和麥芽糖酶活性檢測(cè)結(jié)果表明，培養(yǎng)18 d后具有該細(xì)胞較高的蔗糖酶和麥芽糖酶活性，可用于研究藥物對(duì)Caco-2細(xì)胞來源的蔗糖酶和麥芽糖酶活性的研究。Caco-2細(xì)胞孵育麥芽糖較孵育蔗糖時(shí)酶解產(chǎn)物葡萄糖含量高，說明Caco-2細(xì)胞上麥芽糖酶活性高于蔗糖酶。兒茶素EGCG對(duì)Caco-2來源的兩種α-葡萄糖苷酶均有抑制作用，且抑制作用有劑量依賴性。Xu等[12]對(duì)多種兒茶素單體體外α-葡萄糖苷酶活性比較得出，EGCG具有最強(qiáng)α-葡萄糖苷酶抑制活性，抑制類型為混合型抑制。Kamiyama等[13]對(duì)兒茶素小腸來源α-葡萄糖苷酶抑制研究發(fā)現(xiàn)，EGCG對(duì)麥芽糖酶的抑制活性遠(yuǎn)強(qiáng)于抑制蔗糖酶的活性，其抑制IC50分別為16 μmol/L和 130 μmol/L。在本試驗(yàn)中EGCG抑制蔗糖酶活性略強(qiáng)于抑制麥芽糖酶活性。不同的結(jié)論與試驗(yàn)所用的α-葡萄糖苷酶來源有極大相關(guān)性。EGCG在濃度為10 μmol/L時(shí)對(duì)麥芽糖酶的抑制率即接近于40%。EGCG與蔗糖酶和麥芽糖酶的結(jié)合特性還有待進(jìn)一步研究。

兒茶素因其生物利用度低，在實(shí)際應(yīng)用中受到極大限制。小鼠口服兒茶素[3H]-EGCG 1 h后，胃部存留率為30.7%，小腸部位存留率40.6%，之后大部分兒茶素隨糞便、尿液排出體外，血液中[3H]-EGCG含量在24 h時(shí)約2%[14]。人體空腹口服EGCG含量高達(dá)800 mg/mL時(shí)，約2 h血液中EGCG含量達(dá)到峰值，最高濃度僅為1.6 mg/mL[15]?？梢娍诜翰杷睾?，在體內(nèi)主要作用部位為小腸細(xì)胞。藥物在小腸部位降血糖機(jī)理涉及鈉葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)載體（SGLT1）、葡萄糖協(xié)助擴(kuò)散轉(zhuǎn)運(yùn)載體（GLUT2）、為SGLT1提供動(dòng)力的Na+-K+-ATP酶及水解產(chǎn)生葡萄糖的α-葡萄糖苷酶。兒茶素抑制糖轉(zhuǎn)運(yùn)體和Na+-K+-ATP酶功效亦有相關(guān)報(bào)道[16-18]。然而，兒茶素在小腸的部位不同，降低糖吸收途徑的抑制效果的貢獻(xiàn)率，及多種途徑間是否有協(xié)同作用仍有待研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] KURODA Y，HARA Y. Antimutagenic and anticarcinogenic activity of tea polyphenols[J].Mutat Res-Rev Mutat，1999，436（1）：69-97.

[2] PANDEY K B，RIZVI S I. Upregulation of erythrocyte ascorbate free radical reductase by tea catechins： Correlation with their antioxidant properties[J]. Food Res Inter，2012，46（1）：46-49.

[3] HOSODA K，WANG M F，LIAO M L，et al. Antihyperglycemic effect of oolong tea in type 2 diabete[J]. Diabetes Care，2003， 26（6）：1714-1718.

[4] JIN D，XU Y，MEI X，et al. Antiobesity and lipid lowering effects of theaflavins on high-fat diet induced obese rats[J]. J Funct Foods，2013，5（5）：1142-1150.

[5] JUNG Y D，KIM S，SHIN B A，et al. EGCG， a major component of green tea， inhibits tumour growth by inhibiting VEGF induction in human colon carcinoma cells[J]. Brit J Cancer， 2001，84（6）：844-850.

[6] HWANG J T，HA J，PARK I J，et al. Apoptotic effect of EGCG in HT-29 colon cancer cells via AMPK signal pathway[J]. Cancer Letters，2007，247（1）：115-121.

[7] SAFFARI Y，SADRZADEH S M H. Green tea metabolite EGCG protects membranes against oxidative damage in vitro[J]. Life Sci，2004，74（12）：1513-1518.

[8] LIU S Y，YU Z，ZHU H K，et al. In vitro α-glucosidase inhibitory activity of isolated fractions from water extract of Qingzhuan dark tea[J]. BMC Complement Altern Med，2016， 16（1）：378.

[9] MATSUMOTO N，ISHIGAKI F，ISHIGAKI A，et al. Reduction of blood glucose levels by tea catechin[J]. Biosci Biotechnol Biochem，1993，57（4）：525-527.

[10] 張海鳳，董亞琳，張 琰，等.利用Caco-2細(xì)胞模型研究五倍子水提物的降糖機(jī)制[J].華西藥學(xué)雜志，2011，26（5）：447-450.

[11] HANSAWASDI C，KAWABATA J. Alpha-glucosidase inhibitory effect of mulberry （Morus alba） leaves on Caco-2[J]. Fitoterapia，2006，77（7）：568-573.

[12] XU Y，ZHANG Z，LI L，et al. Catechins play key role in green tea extract-induced postprandial hypoglycemic potential in vitro[J]. Eur Food Res Technol，2013，237（2）：89-99.

[13] KAMIYAMA O，SANAE F，IKEDA K，et al. In vitro inhibition of α-glucosidases and glycogen phosphorylase by catechin gallates in green tea[J]. Food Chem，2010，122（4）：1061-1066.

[14] SUGANUMA M. Wide distribution of[3H]（-）-epigallocatechin gallate，a cancer preventive tea polyphenol，in mouse tissue.[J]. Carcinogenesis，1998，19（10）：1771-1776.

[15] CHOW H H，HAKIM I A，VINING D R，et al. Effects of dosing condition on the oral bioavailability of green tea catechins after single-dose administration of polyphenon E in healthy individuals[J]. Clin Cancer Res，2005，11（12）：4627-4633.

[16] SHIMIZU M，KOBAYASHI Y，SUZUKI M， et al. Regulation of intestinal glucose transport by tea catechins[J]. BioFactors， 2000，13（1-4）：61-65.

[17] SAGNELLA G A，MACGREGOR G A. Characteristics of a （Na+-K+）-ATPase inhibitor in extracts of tea[J]. Am J Clin Nutr，1984，40（1）：36-41.

[18] KREYDIYYEH S I，BAYDOUN A H，CHURUKIAN Z M. Tea extract inhibits intestinal absorption of glucose and sodium in rats[J]. Comp Biochem Physiol C Pharmacol Toxicol Endocrinol，1994，108（3）：359-365.